白花蛇舌草多糖對異煙肼致肝損傷的影響及機制 Δ

莊秀萍 ，李 莉 ，陳 超 ，王麗媛 ，曹廣尚 ，周 朋 ，王 信 （.山東中醫藥大學藥學院，濟南 5055；.山東中醫藥大學附屬醫院兒科，濟南 500；.山東中醫藥大學附屬醫院藥學部，濟南 500）

肝損傷是各種肝臟疾病的病理基礎，長期肝損傷可導致肝纖維化、肝硬化、肝癌，甚至肝功能衰竭。藥物性肝損傷（drug-induced liver injury，DILI）是由化學藥物、生物合成藥物、天然藥物等及其代謝產物引起的肝臟損害，發病率逐年上升，已成為全球肝病死亡的第五大誘因[1―2]。在我國，引起DILI 的藥物種類包括非甾體抗炎藥、抗結核藥、抗腫瘤藥等，其中抗結核藥導致的肝損傷發生率高達21.99%[3]。異煙肼是WHO推薦的標準抗結核治療方案中的首選藥物，但其在抗結核藥中引起的肝損傷最多，發生率約為48%[4]。兒童是結核病的高發人群，異煙肼預防性治療可使兒童結核潛伏感染發展為活動性結核病的風險降低50%及以上[5]，但由于兒童肝臟功能發育不成熟等因素，兒童異煙肼用藥誘導產生的肝損傷已成為不容忽視的問題。目前，西醫治療異煙肼致肝損傷大都存在毒副作用大、療效不理想等問題，而中醫藥治療肝損傷具有多層次、多靶點、多途徑綜合調控的特點，在改善患者癥狀、降低肝損傷風險、延緩病情進展、增強機體修復能力等方面優勢明顯[6]。

氧化應激與DILI 的發生發展密切相關[7]，沉默信息調節因子1（silent information regulator 1，Sirt1）/核轉錄因子紅系2 相關因子2（nuclear factor-erythroid 2-related factor 2，Nrf2）信號通路是機體重要的抗氧化應激通路，Sirt1激活能促進Nrf2核易位，從而上調血紅素加氧酶1（heme oxygenase-1，HO-1）、醌氧化還原酶1（quinone oxidoreductase 1，NQO1）等抗氧化因子的轉錄與表達，發揮對DILI 的改善作用[8]。白花蛇舌草為茜草科植物白花蛇舌草Hedyotis diffusaWilld.的干燥全草，具有清熱解毒、消腫散結之效[9]。白花蛇舌草多糖（polysaccharides fromH. diffusa，HDP）作為其主要成分和重要活性物質，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、增強免疫等多種藥理作用，尤其是顯著的抗氧化作用為其在氧化損傷類疾病治療中的應用提供了有力支撐[10]。本研究基于結核病兒童發病特點及異煙肼用藥肝損傷風險，選擇生理、發育和代謝與人類高度相似的斑馬魚幼魚為模型，研究HDP對異煙肼致肝損傷的影響，同時結合人肝L02細胞模型，初步探討其改善作用機制，旨在為DILI的治療提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括1260 型高效液相色譜儀（美國Agilent 公司），EP214C 型萬分之一電子天平、AB135-S型十萬分之一天平（瑞士Mettler Toledo公司），EG1150 型石蠟包埋機、RM2235 型石蠟切片機（德國Leica 公司），KQ-250 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），H1650-W型臺式高速離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司），SZX16 型熒光顯微鏡、FSX100型顯微鏡（日本Olympus 公司），HT7800 型透射電子顯微鏡（日本Hitachi公司），Fusion FX7型多功能成像系統（法國Vilber公司），CMax Plus型酶標儀（上海美谷分子儀器有限公司），CO2恒溫細胞培養箱（上海精宏實驗設備有限公司）。

