燈盞花素對肝纖維化大鼠的干預作用及機制 Δ

魏丹丹 ，李閃閃 ，張明昊 ，魏雨潤 ，王紅玲 ，柴爽爽 ，殷晶晶 ，張 敏 ，趙 菡 ，吳宗耀 ，朱奎成 ，王慶波 （.河南中醫藥大學第一附屬醫院針灸疼痛科，鄭州 0099；.河南中醫藥大學醫學院，鄭州 006；.河南中醫藥大學第三附屬醫院腫瘤科，鄭州 0006；.西藏藏醫藥大學藏醫藥與高原生物重點實驗室，拉薩 8000；.鄭州大學實驗動物中心，鄭州 0008）

肝纖維化（hepatic fibrosis，HF）是慢性肝病發展到肝硬化乃至肝癌的共同途徑[1―2]。當肝損傷發生時，受損的上皮細胞和纖維化組織可激活肝星狀細胞（hepatic stellate cells，HSCs），并使HSCs 轉化為肌成纖維細胞（myofibroblast，MFB）表型，合成大量肝細胞外基質（extracellular matrix，ECM），致使ECM合成與降解失衡，形成瘢痕組織，最終引發HF[3]。HF的西醫治療以抗病毒、調節免疫、保護肝臟、抗纖維化等為主，旨在消除或控制病因，減輕纖維化程度，但難以逆轉HF的發展進程[4]。

中醫學將HF 歸為“積聚”“脅痛”范疇[5]，濕、熱、瘀、毒為其主要致病因素，治療當以疏肝健脾、化瘀通絡、清熱化濕（毒）為主[6]。燈盞花素是從中藥燈盞花中提取的有效成分，具有祛風除濕、活血化瘀、通經活絡及抗氧化的作用，并能擴張血管，改善腦、心、肝微循環[7―8]。本課題組前期研究發現，燈盞花素可改善腎纖維化[9]。另有研究指出，燈盞花素可通過調控轉化生長因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）/Smad 通路來減輕急性心肌梗死大鼠的心室重構，提示TGF-β1可能是燈盞花素發揮藥效的潛在靶點[10]。TGF-β1是目前學界公認的致纖維化因子之一，可通過調控Smad 依賴及非依賴的胞外信號調節激酶（extracellular signal-regulated protein kinase，ERK）通路來協同調控ECM沉積，故抑制TGF-β1及其介導的相關通路則可延緩甚至逆轉纖維化進程[11]。Smad2 在TGF-β1/Smad 通路中具有重要作用，抑制肝細胞內Smad2的活化，能有效降低TGF-β1的表達，延緩HF的發生、發展；與此同時，ERK1 能通過磷酸化Smad2 來促進纖維化進展，提示TGF-β1/Smad2通路與ERK1之間存在信號交互作用[12]。Kelch 樣環氧氯丙烷相關蛋白1（Kelch-like epichlorohydrin-associated protein 1，Keap1）/核轉錄因子紅系2相關因子2（nuclear factor-erythroid 2-related factor 2，Nrf2）/血紅素加氧酶1（heme oxygenase-1，HO-1）通路是調控體內氧化應激的重要通路之一，可靶向多種抗氧化酶系，經轉錄活化后可清除過多的活性氧（reactive oxygen species，ROS），進而減輕ROS引起的心肌細胞損傷，在心血管疾病的治療中具有重要作用[13]。該通路中的Nrf2是抗氧化的關鍵調節因子，可調節多種抗氧化劑的表達，當氧化應激發生時，Nrf2 會與Keap1解離，進而抑制下游抗氧化酶HO-1的表達[13]?？紤]到燈盞花素的活血化瘀、抗氧化作用與中醫“祛瘀解毒”治療思路相符，且現代醫學肝腎纖維化的病機特點與中醫肝腎藏象理論基本一致，本研究擬以秋水仙堿為陽性對照藥物[14]，基于TGF-β1/Smad2/ERK1 和Keap1/Nrf2/HO-1 通路初步探討燈盞花素干預HF 的作用及潛在機制，以期為抗HF活性成分的挖掘提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有FlexA-200 型酶標儀（杭州奧盛儀器有限公司）、CX41 型光學顯微鏡（日本Olympus公司）、StepOneTMplus型實時熒光定量聚合酶鏈式反應（PCR）儀（美國ABI公司）、HY1508型石蠟切片機（金華惠友儀器設備有限公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

