基于線粒體Cytb基因的江淮下游6個湖泊翹嘴鲌群體遺傳多樣性分析

李大命 楊子萍 劉燕山 唐晟凱 谷先坤 殷稼雯

摘要：以線粒體Cytb基因作為分子標記對長江、淮河下游6個湖泊翹嘴鲌群體共262尾個體的遺傳多樣性、遺傳分化及歷史動態進行分析。結果顯示，翹嘴鲌Cytb基因序列全長為1 141 bp，堿基A+T的含量（55.9%）高于G+C含量（44.1%）。262條Cytb基因序列檢出42個變異位點，定義46個單倍型，總群體單倍型和核苷酸多樣性分別為0.916±0.010和0.00 256±0.00 008；6個群體的單倍型多樣性為（0.798±0.059）～（0.927±0.019），核苷酸多樣性為（0.002 04±0.000 27）～（0.002 85±0.000 18），表明翹嘴鲌遺傳多樣性屬于高Hd和低Pi模式?；趩伪缎蜆嫿ǖ南到y發育樹和進化網絡圖顯示，6個群體的單倍型未形成明顯的地理格局。分子方差分析（AMOVA）顯示，遺傳變異主要來自于群體內部（91.64%），群體間遺傳分化系數（Fst）為0.083 62（P<0.01）；6個群體間的Fst為 -0.004 27～0.155 29，其中，長江群體和淮河群體間均具有顯著中度或高度遺傳分化（P<0.05）。中性檢驗結果顯示，Tajimas D和Fus Fs均為負值（P<0.05），核苷酸不配對分布曲線呈現單峰型，表明翹嘴鲌群體在歷史上經歷過顯著的種群擴張。整體來看，江淮下游湖泊的翹嘴鲌野生種質資源遺傳多樣性較低，長江水系群體和淮河水系群體間有顯著的遺傳分化，應采取措施恢復翹嘴鲌資源量及提高其遺傳多樣性，并將長江流域和淮河流域湖泊群體劃分為不同的管理單元進行保護。

關鍵詞：翹嘴鲌；Cytb基因；遺傳多樣性；遺傳分化；種群歷史動態

中圖分類號：S917? 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）03-0213-07

翹嘴鲌（Culter alburnus）俗稱白魚、翹嘴白絲、大白魚，隸屬鯉形目（Cypriniformes）鯉科（Cyprinidae）鲌亞科（Culterinae）鲌屬（Culter），廣泛分布于我國各江河湖泊［1］。翹嘴鲌為兇猛肉食性魚類，它能有效控制小型魚類種群數量，減輕小型魚類對浮游生物的壓力，在優化魚類群落機構及維持水域生態系統穩定方面發揮了重要作用［2］。翹嘴鲌肉味鮮美、肉質細嫩潔白、營養豐富、經濟價值高，且生長迅速，是我國常見的淡水養殖品種之一［3］。多年來，由于過度捕撈、生態環境污染及棲息地破壞多種因素的影響，翹嘴鲌野生資源遭到嚴重破壞，種群數量急劇衰退，遺傳多樣性下降，個體小型化、低齡化趨勢嚴重，因此加強翹嘴鲌種質資源保護成為亟待解決的問題［4］。

