草莓炭疽病病原鑒定及拮抗菌株篩選

楊洪俊 張旭 陳佳佳 孫朋朋 張石林 王鈞銘 王媛花 顏志明

摘要：草莓炭疽病是近幾年草莓生產中的主要病害之一，危害性大、毀滅性強。為明確江蘇省鎮江市丹徒區草莓炭疽病病原菌種類，并篩選對其有效的拮抗菌株，從丹徒區草莓露天苗圃采集炭疽病發病植株，采用組織分離法對病原真菌進行分離，通過致病性測定，結合形態學和分子生物學準確鑒定其種類，并以此為靶標病原菌，通過平板對峙法篩選拮抗菌株。 結果表明，從草莓植株發病部位共分離獲得11株暹羅炭疽菌（Colletotrichum siamense），其中，從根部分離得到2株（D13、D19）、莖部4株（D1、D2、D11、D12）、葉部5株（D8、D9、D10、D20、D21）。經柯赫氏法則驗證，C. siamense 為草莓炭疽病病原真菌，其中D8和D19這2株C. siamense致病性較強。從健康草莓植株內分離獲得29株內生真菌，以D8和D19作為指示菌，通過平板對峙試驗篩選出5株拮抗效果較好的生防菌株，分別為Z72、Z79、Z52、Z107和Z101，其抑菌率均達到了60%以上，其中Z72對D8和D19的抑菌率分別達到了74.07%、79.82%。經鑒定，這5株拮抗菌均為木霉屬真菌（Trichoderma spp.）。暹羅炭疽菌為丹徒區草莓炭疽病主要病原菌，具有較強的致病性，草莓內生真菌可為草莓炭疽病微生物防治提供重要資源。

關鍵詞：草莓炭疽??；病原真菌；分離鑒定；致病性；拮抗菌

中圖分類號：S436.68+4? 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）03-0147-06

我國是世界上最大的草莓生產國，草莓種植面積占比全球近1/3。草莓生產具有周期短、見效快、效益高、果品無公害等特點。隨著我國經濟的發展以及人們生活水平的提高，市場上對草莓的需求量變大，也吸引越來越多的人種植草莓。而草莓炭疽病是草莓生產過程中的主要病害之一［1-2］。1931年Brooks首次報道草莓炭疽病，該病主要危害草莓的匍匐莖、葉柄、根冠、花及果實等［3］。尤其是密閉的草莓棚及高溫高濕環境等利于草莓炭疽病的發生，導致草莓減產25%～30%，在草莓育苗期和定植初期，發病率有時高達80%，嚴重時造成草莓苗大面積凋萎枯死，嚴重影響草莓的產量和品質［4］。

目前，除種植一些高抗品種外，草莓炭疽病仍以化學藥劑防治為主，但隨著病原菌抗藥性的不斷增強，殺菌劑防治炭疽菌的效果都不太理想且易污染環境，不利于我國綠色農業的可持續性發展［5］。目前生物防治技術是國際上競相開發的新技術，因其綠色、安全等特點，越來越為人們所關注［6-7］，其作用機制包括誘導抗性、拮抗、競爭、重寄生、促生等?，F階段雖有一些菌株被用于防治草莓炭疽病，但高效的生防資源依然不足，更多有拮抗效果的菌劑產品及其應用技術亟待開發。

本研究通過采集鎮江市丹徒區草莓產區草莓炭疽病病株，并對病原真菌進行分離培養，結合形態學和分子生物學準確鑒定其種類，初步明確了鎮江市丹徒區草莓炭疽病病原真菌類型。同時，為了篩選拮抗草莓炭疽病的生防菌株，選擇29株內生真菌菌株進行平板對峙試驗，以期為草莓炭疽病的生物防治提供優質的菌種資源。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

發病草莓植株于2022年6月采自江蘇省鎮江市丹徒區草莓露天苗圃，草莓品種為紅顏。拮抗菌株是筆者所在實驗室前期分離自健康草莓植株內的內生真菌，包括ZJ5、ZJ6、ZJ7、ZJ8、ZJ11、ZJ14、ZJ17、ZJ28、ZJ33、ZJ36、ZJ41、ZJ42、ZJ45、ZJ47、ZJ49、ZJ51、ZJ52、ZJ63、ZJ66、ZJ72、ZJ75、ZJ77、ZJ79、ZJ81、ZJ93、ZJ95、ZJ99、ZJ101和ZJ107，共29株。

1.2 試驗方法

1.2.1 草莓炭疽病病原真菌分離、純化 采用組織分離法分離草莓病株上的病原真菌［8-10］。在無菌操作條件下，用剪刀剪取發病植株病健交界處的組織（約5 mm×5 mm），先放入75%乙醇中浸泡30 s，再用2%次氯酸鈉浸泡2 min，最后使用無菌水連續漂洗3次，用滅菌濾紙片吸干表面水分后，用無菌操作法將病組織小塊移至PDA培養基上培養，每皿放置5塊組織塊，用封口膜封口，于25 ℃恒溫箱中培養3～5 d。待發病組織長出菌絲后，用無菌操作法挑取菌落邊緣菌絲連同培養基轉移至新的PDA平板上，進一步純化培養。觀察菌落的生長情況，挑取菌落邊緣的菌絲制成玻片，在顯微鏡下觀察是否為單一菌落，如果觀察到的是單一菌落則獲得純培養，若菌落不單一，則需要重復此步驟，直至獲得純培養。