燈盞花素片（批號20220732，每片含燈盞花素20 mg）購自云南生物谷藥業股份有限公司；秋水仙堿片（批號210715，每片含秋水仙堿0.5 mg）購自西雙版納版納藥業有限責任公司；四氯化碳（CCl4，批號20210612）購自天津市富宇精細化工有限公司；羧甲基纖維素鈉（CMC-Na，批號20160704）購自國藥集團化學試劑有限公司；丙氨酸轉氨酶（alanine aminotransferase，ALT）試劑盒（批號C009-1-1）、天冬氨酸轉氨酶（aspartate aminotransferase，AST）試劑盒（批號C010-1-1）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒（批號A001-1-2）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒（批號A003-1-2）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSHPx）試劑盒（批號A005-1-2）均購自南京建成生物工程研究所；兔免疫組化試劑盒（批號SP-9001），DAB 顯色試劑盒（批號ZLI-9018），兔抗大鼠TGF-β1、Smad2、ERK1、Keap1、Nrf2、HO-1抗體（批號分別為GB13028、GB11511、GB13003、GB11847、GB113808、GB11104），辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG 二抗（批號G1213-100UL），TriQuick 總RNA 提取試劑（批號R1100），cDNA 合成試劑盒（批號G3330），實時熒光定量PCR 擴增試劑（批號G3320）均購自武漢賽維爾生物科技有限公司。

1.3 實驗動物

SPF 級健康SD 大鼠60 只，雌雄各半，體重180～200 g，由鄭州市惠濟區華興實驗動物養殖場提供，動物生產許可證號為SCXK（豫）2019-0002。所有動物均飼養于河南中醫藥大學醫學機能實驗室（室溫20～22 ℃，相對濕度55%～60%，正常光照），自由飲水、采食。本實驗方案獲河南中醫藥大學第一附屬醫院倫理委員會批準（編號DWLL202201010）。

2 方法

2.1 分組、造模與給藥

將60只大鼠按隨機數字表法分為正常對照組，模型組，燈盞花素低、中、高劑量組（5.4、10.8、21.6 mg/kg）和秋水仙堿組（陽性對照，0.45 mg/kg），每組10只，雌雄各半。除正常對照組外，其余各組大鼠均按1 mL/kg 腹腔注射50%CCl4-橄欖油溶液，每周2次，連續4周。若大鼠血清中ALT、AST 水平顯著升高，且肝組織可見明顯纖維化病變和炎癥細胞浸潤，則表明HF 模型復制成功[1，13]。造模后，燈盞花素低、中、高劑量組大鼠分別灌胃相應混懸液[以0.1%CMC-Na 溶液為溶劑；根據成人（70 kg）劑量120 mg換算得大鼠中劑量10.8 mg/kg，再分別以中劑量的1/2、2 倍作為低、高劑量]，秋水仙堿組大鼠灌胃相應混懸液[以0.1%CMC-Na 溶液為溶劑；根據成人（70 kg）劑量5 mg 換算得大鼠劑量0.45 mg/kg]，灌胃體積均為10 mL/kg；正常對照組、模型組大鼠灌胃等體積0.1%CMC-Na溶液；每天1次，連續28 d。

2.2 樣本采集

末次給藥24 h 后，稱取各組大鼠體重，麻醉后于腹主動脈取血，血樣于常溫下靜置1～2 h，低溫離心，取上層血清，于－80 ℃下儲存，備用。取血后，脫頸椎處死各組大鼠并剖取肝臟，去除周圍組織，以生理鹽水洗滌，觀察其外觀形態，用濾紙吸盡其表面液體后稱重；隨后，將肝臟一分為二，其中一份用4%多聚甲醛固定，另一份用液氮速凍后于－80 ℃下儲存，備用。