迄今，有關翹嘴鲌的研究主要集中在年齡、生長、繁殖、營養、養殖等方面［5-9］，而有關翹嘴鲌資源的遺傳多樣性則需加強研究。魚類遺傳多樣性是魚類物種生存與進化的基礎，是評價自然資源的重要依據，開展魚類遺傳多樣性研究，對漁業資源管理與養護、人工增殖放流等工作具有重要的指導意義［10］。線粒體DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）作為核外遺傳物質，具有分子小、結構簡單、進化快、嚴格的母系遺傳等特點，已成為群體遺傳學和系統發育研究的重要分子標記［11］。細胞色素b基因（cytochrome b，Cytb）是mtDNA上的蛋白質編碼基因之一，其結構和功能較為清楚，進化速度適中，有通用引物便于擴增和測序，因此在魚類群體遺傳多樣性和遺傳結構研究方面有著廣泛應用［12-14］。目前，已有利用mtDNA的不同區域和基因序列開展翹嘴鲌群體遺傳多樣性評價的一些報道。楊子拓和黃小彧等采用D-loop控制區序列分別研究了珠江水系和長江水系翹嘴鲌的遺傳多樣性及遺傳分化［15-16］。王偉等利用COⅡ序列分析了6個水域的翹嘴鲌群體遺傳多樣性，結果顯示翹嘴鲌遺傳多樣性較低（Hd：0.604 8，Pi：0.001 63）［17］。伊西慶基于ND2序列探究了我國東部6個湖泊翹嘴鲌遺傳多樣性和遺傳結構，結果表明部分群體間出現高度遺傳分化［18］。江淮下游是我國淡水湖泊的集中分布區之一，但對于江淮水系內部及水系間不同湖泊的翹嘴鲌群體遺傳多樣性及分化尚缺乏了解。

本研究采集長江下游的太湖、滆湖及長蕩湖和淮河下游的高郵湖、白馬湖及洪澤湖6個湖泊翹嘴鲌群體，通過mtDNA Cytb基因序列的比較分析，探究江淮下游6個湖泊的翹嘴鲌群體遺傳多樣性和進化關系，期望深入了解6個湖泊翹嘴鲌群體的遺傳背景和種質資源現狀，以便于為翹嘴鲌的野生資源科學保護、合理利用及增殖放流提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

2021年5月至2022年10月，在長江下游的太湖、滆湖、長蕩湖和淮河下游的高郵湖、白馬湖、洪澤湖采集翹嘴鲌樣品。各群體的采樣水域和樣本數見圖1和表1，測量翹嘴鲌的的體長、體質量，剪取尾鰭組織放入無水乙醇中固定保存。

1.2 DNA提取、PCR擴增和測序

采用TaKaRa公司的DNA提取試劑盒從尾鰭組織提取翹嘴鲌的基因組DNA，通過1%瓊脂糖凝膠電泳驗證DNA的完整性，并使用分光光度計測定DNA濃度后，于-20 ℃保存備用。

采用通用引物L14724（5′-CGTCAGTCCTTTACTTCGCA-3′）和H15915（5′-AGGGCATACTCACGGGGTTG-3′）［19］擴增翹嘴鲌Cytb基因序列，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR反應體系共50.0 μL，其中，包括：2×Premix TaqTM 25.0 μL（TaKaRa Taq 1.25 U/25 μL、0.2 mmol/L dNTP、1.5 mmol/L Mg2+、色素Marker、比重增加物和穩定劑）、上下游引物各2.0 μL（10 μmol/L）、DNA模板2.0 μL（40 ng/μL）和ddH2O 33.0 μL。PCR擴增程序為：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性 40 s，55 ℃復性30 s，72 ℃延伸1 min，35 個循環；72 ℃ 延伸5 min。PCR完成后取4.0 μL經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，剩余的PCR產物送至生工生物工程（上海）股份有限公司，進行純化和雙向測序，測序引物與擴增引物一致。

1.3 數據處理和分析

使用BioEdit 7.0軟件讀取序列，并參照測序圖譜人工校對序列中可能的錯誤。使用CLUSTALX 2.0軟件對序列進行多重比對和排序。使用MEGA 7.0軟件統計序列的堿基組成、突變位點數和突變類型，計算群體間的Kimura雙參數遺傳距離，利用鄰接法（neighbor-joining，NJ）構建單倍型系統發育樹，系統樹中節點的自舉置信水平應用自引導估計，循環次數為1 000次。采用Network軟件構建單倍型網絡圖，用以展示單倍型之間的進化關系。使用DanSP 6.0軟件計算群體的單倍型數量、單倍型多樣性（haplotye diversity，Hd）、核苷酸多樣性（nucleotide diversity，Pi）等遺傳多樣性參數。采用Arlequin 3.5軟件進行分子方差分析（analysis of molecular variance，AMOVA）和計算群體間遺傳分化指數（Fst），開展Tajimas D及Fus Fs中性檢驗和構建核酸錯配分布曲線，評估翹嘴鲌群體歷史動態。

