銀杏黃酮苷元減輕多柔比星心臟毒性的作用機制 Δ

蔡 英 ，錢 麗 ，王開靚 ，李 琴 ，劉春花 ，孫 佳 潘 潔 ，李勇軍 ， ，陸 苑 （.貴州醫科大學貴州省藥物制劑重點實驗室/省部共建藥用植物功效與利用國家重點實驗室，貴陽 55000；.貴州醫科大學藥學院，貴陽 55000；.遵義醫科大學基礎藥理教育部重點實驗室，貴州 遵義 56006；.貴州醫科大學民族藥與中藥開發應用教育部工程研究中心，貴陽 55000）

多柔比星（doxorubicin，DOX）又稱阿霉素，是一種具有抗腫瘤活性的蒽環類抗生素，抗癌譜較廣，能抑制腫瘤細胞RNA和DNA的合成，可用于惡性淋巴瘤、乳腺癌、肺癌、膀胱癌等的臨床治療[1]。然而臨床實踐顯示，DOX具有心臟毒性、骨髓造血功能障礙等毒副作用，且以心臟毒性最為顯著，嚴重時會引發心力衰竭（heart failure，HF）。研究指出，蒽環類藥物的心臟毒性與藥物累積劑量密切相關：當累積劑量為400 mg/m2時，HF 的發生風險為3%～5%；當累積劑量為550 mg/m2時，HF的發生風險可達7%～26%，嚴重影響患者預后[2]。因此，降低蒽環類藥物的心臟毒性、開發更安全高效的保護劑具有重要臨床意義。

銀杏黃酮苷元（ginkgo flavone aglycone，GA）是一種銀杏黃酮苷類提取物，可通過酶水解法獲取，主要包括槲皮素、山柰酚和異鼠李素等成分。研究表明，上述成分均具有抗腫瘤、抗氧化和保護心腦血管系統等多種藥理活性[3―4]。本課題組前期體內、體外實驗初步證實，GA 對DOX 具有“增效減毒”作用，并可明顯減輕DOX的心臟毒性[5]，但相關機制尚不清楚。

代謝組學（metabolomics）可反映生物體內所有小分子（分子量＜1 000 Da）物質在外界干預或病理條件下的動態變化規律，進而有助于闡釋藥物代謝物與疾病之間的調控關系[6]。因該技術能全面監測內源性代謝物的變化，并將代謝紊亂與生物表型變化相互關聯，與中藥多成分、多靶點的治療特征相符，故被廣泛應用于中醫藥研究領域[7]?；诖?，在初步證實GA 能顯著減輕DOX心臟毒性這一作用的基礎上，本研究擬采用具有掃描范圍廣、靈敏度和分辨率高、專屬性強等優點的超高效液相色譜-四極桿靜電場軌道阱串聯質譜（UHPLC-QExactive Orbitrap HRMS，以下簡稱“UHPLC-MS/MS”）技術檢測小鼠心臟組織的代謝物，篩選差異代謝物（differentially expressed metabolites，DEMs）并分析相關代謝通路，以期闡明GA 減輕DOX 心臟毒性的可能機制，為GA的開發應用奠定基礎。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括配備Q Exactive Plus型高分辨質譜儀的Vanquish 型UHPLC 系統、Forma 905-ULTS1490型醫用低溫冰箱、Variskan Lux型多功能酶標儀（美國Thermo Fisher Scientific 公司），ALLEGRA X-30R型離心機（美國Beckman Coulter公司），6KQ-300DE型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

鹽酸多柔比星原料藥（批號NO625A，純度＞98%）購自大連美侖生物科技有限公司；GA（槲皮素、山柰酚、異鼠李素含量分別為47.28%、43.42%、1.93%）由貴州省生化工程中心何珺副教授惠贈；羧甲基纖維素鈉（CMCNa）購自北京索萊寶科技有限公司；天冬氨酸轉氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）、肌酸激酶（creatine kinase，CK）、肌酸激酶同工酶（creatine kinase isoenzyme，CK-MB）試劑檢測盒（批號分別為20210708、20210722、20210710、20210709）均購自南京建成生物工程研究所；甲醇、乙腈為質譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

1.3 實驗動物

SPF級雄性ICR小鼠，體重18～22 g，購自長沙市天勤生物技術有限公司，動物生產許可證號為SCXK（湘）2022-0011。所有動物均飼養于溫度18～25 ℃、相對濕度50%～70%的環境中，適應性飼養1 周后進行實驗。本研究嚴格遵循動物實驗的相關要求及規則，具體實驗方案經貴州醫科大學實驗動物倫理委員會審核批準（編號2101200）。