1.2.2 病原真菌鑒定

形態學鑒定：用PDA培養基于25 ℃恒溫培養箱中培養草莓炭疽病病原真菌5～7 d，逐日觀察菌落形狀、大小和顏色等。并挑取邊緣菌絲制成臨時玻片，用顯微鏡觀察其菌絲、分生孢子等形態特征，初步確定病原真菌種類。

分子鑒定：待病原真菌長滿培養皿后，刮取表面菌絲加入液氮充分研磨，按照DNAsecure新型植物基因組DNA提取試劑盒（TIANGEN DNAsecure Plant Kit）操作說明來提取病原真菌基因組DNA，并將DNA產物放于-20 ℃保存，以防DNA降解。

采取通用引物ITS1和ITS4對真菌ITS區域進行PCR擴增。30 μL擴增體系包括：15 μL 2×Easy Taq PCR SuperMix （+dye），1 μL正向引物（5 μmol/L），1 μL反向引物（5 μmol/L），1 μL模板DNA溶液和12 μL無菌水。PCR擴增反應條件：預變性94 ℃ 5 min；變性94 ℃ 30 s，退火56 ℃ 45 s，延伸72 ℃ 1 min，共35個循環；72 ℃繼續延伸 10 min。對于鐮孢菌屬物種，筆者擴增了翻譯延伸因子EF-1α區域進行確認，對于炭疽菌屬物種，筆者分別擴增了鈣調蛋白基因（calmodulin，CAL）、3-磷酸甘油醛脫氫酶基因（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）、幾丁質合成酶A基因（chitin synthase 1，CHS-1）、肌動蛋白基因（actin，ACT）和β-微管蛋白基因（beta-tubulin，TUB）進行確認［11-14］（表1）。對PCR產物進行擴增測序，并與NCBI數據庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）進行BLAST比對，以確定病原真菌種類。

1.2.3 致病性測定

采用創傷接種法進行致病性測定，先用草莓組培苗接種所有分離到的真菌菌株，后根據發病情況在草莓葉片接種病原真菌。首先，準備2個滅菌托盤，各鋪上2層無菌紗布并用無菌水濕潤。選擇長勢一致、健康的草莓組培苗，用75%乙醇進行表面消毒，用滅菌接種針輕刺組培苗，切取在25 ℃下培養3 d的炭疽菌菌絲塊（約 3 mm2），用無菌接種針將菌絲塊貼在創口處，用無菌濕潤吸水紙包裹，外面再用無菌錫箔紙包緊，放置在一個托盤中，另一個托盤中的草莓在創口處貼一塊空白PDA培養基（約3 mm2）為對照，設3個重復。用保鮮膜密封，放在25 ℃下進行培養，觀察發病情況。

葉片接種法為選取新鮮完整的健康草莓葉片，清洗，用75%乙醇表面消毒后放置在滅過菌的托盤中，底層鋪上無菌水潤濕的無菌紗布來保濕。用滅菌的接種針在草莓葉片兩邊各輕扎幾下以造成創傷，便于病原菌侵入。切取在25 ℃培養3 d的炭疽菌菌絲塊（約3 mm2），用無菌接種針放置在葉片兩邊的傷口上，以接種空白PDA培養基（約3 mm2）為對照，最后用無菌水浸濕過的脫脂棉保濕，并設置3組重復，托盤用保鮮膜密封，置于25 ℃恒溫箱中培養，觀察發病情況。

1.2.4 拮抗菌株的篩選

1.2.4.1 拮抗菌的初篩

采用PDA平板對峙法進行初篩：用直徑5 mm的打孔器在培養5 d后的炭疽病原真菌菌落邊緣打孔，并將菌餅接入直徑為9 cm的PDA培養基一端，菌絲面與培養基接觸。同樣操作將拮抗菌用打孔器打孔后，菌餅（直徑5 mm）接入培養基另一端，2個菌餅間相距4 cm。以將草莓炭疽病原真菌菌餅單獨接入空白PDA平板作為對照，放入25 ℃恒溫箱中培養。5 d后測量病原真菌菌落半徑，篩選出有抑制效果的拮抗菌株進行復篩。

1.2.4.2 拮抗菌的復篩

將篩選出的拮抗菌株重復上述操作，即在直徑為9 cm含有15 mL PDA培養基的平板距離邊緣2 cm處分別對稱接種培養5 d的炭疽病原真菌和具有拮抗效果的拮抗菌株菌餅（直徑5 mm），以只接種病原真菌菌株菌餅的平板作為對照。每個處理設置3次重復，25 ℃、黑暗條件下進行培養。5 d后測量病原真菌菌落半徑并計算抑制率。