2 結果與分析

2.1 翹嘴鲌Cytb序列變異和遺傳多樣性

本研究獲得6個翹嘴鲌群體262條Cytb基因序列，其長度為1 141 bp，堿基平均含量分別為A（29.3%）、T（26.6%）、C（29.4%）和G（14.7%），其中A+T的含量（55.9%）高于G+C的含量（44.1%），具有明顯的堿基組成偏倚性。

由表1可知，262條Cytb序列檢出42個變異位點，其中，有33個簡約信息位點和9個單一信息位點，沒有插入或缺失位點。262條序列定義46種單倍型，整個群體的單倍型多樣性和核苷酸多樣性分別為0.915±0.010和0.002 54±0.000 08；6個群體的單倍型多樣性為（0.792±0.059）～（0.927±0.019），核苷酸多樣性為（0.002 20±0.000 21）～（0.002 85±0.000 18），其中，太湖群體的單倍型多樣性和核苷酸多樣性最大，高郵湖群體的單倍型多樣性最小，滆湖群體的核苷酸多樣性最小。

2.2 群體單倍型組成及系統發育關系

由表2可知，6個群體262個個體共定義46種單倍型，其中，太湖群體擁有的種類數最多（20種），滆湖和洪澤湖群體擁有的種類數最少（均為14種），長蕩湖、高郵湖和白馬湖群體各擁有18、17、15種單倍型。

46種單倍型有26種共享單倍型，其中，單倍型Hap2、Hap8和Hap41為6個群體共享，個體數量分別有36、15、25個，合計占比為28.8%；其他共享單倍型為部分群體擁有，單倍型Hap22為高郵湖、白馬湖和洪澤湖群體共享，其個體數量最多（56個），占比為21.2%。獨享單倍型有20種，其中，單倍型Hap3、Hap4、Hap18和Hap20為太湖群體獨有，單倍型Hap6、Hap34、Hap37和Hap38為滆湖群體獨有，單倍型Hap13、Hap31、Hap33和Hap43為長蕩湖群體獨有，單倍型Hap5、Hap23、Hap29和Hap30為高郵湖群體獨有，單倍型Hap14、Hap27為白馬湖群體獨有，單倍型Hap26和Hap28為洪澤湖群體獨有。

以蒙古鲌（Culter mongolicus）為外類群，采用鄰接法構建單倍型系統進化樹。由圖2可知，6個群體形成了單系類群，各群體的單倍型呈混雜分布模式，沒有特定的地理群體譜系。由單倍型網絡結構圖（圖3）可知，群體間擁有多個共享單倍型，各單倍型相互散布在不同的地理群體中，未形成明顯的系統地理格局，這與系統發育樹結果相一致。

2.3 群體遺傳分化

由表3可知，6個群體間的遺傳距離為0.002 2～0.003 0，其中，太湖和洪澤湖群體間遺傳距離最大，洪澤湖和高郵湖群體間遺傳距離最小。由6個群體的UPGMA聚類結果（圖4）可知，洪澤湖、高郵湖和白馬湖群體聚為一支，滆湖和長蕩湖群體聚為一支，最后與太湖群體聚在一起。

由AMOVA結果（表4）可知，6個群體間的遺傳變異為8.36%，群體內變異為91.64%，整體遺傳分化系數Fst值為0.081 68（P<0.01），分化達中等水平。將6個群體分為長江水系組（太湖、滆湖和長蕩湖群體）和淮河水系組（高郵湖、白馬湖和駱馬湖）進行分子方差分析，結果顯示，組間遺傳變異為12.04%，組內群體間變異為0.77%，群體內變異為87.19%，組間的遺傳分化指數Fct值為0.120 39（P<0.01），達到中等分化水平。