2 方法

2.1 藥效學研究

將小鼠隨機分為對照組（CON 組）、模型組（DOX組）、GA+DOX 組（GDOX 組），每組12 只。根據前期研究[5]，CON 組小鼠尾靜脈注射生理鹽水0.25 mL，隔天1次；DOX組小鼠尾靜脈注射DOX藥液（以生理鹽水為溶劑）3 mg/kg，隔天1 次，累積劑量為21 mg/kg；GDOX 組小鼠灌胃GA 混懸液（以0.5%CMC-Na 溶液為溶劑）100 mg/kg，每天1 次+尾靜脈注射DOX 藥液3 mg/kg，隔天1次，連續15 d。給藥期間，隔天監測各組小鼠的體重變化，觀察其精神狀態和飲食量，并繪制體重變化曲線。末次給藥后2 h，各組小鼠摘眼球取血，于室溫下靜置30 min后，于4 ℃下以3 000 r/min離心15 min，收集上層血清，于－80 ℃保存。隨機選取各組6 只小鼠的血清樣品，按照相應試劑盒說明書方法操作，使用多功能酶標儀檢測其中AST、CK、CK-MB、LDH 水平，再次驗證模型是否復制成功并評價GA的干預效果。

2.2 代謝組學分析

2.2.1 心臟組織代謝物提取及樣品處理

（1）心臟組織樣品采集：取血后，各組小鼠脫頸椎處死，立即取下心臟，用提前預冷的生理鹽水沖洗干凈，再以液氮速凍后，轉移至－80 ℃冰箱中保存，備用。

（2）極性成分提?。号R用前，將心臟組織于4 ℃下解凍，冰上剪碎后，稱取樣品50 mg 置于2 mL EP 管中，加入預冷的50%甲醇1.5 mL，于冰浴中勻漿，制備組織勻漿液。取該組織勻漿液，于4 ℃下以12 000 r/min 離心15 min，取上清液，以氮氣流吹干，即得極性成分，于－80 ℃下保存，備測。

（3）非極性成分提?。喝∩鲜鰳O性成分提取離心時所得殘渣，加入預冷的二氯甲烷-甲醇混合溶液（體積比3∶1）1.5 mL 重懸，于冰浴中勻漿，制備組織勻漿液。取該組織勻漿液，于4 ℃下以12 000 r/min 離心15 min，取上清液，以氮氣流吹干，即得非極性成分，于－80 ℃下保存，備測。

（4）樣品處理：進樣分析前，取上述極性、非極性成分樣品分別用50%甲醇120 μL 復溶，以12 000 r/min離心15 min后，取上清液，合并混勻，即得單只小鼠待測樣品，備測。

2.2.2 UHPLC-MS/MS分析條件

色譜條件如下：以Hypersil Gold（2.1 mm×100 mm，1.9 μm）為色譜柱，以0.1%甲酸水溶液為流動相A、0.1%甲酸乙腈溶液為流動相B 進行梯度洗脫（0～3 min，99%A；3～5 min，99%A→55%A；5～13 min，55%A→20%A；13～15 min；20%A→1%A；15～18 min，1%A；18～18.5 min，1%A→99%A；18.5～22 min，99%A）；柱溫為40 ℃；流速為0.3 mL/min；進樣體積為3 μL。

質譜條件如下：采用電噴霧電離源（electrospray ionization，ESI）進行正、負離子掃描，掃描范圍為m/z70～1 050；全掃描（full MS）分辨率為70 000，二級掃描（MS/MS）分辨率為17 500；鞘氣流量為35 arb，輔助氣體流量為10 arb；毛細管溫度為320 ℃；碰撞電壓（多級模式）為20、40、60 V；噴霧電壓為3.5 kV（正離子）和2.5 kV（負離子）。

2.2.3 代謝輪廓分析

取CON 組、DOX 組、GDOX 組小鼠的心臟組織樣品，按“2.2.1”項下方法提取、處理后，再按“2.2.2”項下條件進樣檢測，記錄色譜和質譜信息。利用Compound Discover 3.2 軟件對3 組小鼠心臟組織樣品的原始數據進行色譜峰提取、定位和峰面積歸一化處理等，獲取各代謝物的分子量、保留時間（retention time，RT）和峰面積等信息。以各代謝物的峰面積（需進行降維處理）為變量，采用SIMCA 13.0軟件進行主成分分析（principal component analysis，PCA），以直觀展示各組樣品的差異性。

2.2.4 DEMs篩選

為進一步分析組間差異并實現樣品的有效分離，以各代謝物的峰面積（需進行降維處理）為變量，采用SIMCA 13.0 軟件進行正交偏最小二乘-判別分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLSDA），以變量重要性投影（variable importance in the projection，VIP）值≥1、峰面積差異倍數（fold change，FC）＞1且P＜0.05為標準[8]篩選DEMs。