2.3 大鼠肝臟系數檢測

根據大鼠體重、肝臟質量，按下式計算各組大鼠的肝臟系數：肝臟系數＝肝臟質量/體重。

2.4 大鼠血清中ALT、AST水平檢測

采用酶聯免疫吸附測定（ELISA）法檢測。取“2.2”項下各組大鼠血清樣品適量，按照相應試劑盒說明書方法操作，以酶標儀檢測血清中ALT、AST水平。

2.5 大鼠肝組織中ALT、AST、SOD、MDA、GSH-Px 水平檢測

采用ELISA 法檢測。稱取“2.2”項下各組大鼠凍存的肝組織適量，加入冰生理鹽水0.9 mL 制備10%勻漿液，以3 000 r/min離心10 min，取上清液適量，按照相應試劑盒說明書方法操作，以酶標儀檢測肝組織中ALT、AST、SOD、MDA、GSH-Px水平。

2.6 大鼠肝組織病理形態學觀察

取“2.2”項下各組大鼠固定好的肝組織，經脫水、透明、包埋后，切片，進行常規蘇木精-伊紅（HE）染色，置于顯微鏡下觀察肝組織病理變化。同法制作切片，進行Masson 染色，置于顯微鏡下觀察肝組織纖維化情況，并采用Image-Pro Plus 6.0軟件檢測Masson染色陽性（呈藍色）面積百分比（即陽性面積與總面積的百分比值），用以評價肝組織的纖維化水平。

2.7 大鼠肝組織中TGF-β1、Smad2、ERK1、Nrf2、Keap1、HO-1蛋白表達水平檢測

采用免疫組化法檢測。取“2.6”項下各組大鼠的肝組織切片，經脫蠟、水化、封閉（H2O2）、清洗、抗原修復（檸檬酸鹽緩沖液）后，滴加山羊血清封閉液，室溫孵育；棄去上清液，分別滴加TGF-β1、Smad2、ERK1、Nrf2、Keap1、HO-1 一抗（稀釋比例均為1∶1 000），4 ℃孵育過夜；加入相應二抗（稀釋比例為1∶100），常溫孵育20～30 min，以DAB 顯色；沖洗后，以蘇木精復染，再以鹽酸乙醇溶液分化；沖洗后，脫水、透明、封片，置于顯微鏡下觀察，并采用Image-Pro Plus 6.0 軟件檢測陽性（呈棕黃色）區域的積分光密度（integrated optical density，IOD）值，用以評價目的蛋白的表達水平。

2.8 大鼠肝組織中TGF-β1、Smad2、ERK1、Nrf2、Keap1、HO-1 mRNA表達水平檢測

采用實時熒光定量PCR法檢測。取“2.2”項下各組大鼠凍存的肝組織適量，加入TriQuick 試劑1 mL，充分研磨勻漿后提取總RNA 并檢測RNA 濃度及純度。按cDNA 合成試劑盒說明書方法操作，合成cDNA；以此cDNA 為模板，進行PCR 擴增。反應體系（共15 μL）包括cDNA 模板2 μL，上、下游引物共1.5 μL，2×qPCR Mix 7.5 μL，無核酸酶水4 μL。擴增條件如下：95 ℃預變性10 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40 個循環。反應結束后，根據擴增曲線及熔解曲線判斷擴增結果，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）為內參，采用2－ΔΔCt法計算目的基因的相對表達水平（結果以正常對照組為參照進行歸一化處理）。PCR引物序列及擴增產物片段長度見表1。

表1 引物序列及擴增產物片段長度

2.9 統計學方法

采用SPSS 24.0軟件對數據進行統計分析。計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗（方差齊）或Dunnett檢驗（方差不齊）。檢驗水準α＝0.05。

3 結果

3.1 大鼠肝臟外觀形態觀察結果

正常對照組大鼠肝臟形態正常，外觀紅潤；模型組大鼠肝臟稍增大，顏色深，可見大面積白色結節灶；秋水仙堿組和燈盞花素低、中、高劑量組大鼠肝臟顏色較模型組淺，白色結節灶面積有所縮小。結果見圖1。

圖1 各組大鼠肝臟外觀形態圖

3.2 大鼠肝臟系數檢測結果

與正常對照組比較，模型組大鼠的體重顯著降低，而肝臟系數顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，秋水仙堿組、燈盞花素高劑量組大鼠的肝臟質量和各藥物組大鼠的肝臟系數均顯著降低（P＜0.05）。結果見表2。