兩兩群體間的遺傳分化指數Fst值為 -0.004 27～0.155 29，Fst值統計結果（表3）表明，長江水系和淮河水系群體內的Fst值為 -0.004 27～0.023 37（P>0.05） 均小于0.05，表明群體間遺傳分化較弱；2個水系群體間的Fst值為0.060 83～0.155 29（P<0.01），表明群體間具有極顯著的中等水平遺傳分化。

2.4 群體歷史動態

翹嘴鲌群體的Tajimas D和Fus Fs中性檢驗結果（表5）顯示，6個群體的Tajimas D為 -1.543 79～-1.117 73，但僅有滆湖群體的統計具有顯著性差異（P<0.05）；6個群體的Fus Fs為-9.476 55～-4.308 53，統計均具有顯著性差異（P<0.05）。將6個群體作為一個整體進行Tajimas D和Fus Fs中性檢驗，結果顯示Tajimas D和Fus Fs均為負值，統計具有極顯著性差異（P<0.01），且核苷酸歧點分布曲線具有典型的單峰模式，表明翹嘴鲌群體在歷史上經歷了顯著的種群擴張過程。

3 討論

3.1 翹嘴鲌群體遺傳多樣性

遺傳多樣性是種群生存和進化的基礎，遺傳多樣性越豐富，種群生存、繁衍和擴張的潛力越大，對環境變化的抵抗和適應能力就越強。單倍型多樣性（Hd）和核苷酸多樣性（Pi）是評價種群遺傳多樣性的重要指標，其值越大，則種群的遺傳多樣性就越高［20］。相比較而言，核苷酸多樣性考慮各種單倍型在群體中所占的比例，反映的群體多態性程度更為精確［21］。本研究通過Cytb基因探究了6個湖泊的翹嘴鲌群體遺傳多樣性，結果顯示，整個翹嘴鲌群體的單倍型多樣性和核苷酸多樣性分別為0.916±0.010和0.002 56±0.000 08；6個群體的單倍型多樣性為（0.798±0.059）～（0.927±0.019），核苷酸多樣性為（0.002 04±0.000 27）～（0.002 85±0.000 18）。

由此可知，6個湖泊的翹嘴鲌群體遺傳多樣性有較大差異，其中，太湖群體的遺傳多樣性最高，高郵湖群體的遺傳多樣性最低，這可能與湖泊的生態環境、捕撈強度及漁業管理模式等多種因素有關［22-23］。根據GRANT等劃分的遺傳多樣性類型（高Hd高Pi、高Hd低Pi、低Hd高Pi和低Hd低Pi）［24］，翹嘴鲌群體的遺傳多樣性屬于高Hd和低Pi類型，提示翹嘴鲌種質資源遺傳多樣性較低。近幾十年來，受過度捕撈、環境污染、涉水工程、非法采砂等不利因素的影響，導致湖泊生態環境質量下降和棲息生境縮減，翹嘴鲌資源量下降和遺傳多樣性喪失。已有很多研究顯示，我國的野生翹嘴鲌種質資源均具有高Hd低Pi現象［15-18，25-27］，說明翹嘴鲌野生種質資源遺傳多樣性普遍較低，急需采取措施恢復翹嘴鲌資源量及提高其遺傳多樣性。

魚類的遺傳多樣性模式與進化歷史密切相關。當Hd≥0.5、Pi<0.005時，通常認為魚類是受瓶頸效應后種群數量的迅速擴張而導致，因核苷酸多樣性的積累時間比單倍型多樣性的積累時間更漫長得多，從而形成高Hd、低Pi模式［24］。中性檢驗和核苷酸歧點分布是評估群體歷史動態的常用方法，若Fus Fs和Tajimas D檢驗結果為負值且具有顯著性差異，歧點分布曲線為單峰型，說明DNA序列中含有比中性進化模型更多的核苷酸位點變化，可能預示種群經歷過一個擴張的歷史［28-29］。從整體觀察（表5、圖5）可知，翹嘴鲌群體的Fus Fs和Tajimas D檢驗均為負值，且具有顯著性差異，核苷酸歧點分布曲線呈現典型的單峰型，表明翹嘴鲌在歷史上經歷過顯著的群體擴張過程，從而形成了高Hd、低Pi的遺傳模式，這與已有研究結果［18，27］一致。