2.2.5 生物學分析

借助HMDB 數據庫（http：//www.hmdb.ca/metabolites）、PubChem 數據庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）、KEGG 數據庫（https：//www.kegg.jp/）和LIPID MAPS數據庫（https：//www.lipidmaps.org/）對所得DEMs進行匹配，然后通過火山圖、聚類熱圖對DEMs 進行展示；運用MetaboAnalyst 5.0 在線工具（https：//www.metaboanalyst.ca/），以P＜0.05 作為篩選條件，對DEMs進行通路富集分析，并進一步闡釋關鍵代謝物（即實際檢測到且與所得富集代謝通路相關的DEMs）的生物學意義。

3 結果

3.1 藥效學分析結果

實驗期間，CON 組小鼠毛發順滑，健康狀態良好；DOX組小鼠可見明顯的萎靡不振、毛發稀疏等癥狀，體重隨給藥次數增加整體呈下降趨勢，飲食及活動量減少；而GDOX組小鼠的精神狀態較DOX組有所改善，體重較DOX 組有所增加，飲食及活動量也隨之增加。各組小鼠的體重變化曲線見圖1A。

a：與CON組比較，P＜0.05；b：與DOX組比較，P＜0.05。圖1 各組小鼠體重及血清中AST、CK、CK-MB、LDH水平變化情況（±s）

與CON 組比較，DOX 組小鼠血清中AST、CK、CKMB、LDH 水平均顯著升高（P＜0.05）；與DOX 組比較，GDOX組小鼠血清中上述指標水平（CK-MB除外）均顯著降低（P＜0.05）。各組小鼠血清中AST、CK、CK-MB、LDH水平變化情況見圖1B。

3.2 代謝組學分析結果

3.2.1 代謝輪廓分析結果

PCA結果（圖2）顯示，CON組、DOX組、GDOX組小鼠心臟組織樣品能明顯區分，且組內樣品均能較好地聚集，說明3組代謝物明顯不同。

圖2 各組小鼠心臟組織樣品中代謝物的PCA得分圖

OPLS-DA結果（圖3）顯示，CON組與DOX組、DOX組與GDOX組小鼠心臟組織樣品均能完全分離，說明各組小鼠心臟組織中的代謝物存在明顯差異；采用置換檢驗對模型進行200 次排序驗證，所得R2Y（Y軸累積解釋率）和Q2（累積預測率）均低于右側原始值，且Q2與Y軸交于負半軸，說明模型可靠且不存在過擬合現象，模型擬合度和預測能力均較好[8]，可用于后續DEMs的篩選。

圖3 各組小鼠心臟組織樣品中代謝物的OPLS-DA 分析結果

3.2.2 DEMs篩選及分析結果

DOX 組與CON 組間有451 個DEMs，GDOX 組與DOX 組間有548 個DEMs（火山圖見圖4）。將上述DEMs 取交集，獲得163 個共有DEMs。進一步通過HMDB、PubChem、KEGG、LIPID MAPS 數據庫匹配，最終鑒定出37 個共有DEMs（表1）。其中，與CON 組比較，DOX 組發生變化而經GDOX 干預后顯著回調的DEMs 有25 個，包括DOX 組顯著上調而GDOX 組顯著下調的DEMs17個、DOX組顯著下調而GDOX組顯著上調的DEMs8個，提示GA可通過調節這些內源性代謝物來減輕DOX的心臟毒性（聚類熱圖見圖5）。

表1 DEMs的基本信息

圖4 各組小鼠心臟組織樣品中DEMs的火山圖

CON-1～CON-12：CON組小鼠心臟組織；DOX-1～DOX-12：DOX組小鼠心臟組織；GDOX-1～GDOX-12：GDOX組小鼠心臟組織。圖5 各組小鼠心臟組織樣品中DEMs的聚類熱圖

所得DEMs 主要涉及的代謝通路包括不飽和脂肪酸的生物合成、花生四烯酸代謝、亞油酸代謝、?；撬岷痛闻；撬岽x（表2）。通過對富集通路整合分析發現，GA 可能通過調控上述代謝通路中關鍵代謝物[二十二碳六烯酸、花生四烯酸、磷脂酰膽堿（16∶0/18∶3）和?；撬醈來減輕DOX 所引起的氧化應激、炎癥反應、脂質累積，從而減輕DOX的心臟毒性作用，機制示意圖見圖6。

表2 DEMs的主要代謝通路信息

橙色方框：DEMs可能參與調控的代謝通路；灰色方框：本研究未檢測到，但可能與代謝通路有關聯的代謝物；CYP2J2：細胞色素P450 2J2（cytochrome P450 2J2）；EETs：環氧二十碳三烯酸（epoxyeicosatrienoic acids）；藍色“↓”：與CON組比較，其代謝物在DOX組樣品中的表達有所降低；藍色“↑”：與CON組比較，其代謝物在DOX組樣品中的表達有所升高；紅色“↓”：與DOX組比較，其代謝物在GDOX組樣品中的表達有所降低；紅色“↑”：與DOX組比較，其代謝物在GDOX組樣品中的表達有所升高；（－）：減輕或抑制作用。圖6 DOX心臟毒性的作用機制示意圖