表2 各組大鼠體重、肝臟質量和肝臟系數的檢測結果（±s，n＝10）

表2 各組大鼠體重、肝臟質量和肝臟系數的檢測結果（±s，n＝10）

a：與正常對照組比較，P＜0.05；b：與模型組比較，P＜0.05。

組別正常對照組模型組秋水仙堿組燈盞花素低劑量組燈盞花素中劑量組燈盞花素高劑量組體重/g 279.22±14.60 202.17±50.27a 223.17±32.07 222.33±64.32 235.83±38.77 237.50±16.63肝臟質量/mg 10 455.93±484.11 11 705.33±3 139.52 8 612.87±1 401.42b 10 899.48±3 149.85 10 635.57±1 579.16 9 969.07±701.04b肝臟系數/（mg/g）37.47±1.12 57.79±3.98a 38.57±1.97b 49.21±2.35b 45.20±1.20b 41.98±0.92b

3.3 大鼠血清及肝組織中ALT、AST水平檢測結果

與正常對照組比較，模型組大鼠血清及肝組織中ALT、AST水平均顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，各藥物組大鼠血清及肝組織中ALT（燈盞花素低劑量組肝組織除外）、AST 水平均顯著降低（P＜0.05）。結果見表3。

表3 各組大鼠血清及肝組織中ALT、AST 水平的檢測結果（±s，n＝10）

a：與正常對照組比較，P＜0.05；b：與模型組比較，P＜0.05。

組別正常對照組模型組秋水仙堿組燈盞花素低劑量組燈盞花素中劑量組燈盞花素高劑量組血清ALT/（U/L）28.78±5.35 167.87±11.79a 38.26±4.24b 74.08±7.69b 61.24±7.96b 38.62±2.92b AST/（U/L）131.22±7.44 362.29±27.17a 140.46±7.06b 269.43±41.96b 168.98±8.73b 148.52±4.89b肝組織ALT/（U/L）207.87±16.82 371.53±6.64a 277.85±18.38b 359.32±2.35 348.86±11.11b 315.53±8.44b AST/（U/L）129.17±6.85 506.00±83.80a 156.60±4.53b 334.41±50.54b 213.23±13.84b 165.67±12.82b

3.4 大鼠肝組織中SOD、MDA、GSH-Px水平檢測結果

與正常對照組比較，模型組大鼠肝組織中SOD、GSH-Px 水平均顯著降低，MDA 水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，各藥物組大鼠肝組織中SOD、GSH-Px 水平均顯著升高，MDA 水平均顯著降低（P＜0.05）。結果見表4。

表4 各組大鼠肝組織中SOD、MDA、GSH-Px 水平的檢測結果（±s，n＝10）

表4 各組大鼠肝組織中SOD、MDA、GSH-Px 水平的檢測結果（±s，n＝10）

a：與正常對照組比較，P＜0.05；b：與模型組比較，P＜0.05。

組別正常對照組模型組秋水仙堿組燈盞花素低劑量組燈盞花素中劑量組燈盞花素高劑量組SOD/（U/mg）273.08±10.33 213.90±18.61a 279.57±4.89b 253.06±1.58b 268.21±7.13b 282.68±11.00b MDA/（nmol/mg）3.87±0.61 11.42±1.36a 3.86±0.48b 8.57±0.58b 5.95±0.80b 4.31±0.70b GSH-Px/（U/mL）759.44±71.25 262.27±28.97a 709.10±77.66b 446.40±40.02b 586.76±61.34b 694.41±98.19b