3.2 翹嘴鲌群體遺傳結構

群體遺傳結構不僅可用于評價物種群體的變異水平和不同地理群體之間的關系，還可確定群體中的進化顯著單元和管理單元，以及制定資源的保護和管理策略［30］。通常用遺傳分化系數Fst來反映群體間遺傳分化程度，若Fst值<0.05，表示各群體間不存在分化；若Fst值為0.05～0.15，表示各群體間存在中度分化；若Fst值為＞0.15～0.25，表示各群體間存在高度分化［31］?？傮w來看，6個翹嘴鲌群體的Fst值為0.083 62（P<0.01），表明翹嘴鲌群體間具有極顯著的中度遺傳分化。群體間的Fst值顯示，長江水系和淮河水系內各群體間沒有顯著遺傳差異，而長江水系和淮河水系群體之間有極顯著的遺傳分化，6個群體的UPGMA聚類圖也支持此結果。一般來說，魚類在不同水系之間存在明顯的種群分化，同一流域內的種群通常分化不明顯或沒有遺傳分化［32-33］。翹嘴鲌的遺傳分布格局可能與群體所屬水系及地理位置等因素有關。從所屬水系來看，太湖、滆湖及長蕩湖屬于長江水系，而高郵湖、白馬湖和洪澤湖屬于淮河水系；從地理位置來看，太湖、滆湖及長蕩湖位于長江以南，高郵湖、白馬湖和洪澤湖位于長江以北，水系內各群體的地理位置相對較近，而水系間各群體的地理位置相對較遠。另外，修閘建壩及湖泊的生態環境差異也會導致江淮水系群體間基因交流通道受阻而產生遺傳差異。從單倍型組成可看出，長江、淮河水系內各群體間擁有較多的共享單倍型，而2個水系群體間擁有的共享單倍型較少，也說明江淮水系群體間的基因交流較弱。已有研究顯示，我國東部6個湖泊的翹嘴鲌群體間也有顯著的遺傳分化［18］，本研究結果與之一致。根據翹嘴鲌群體的遺傳結構，應將長江水系群體和淮河水系群體劃分為不同的管理單元進行保護。

3.3 翹嘴鲌種質資源管理和保護

本研究采用線粒體Cytb基因對江淮下游6個翹嘴鲌群體的遺傳多樣性和遺傳結構進行分析，研究結果顯示，長江水系和淮河水系翹嘴鲌群體間有顯著的遺傳分化，因此應將長江水系和淮河水系的翹嘴鲌群體劃分為不同的遺傳單元進行管理和保護；翹嘴鲌群體遺傳多樣性具有高單倍型多樣性和低核苷酸多樣性模式，提示翹嘴鲌種質資源遺傳多樣性較低，需要采取措施恢復翹嘴鲌種群數量及提高其遺傳多樣性水平。根據國家禁漁政策及翹嘴鲌生物學特征，可采取以下措施：（1）強化漁業資源管理，加大執法力度，嚴厲打擊非法捕撈行為，禁止電毒炸等作業方式；（2）控制環境污染，開展湖泊生態環境治理，恢復水生植被，構建人工魚巢，為翹嘴鲌生存和繁殖提供良好的生態環境；（3）科學規范開展翹嘴鲌增殖放流，提高翹嘴鲌成活率，開展放流群體和野生群體的遺傳評估，跟蹤監測翹嘴鲌資源變化，逐步提高翹嘴鲌遺傳多樣性。

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