抑制率=（對照組菌落半徑-處理組菌落半徑）/對照組菌落半徑×100%。

2 結果與分析

2.1 炭疽病的發病癥狀

葉片染病時常呈黑色，形狀不一。匍匐莖、葉柄感病初期出現直徑3～7 mm的黑色紡錘形或橢圓形病斑，稍凹陷，蔓延后葉柄和匍匐莖折斷；當匍匐莖和葉柄上的病斑擴展成為環形圈時，病斑以上部分萎蔫枯死，切斷根莖，從橫斷面上可看到從邊緣向內部擴大的紅褐色壞死斑（圖1），隨著病情加重，則全株枯死。

2.2 病原真菌鑒定

形態學鑒定：病原真菌菌株接種至PDA培養基上培養，其菌落一般呈地毯狀生長，無褶皺。形態初期菌絲為白色，培養后期菌絲逐漸由白色變灰，整齊，并產生暗黃色分生孢子堆，分生孢子兩端鈍圓，無色，光滑，圓柱狀（圖2）。鑒定結果基本符合魏景超關于刺盤孢菌屬（炭疽菌）的分類標準［15］，初步表明該病原菌為炭疽菌。

分子鑒定：從草莓植株發病部位共分離純化獲得21株真菌菌株，分別命名為D1～D21。通過擴增測序，利用NCBI數據庫對擴增序列進行比對，發現在草莓根部分離到11株真菌，包括6株尖孢鐮孢菌（Fusarium oxysporum），2株F. commune，2株暹羅炭疽菌（Colletotrichum siamense）和1株Mucor circinelloides；在莖部分離到4株C. siamense和1株F. oxysporum；在葉部分離到的5株全部是 C. siamense（圖3）。

2.3 病原真菌致病性測定

通過將分離到的病原真菌回接草莓組培苗，接種6 d后，發現20株菌株能侵染草莓，其中D16（Mucor circinelloides）在草莓上不具有致病性，D1、D2、D3、D4、D6、D7、D8、D9、D11、D12、D18、D19、D20和D21共14株發病較重，D13、D14和D17發病較輕，且對照組無發病情況（圖4、表2）。選取致病性較強的D8和D19這2株菌株進行葉片接種，2 d后，發病癥狀如圖5所示，左側為對照。通過對比觀察發現，C. siamense能夠在草莓上引起與田間相似的病害癥狀。重新對發病植株進行病原菌分離，經過測序發現與接種菌為同一真菌，根據柯赫氏法則，說明C. siamense為草莓致病菌。

2.4 拮抗菌篩選結果

將筆者所在實驗室前期分離得到的29株草莓內生真菌分別與D8和D19這2株C. siamense做平板對峙試驗，通過初篩，發現17株內生真菌菌株對D8和D19這2株C. siamense表現出不同程度的拮抗。通過復篩，發現Z72、Z79、Z52、Z107和Z101拮抗效果較好，抑菌率達66%～79%，其中Z72對D8和D19的抑菌率分別達到了74.07%、79.82%（圖6、圖7）。經鑒定，這5株拮抗內生菌均屬于木霉屬（Trichoderma）真菌。

3 結論與討論

目前，國內外報道的草莓炭疽病主要是由膠孢炭疽菌（C. gloeosporioides）、尖孢炭疽菌（C. acutatum）和草莓炭疽菌（C. fragariae）侵染草莓所引起的病害［16-21］。近年來，關于暹羅炭疽菌（C. siamense）侵染草莓也時有報道［22-24］。本試驗對鎮江丹徒區草莓產區采集的草莓植株病害樣品進行組織分離，共獲得21株病原真菌菌株，經致病性測定，并通過形態學和分子生物學相結合的鑒定方法，明確了鎮江丹徒區草莓產區草莓炭疽病的致病菌為暹羅炭疽菌（C. siamense）。

目前草莓炭疽病仍以化學藥劑防治為主，但易造成化學殘留和環境污染，還會使炭疽菌的抗藥性增加。據報道，多次使用多菌靈和乙霉威等化學藥劑可致病原菌抗性高達90%以上［25］。利用拮抗生防菌可以規避以上問題且安全高效，利于環境的保護，已逐漸成為防治草莓炭疽病的首選措施。本試驗從健康草莓植株分離獲得29株內生菌，以 C. siamense 為靶標病原菌，采用平板對峙法將所得29株內生菌進行初篩和復篩，獲得有拮抗作用的菌株17株，其中5株對C. siamense有較強的拮抗效果，經鑒定這5株菌株均為木霉屬真菌。

已有研究表明棘孢木霉（T. asperellum） GYSW-6m1對草莓炭疽菌LC0220的抑制率高達79.03%，具有顯著的防治效果［26］。毛雪琴等報道的黃藍狀菌菌株MT-06對草莓炭疽病菌的抑制率也達到了70%以上［27］。本試驗通過平板對峙法篩選出的Z72對草莓炭疽病病原菌（C. siamense）的抑制率達到了76.95%。說明該菌株對草莓炭疽病菌具有良好的拮抗作用，具有一定的實際應用潛力，為進一步田間應用提供了理論支持。

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