1.2 主要藥品與試劑

異煙肼對照品（批號MKBQ8553V，純度≥99%）購自德國Fluka 公司；白花蛇舌草飲片（批號220602，產地河南確山）購自安徽億源藥業股份有限公司；丙氨酸轉氨酶（alanine transaminase，ALT）、天冬氨酸轉氨酶（aspartate transaminase，AST）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）酶聯免疫吸附測定（ELISA）試劑盒和BCA 蛋白測定試劑盒（批號分別為20220412、20211215、20220354、20211224）均購自南京建成生物工程研究所；蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒（批號20211218）購自北京索萊寶科技有限公司；DMEM 高葡萄糖培養基（批號70090200）購自北京蘭杰柯科技有限公司；胎牛血清（批號22020702）購自美國Gibco 公司；CCK-8 檢測試劑盒（批號G2026-1000T）購自武漢賽維爾生物科技有限公司；吖啶橙/碘化丙啶（AO/PI）雙染試劑盒（批號VD144718）購自北京百奧萊博科技有限公司；兔Sirt1 單克隆抗體、兔Nrf2多克隆抗體、兔HO-1單克隆抗體、兔NQO1單克隆抗體、兔甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）多克隆抗體和辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG 二抗（批號分別為ab189494、ab137550、ab189491、ab80588、ab9485、ab150077）均購自英國Abcam公司；甲醇、乙醇等其他試劑均為分析純；水為娃哈哈純凈水。

1.3 實驗動物與細胞

具有肝臟特異性熒光的轉基因斑馬魚（L-FABP：EGFP）由齊魯工業大學生物研究所提供。斑馬魚的養殖繁育參照TheZebrafish Book，操作遵循經濟合作與發展組織標準。斑馬魚養殖條件如下：水溫（28±0.5）℃，pH 7.0～7.2，電導率450～550 μs/cm，黑暗/光照周期為10 h/14 h，成年斑馬魚每日喂食豐年蝦幼蟲3 次。斑馬魚胚胎置于斑馬魚胚胎培養液（5 mmol/L NaCl、0.17 mmol/L KCl、0.4 mmol/L CaCl2、0.16 mmol/L MgSO4）中，（28.0±0.5）℃下控光培養，每24 h更換胚胎培養液并及時去除死胚，胚胎密度控制在5枚/mL。

人肝L02細胞（貨號SNL-141）購自武漢尚恩生物技術有限公司。

2 方法

2.1 HDP的制備及含量測定

HDP的制備參考文獻方法[11]：取1 000 g白花蛇舌草飲片粉碎，以15 倍量的80%乙醇回流脫脂；收集藥渣，揮干溶劑后，加10倍量水提取2次，每次2 h；合并濾液，減壓濃縮至相對密度約1.015（60 ℃），濾過；濾液過D101型大孔吸附樹脂柱，收集藥液，減壓濃縮至一定體積，采用Savage 法去除蛋白；上清液加入乙醇使醇含量達90%，靜置過夜，濾過，沉淀用乙醇洗滌，于60 ℃減壓干燥，得HDP。應用苯酚-濃硫酸法測定HDP 的質量分數[12]。

2.2 基于斑馬魚模型評價HDP對異煙肼致肝損傷的保護作用

2.2.1 HDP干預濃度的篩選

斑馬魚胚胎發育3 d 后，選擇正常發育的斑馬魚幼魚，以每孔30 尾置于6 孔板中，隨機分為正常組、模型組、HDP 組，每組設3 個復孔。正常組斑馬魚給予胚胎培養液，模型組斑馬魚給予含4 mmol/L異煙肼的胚胎培養液[13]，HDP組斑馬魚給予含4 mmol/L異煙肼和不同濃度HDP（800、600、400、200、150、100、50 μg/mL，加胚胎培養液超聲處理使溶解）的胚胎培養液。將所有平板置于28 ℃恒溫培養箱中孵化，浸浴給藥72 h，每24 h 換1次藥液。以心臟驟停作為斑馬魚死亡的標準，通過一般形態特征來確定畸變評分。以斑馬魚幼魚的存活率和畸變率為指標，篩選HDP的干預濃度。

2.2.2 斑馬魚肝臟熒光面積及熒光強度的測定

浸浴給藥72 h 后，隨機選取“2.2.1”項下正常組、模型組和HDP 低、高濃度組（50、100 μg/mL，根據“2.2.1”項下實驗結果選擇）斑馬魚幼魚8尾，在熒光顯微鏡下觀察斑馬魚的局部肝臟形態，使用Image J 軟件分析肝臟熒光面積和熒光強度。

2.2.3 斑馬魚肝組織病理學觀察

浸浴給藥72 h 后，隨機選取“2.2.1”項下正常組、模型組和HDP 低、高濃度組（50、100 μg/mL，根據“2.2.1”項下實驗結果選擇）斑馬魚幼魚3尾，用4%多聚甲醛和2.5%戊二醛固定。取4%多聚甲醛固定的幼魚，用分級乙醇脫水，加入二甲苯，石蠟包埋，切片，進行HE 染色，使用顯微鏡觀察組織切片并拍照。取2.5%戊二醛固定的斑馬魚幼魚，再用1%鋨酸固定，用分級丙酮脫水，置包埋液中，固化，超薄切片，用醋酸鈾、檸檬酸鉛染色，使用透射電子顯微鏡觀察組織切片并拍照。