4 討論

DOX可用于治療多種實體瘤和血液惡性腫瘤，然而該藥的劑量依賴性心臟毒性嚴重影響了其臨床應用。近年來，越來越多的證據表明，中藥提取物及相關制劑聯合DOX 可減輕DOX 的心臟毒性[9]，但中藥具有多成分、多靶點的特點，其錯綜復雜的作用機制使其進一步開發、利用受限。目前，學者主要通過檢測疾病相關生化或病理指標來闡釋中藥對疾病的干預作用，但這些檢測手段難以體現中藥復雜、多樣的治療特點。代謝組學可動態監測生物體受干擾后內源性代謝物的變化情況，并可通過代謝物與疾病間的調控關系來揭示藥物治療疾病的潛在機制。因此，代謝組學是研究中藥、中藥提取物及相關制劑復雜作用及機制的有效手段之一。

本研究在前期實驗的基礎上，以DOX 誘導制備心臟毒性模型小鼠，并考察了各組小鼠血清中4種心肌酶（AST、CK、CK-MB、LDH）的變化情況。結果顯示，DOX導致小鼠上述指標顯著升高，提示小鼠心臟已經受損；以GA進行干預后，小鼠血清中上述指標（CK-MB除外）均顯著降低，說明GA 可減輕DOX 的心臟毒性。隨后，本研究采用UHPLC-MS/MS技術對3組小鼠心臟組織樣品進行代謝組學研究。結果顯示，本研究篩選出37個共有DEMs；與CON組比較，DOX組發生變化而GDOX組顯著回調的DEMs 有25 個。DEMs 富集的代謝通路包括不飽和脂肪酸的生物合成、花生四烯酸代謝、亞油酸代謝、?；撬岷痛闻；撬岽x，其關鍵代謝物包括二十二碳六烯酸、花生四烯酸、磷脂酰膽堿（16∶0/18∶3）和?；撬?。其中，與CON組比較，DOX組小鼠心臟組織中二十二碳六烯酸、花生四烯酸、磷脂酰膽堿（16∶0/20∶5）、磷脂酰膽堿（16∶0/18∶3）的表達均顯著下調；而經GA干預后，上述指標均顯著上調，提示這些代謝物可能是GA減輕DOX 心臟毒性的潛在靶點。此外，與CON 組比較，DOX組小鼠心臟組織中?；撬岬谋磉_升高；經GA干預后，小鼠心臟組織中?；撬岬谋磉_顯著下調，提示GA可能通過下調?；撬岬谋磉_來減輕DOX的心臟毒性。

二十二碳六烯酸是一種人體必需的ω-3多不飽和脂肪酸。研究表明，該成分可通過抑制脂質超載、減少細胞凋亡來提升脂質超載所致損傷細胞的活力；同時，該成分還可通過發揮抗氧化作用來減輕DOX致大鼠急性心肌梗死后的心肌纖維化程度[10]?；ㄉ南┧崾且环Nω-6多不飽和脂肪酸，可經CYP2J2酶代謝生成EETs；同時，DOX 可被CYP2J2 酶代謝生成7-脫氧多柔比星苷元，后者可通過競爭性結合CYP2J2 酶的活性位點而導致花生四烯酸介導的心肌損傷修復過程受阻[11]。磷脂酰膽堿亦稱卵磷脂，在心肌細胞中廣泛表達。DOX可使磷脂酰膽堿氧化生成氧化磷脂，該產物可影響線粒體中鈣離子變化及鐵死亡過程，從而引起細胞死亡[12]。研究指出，發生心肌梗死或HF時，機體磷脂酰膽堿代謝會出現紊亂；而磷脂酰膽堿可參與調控氧化應激、炎癥反應等過程，對心肌損傷有一定的改善作用[13]。?；撬崾且环Nβ-氨基酸，在心臟中含量較高。DOX可引起心臟組織中鐵水平升高而導致氧化應激的發生，而?；撬峥赏ㄟ^調節谷胱甘肽的表達來緩解鐵介導的心臟組織氧化應激，并可增強機體抗氧化作用以保護心臟組織免受DOX心臟毒性的損害[14]。

綜上所述，GA可能通過作用于二十二碳六烯酸、花生四烯酸、磷脂酰膽堿（16∶0/18∶3）和?；撬岬汝P鍵代謝物來調節不飽和脂肪酸的生物合成、花生四烯酸代謝、亞油酸代謝、?；撬岷痛闻；撬岽x途徑，進而減輕DOX的心臟毒性。