2.3 基于L02細胞模型研究HDP對異煙肼致肝損傷的保護作用及機制

2.3.1 異煙肼和HDP干預濃度的篩選

將L02細胞按1×104個/孔的密度接種于96孔板中，培養24 h后，分別加入濃度為2、4、6、8、16、32 mmol/L的異煙肼培養24 h，每個濃度設4個復孔，采用CCK-8法檢測細胞存活率，具體操作按試劑盒說明書方法進行。以同樣方法檢測質量濃度分別為1、2、4、8、16、24 mg/mL的HDP處理后的細胞存活率。細胞存活率＝（給藥組平均光密度值－校準平均光密度值）/（細胞空白對照組平均光密度值－校準平均光密度值）×100%。

2.3.2 HDP對異煙肼致損傷L02細胞存活的影響

按照“2.3.1”項下方法接種、培養細胞24 h，然后分為正常組、模型組和HDP低、高濃度組（2、4 mg/mL），每組設4 個復孔。正常組細胞給予含10%胎牛血清的DMEM 培養基，模型組細胞給予含4 mmol/L 異煙肼的培養基，HDP低、高濃度組細胞分別給予含4 mmol/L異煙肼和相應濃度HDP（2、4 mg/mL）的培養基，培養24 h，采用CCK-8法檢測細胞存活率。同法處理細胞后，收集細胞按AO/PI試劑盒說明書方法進行雙重染色，使用酶標儀觀察細胞存活情況。

2.3.3 HDP對L02細胞上清液中ALT、AST水平及細胞裂解液中GSH含量的影響

將L02細胞以1×106個/孔的密度接種于6孔板中，培養24 h 后，按“2.3.2”項下方法分組、處理，每組設3 個復孔，收集細胞上清液和細胞裂解液，按試劑盒說明書方法分別檢測細胞上清液中AST、ALT水平及細胞裂解液中GSH含量。

2.3.4 HDP 對L02 細胞中Sirt1/Nrf2 信號通路相關蛋白表達的影響

采用Western blot 法檢測。將“2.3.3”項下各組細胞裂解液與上樣緩沖液混合，煮沸變性，電泳分離，轉膜，用5%脫脂牛奶封閉后，在4 ℃下分別加入Sirt1、Nrf2、HO-1、NQO1、GAPDH 抗體（稀釋比例分別為1∶1 000、1∶1 000、1∶1 000、1∶1 000、1∶2 000），孵育過夜，洗滌3次后，加入二抗（稀釋比例為1∶5 000），室溫孵育1 h，用ECL試劑進行顯影，并用多功能成像系統進行掃描。采用Image J 軟件分析蛋白條帶灰度值，以目的蛋白條帶灰度值與內參蛋白（GAPDH）條帶灰度值的比值評價目的蛋白的表達水平。

2.4 統計學處理

采用GraphPad Prism 8.0 軟件進行分析。實驗數據以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩組間比較采用LSD-t檢驗。檢驗水準α＝0.05。

3 結果

3.1 HDP的提取得率與質量分數

1 000 g白花蛇舌草飲片，可提取獲得12.35 g HDP，得率為1.24%；HDP的質量分數為61.47%。

3.2 HDP對異煙肼致斑馬魚肝損傷的保護作用

3.2.1 HDP對斑馬魚存活率和畸變率的影響

HDP質量濃度在150 μg/mL及以上時，斑馬魚的存活率均低于95%，畸變率均高于15%，結果見表1。綜合考慮，選擇100、50 μg/mL 作為后續斑馬魚實驗HDP 的高、低濃度。

表1 不同濃度HDP 對斑馬魚存活率和畸變率的影響（±s，n＝3）

表1 不同濃度HDP 對斑馬魚存活率和畸變率的影響（±s，n＝3）

組別正常組模型組HDP組藥物濃度4 mmol/L異煙肼4 mmol/L異煙肼+800 μg/mL HDP 4 mmol/L異煙肼+600 μg/mL HDP 4 mmol/L異煙肼+400 μg/mL HDP 4 mmol/L異煙肼+200 μg/mL HDP 4 mmol/L異煙肼+150 μg/mL HDP 4 mmol/L異煙肼+100 μg/mL HDP 4 mmol/L異煙肼+50 μg/mL HDP存活率/%100 98.89±1.92 0 21.51±3.85 35.56±1.92 76.87±3.33 94.84±3.84 100 100畸變率/%0 7.85±1.86 100 56.56±3.15 34.70±2.84 18.82±1.74 10.00±3.33 7.78±1.92

3.2.2 HDP對斑馬魚肝臟熒光面積及熒光強度的影響

與正常組比較，模型組斑馬魚肝臟熒光面積和熒光強度均顯著減?。≒＜0.01），說明肝損傷造模成功；與模型組比較，HDP 低、高濃度組斑馬魚肝臟熒光面積均顯著增加（P＜0.05或P＜0.01），HDP高濃度組斑馬魚肝臟熒光強度顯著增加（P＜0.01）。結果見表2。

表2 各組斑馬魚肝臟熒光面積和熒光強度的測定結果（±s，n＝8）

表2 各組斑馬魚肝臟熒光面積和熒光強度的測定結果（±s，n＝8）

a：與正常組比較，P＜0.01；b：與模型組比較，P＜0.05；c：與模型組比較，P＜0.01。

組別正常組模型組熒光面積/%100.00±4.78 75.19±4.55a熒光強度/%100.00±4.67 70.18±3.50a組別HDP低濃度組HDP高濃度組熒光面積/%82.27±2.82b 98.05±1.84c熒光強度/%73.12±3.20 83.78±2.59c

3.2.3 HDP對斑馬魚肝組織病理變化的影響

與正常組比較，模型組斑馬魚肝細胞胞漿稀疏、核萎縮、空泡化及炎癥細胞聚集，出現明顯的肝損傷壞死特征；與模型組比較，HDP低、高濃度組斑馬魚上述肝損傷壞死特征均有不同程度改善。結果見圖1。

圖1 各組斑馬魚肝組織病理變化的顯微鏡圖（HE染色）

3.2.4 HDP對斑馬魚肝組織超微病理變化的影響

與正常組比較，模型組斑馬魚肝細胞核出現萎縮、畸變，線粒體的數量和嵴均明顯減少、形狀發生扭曲變形；與模型組比較，HDP低、高濃度組斑馬魚肝細胞核和線粒體的病理變化均有不同程度改善，其中HDP高濃度組改善更明顯。結果見圖2。

紅色箭頭：細胞核萎縮、畸變；黃色箭頭：線粒體的數量和嵴；藍色箭頭：線粒體形狀扭曲變形。圖2 各組斑馬魚肝組織超微病理變化的顯微鏡圖（醋酸鈾、檸檬酸鉛染色）

3.3 HDP對異煙肼致L02細胞損傷的保護作用及機制

3.3.1 異煙肼和HDP干預濃度的篩選結果

如圖3（A）所示，L02細胞存活率隨異煙肼濃度的升高而降低，當異煙肼濃度為4 mmol/L 時，細胞存活率約為80%，滿足Western blot 實驗提取蛋白的要求，綜合考慮選擇4 mmol/L 作為異煙肼誘導肝損傷的給藥濃度。如圖3（B）所示，L02細胞存活率隨HDP質量濃度的升高而降低，當HDP 質量濃度大于4 mg/mL 時，細胞存活率低于100%，綜合考慮選擇2、4 mg/mL 作為HDP 干預的低、高濃度。

圖3 異煙肼和HDP對L02細胞存活率的影響

3.3.2 L02細胞存活率的測定結果

與正常組比較，模型組L02 細胞存活率顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，HDP 低、高濃度組L02 細胞存活率均顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）。結果見圖4。

a：與正常組比較，P＜0.01；b：與模型組比較，P＜0.05；c：與模型組比較，P＜0.01。圖4 各組L02細胞存活率的測定結果（±s，n＝4）

3.3.3 L02細胞存活情況的染色結果

AO 可透過正常細胞膜，使細胞核呈綠色或黃綠色均勻熒光；PI無膜通透性，不能透過活細胞膜，只能進入損傷的細胞及死細胞，呈紅色熒光。如圖5所示，正常組視野以綠色熒光的活細胞為主；與正常組比較，模型組呈綠色熒光的活細胞數量明顯減少，呈紅色熒光的損傷或死亡細胞數量明顯增加；與模型組比較，HDP低、高濃度組呈綠色熒光的活細胞數量均明顯增加，呈紅色熒光的損傷或死亡細胞數量均明顯減少。

圖5 各組L02細胞存活情況AO/PI熒光染色圖

3.3.4 L02 細胞上清液中AST、ALT 水平及細胞裂解液中GSH含量的測定結果

與正常組比較，模型組L02 細胞上清液中AST 和ALT 水平均顯著升高（P＜0.01），細胞裂解液中GSH 含量顯著降低（P＜0.01）。與模型組比較，HDP 低濃度組L02 細胞上清液中AST 水平顯著降低（P＜0.05）；HDP高濃度組L02細胞上清液中AST、ALT水平均顯著降低（P＜0.05），細胞裂解液中GSH 含量顯著升高（P＜0.01）。結果見圖6。

a：與正常組比較，P＜0.01；b：與模型組比較，P＜0.05；c：與模型組比較，P＜0.01。圖6 各組L02 細胞上清液中AST、ALT 水平及細胞裂解液中GSH含量的測定結果（±s，n＝3）

3.3.5 L02 細胞中Sirt1/Nrf2 信號通路相關蛋白表達的測定結果

與正常組比較，模型組L02 細胞中Sirt1、NQO1、HO-1 蛋白表達水平均顯著降低（P＜0.05 或P＜0.01），Nrf2 蛋白表達水平有升高趨勢，但差異無統計學意義（P＞0.05）；與模型組比較，HDP 低濃度組L02 細胞中Nrf2、NQO1 蛋白表達水平均顯著升高（P＜0.05），HDP高濃度組L02 細胞中Sirt1、Nrf2、NQO1、HO-1 蛋白表達水平均顯著升高（P＜0.05 或P＜0.01）。結果見圖7、圖8。

圖7 各組L02細胞中Sirt1、Nrf2、NQO1、HO-1蛋白表達的電泳圖

4 討論

異煙肼誘導的肝損傷與線粒體呼吸鏈酶活性抑制、通透性轉化孔持續開放、動力學失衡等功能障礙密切相關，其可導致線粒體膜通透性增加、腫脹畸形、數量減少、嵴密度降低等[6]，這與本研究結果一致。HDP能顯著改善異煙肼誘導的斑馬魚肝組織病理變化，尤其是對線粒體形態、嵴密度等有較好的恢復作用，提示HDP 對肝損傷的改善作用可能與調控線粒體功能相關。后期本研究團隊將進一步探討HDP對線粒體功能的影響。

異煙肼可誘導氧化還原蛋白Nrf2核外表達積累，抑制Nrf2 入核，導致肝細胞抗氧化能力降低而發生損傷，故氧化應激是異煙肼致肝損傷的重要因素[14]。Sirt1 作為細胞氧化還原狀態的傳感器和氧化應激的保護器，可增加下游Nrf2靶基因的轉錄活性并上調其蛋白表達，促進Nrf2核易位及下游抗氧化因子GSH、HO-1等表達，提高機體抗氧化能力，在肝損傷氧化應激反應中發揮重要作用。研究表明，激活Sirt1/Nrf2 信號通路可保護細胞避免氧化應激誘導的損傷進而改善膽汁淤積肝損傷[7]；Sirt1可通過增加Nrf2核移位提高機體抗氧防御能力，對四氯化碳、對乙酰氨基酚誘導的肝損傷產生良好的保護作用[15]。本研究結果表明，與正常組比較，模型組L02細胞中Nrf2蛋白表達水平有升高趨勢，Sirt1、NQO1、HO-1蛋白表達水平均顯著降低，這可能是肝損傷過程中導致的Nrf2 代償性增加；而HDP 可顯著提高L02 細胞中Sirt1、Nrf2、NQO1、HO-1 蛋白表達水平，提示HDP 可能通過激活Sirt1/Nrf2信號通路，提高抗氧化能力，發揮對異煙肼致肝損傷的改善作用。

綜上所述，HDP對異煙肼誘導的肝損傷具有一定的改善作用，其機制可能與激活Sirt1/Nrf2信號通路、改善線粒體功能、提高抗氧化能力相關。后期本研究團隊將進一步對HDP成分的分離純化、構效評價、作用靶點等方面進行深入研究，旨在為HDP的綜合開發利用提供支撐。