3.5 大鼠肝組織病理形態學觀察結果

HE 染色結果顯示，正常對照組大鼠肝細胞圍繞中央靜脈呈放射狀排列，形態正常，未見炎癥細胞浸潤；模型組大鼠肝細胞排列紊亂，呈空泡狀脂肪變性，細胞間纖維結締組織增生，呈條狀纖維間隔，可見大量炎癥細胞浸潤；燈盞花素低劑量組大鼠肝細胞大量空泡狀變性，細胞間有少量纖維組織增生；燈盞花素中、高劑量組和秋水仙堿組大鼠肝細胞排列基本正常，細胞間纖維組織少，未見明顯炎癥細胞浸潤，病變程度有所緩解。Masson 染色結果顯示，正常對照組大鼠肝小葉結構完整，僅在肝靜脈管壁周有少量藍色膠原纖維沉積；模型組大鼠肝小葉結構遭到破壞，肝靜脈與匯管區周圍可見廣泛而致密的藍色膠原纖維沉積，并延伸形成纖維間隔；各藥物組大鼠肝組織纖維化改變均有不同程度緩解。與正常對照組[（9.70±0.92）%]比較，模型組大鼠肝組織Masson 染色陽性面積百分比[（35.03±1.12）%]顯著增加（P＜0.05）；與模型組比較，秋水仙堿組和燈盞花素低、中、高劑量組大鼠肝組織Masson染色陽性面積百分比[（13.66±2.33）% 、（14.25±0.68）% 、（11.51±1.80）%、（8.97±1.31）%]均顯著減?。≒＜0.05）。結果見圖2。

黑色箭頭：炎癥細胞浸潤區域或膠原纖維聚集區域。圖2 各組大鼠肝組織病理形態觀察的顯微圖（標尺＝5 μm）

3.6 大鼠肝組織中TGF-β1、Smad2、ERK1、Nrf2、Keap1、HO-1蛋白表達水平檢測結果

與正常對照組比較，模型組大鼠肝組織中可見大量TGF-β1、Smad2、ERK1、Keap1 蛋白陽性表達，其陽性區域IOD值均顯著升高（P＜0.05）；可見少量Nrf2、HO-1蛋白陽性表達，其陽性區域IOD值均顯著降低（P＜0.05）。與模型組比較，各藥物組大鼠肝組織中TGF-β1、Smad2、ERK1、Keap1 蛋白陽性表達均有所減少，其陽性區域IOD值均顯著降低（P＜0.05）；Nrf2、HO-1蛋白陽性表達均有所增加，其陽性區域IOD值均顯著升高（P＜0.05）。結果見圖3（以TGF-β1、Nrf2蛋白為例）、表5。

黑色箭頭：目的蛋白陽性表達區域。圖3 各組大鼠肝組織中TGF-β1、Nrf2蛋白表達的免疫組化圖（標尺＝5 μm）

表5 各組大鼠肝組織中TGF-β1、Smad2、ERK1、Nrf2、Keap1、HO-1 蛋白表達水平的檢測結果（±s，n＝10）

表5 各組大鼠肝組織中TGF-β1、Smad2、ERK1、Nrf2、Keap1、HO-1 蛋白表達水平的檢測結果（±s，n＝10）

a：與正常對照組比較，P＜0.05；b：與模型組比較，P＜0.05。

組別正常對照組模型組秋水仙堿組燈盞花素低劑量組燈盞花素中劑量組燈盞花素高劑量組TGF-β1（×102）893.63±3.45 1 732.32±1.49a 825.44±3.93b 803.84±2.05b 794.30±3.48b 794.57±0.66b Smad2（×102）885.44±2.83 1 641.08±2.65a 842.21±3.49b 882.69±2.07b 791.98±1.32b 778.12±1.19b ERK1（×102）884.84±2.35 2 238.45±3.20a 844.56±3.39b 1 036.74±10.64b 944.77±2.32b 903.77±2.87b Nrf2（×102）844.60±2.79 205.74±2.94a 827.52±2.67b 766.92±3.48b 874.26±3.13b 893.56±3.19b Keap1（×102）875.54±2.73 5 426.68±27.04a 957.10±1.76b 935.81±2.01b 926.22±3.20b 963.18±2.19b HO-1（×102）1 035.10±3.40 466.01±2.16a 1 203.21±2.74b 1 086.45±3.20b 1 155.17±2.81b 1 117.90±3.29b

3.7 大鼠肝組織中TGF-β1、Smad2、ERK1、Nrf2、Keap1、HO-1 mRNA表達水平檢測結果

與正常對照組比較，模型組大鼠肝組織中TGF-β1、Smad2、ERK1、Keap1 mRNA 表達水平均顯著升高，Nrf2、HO-1 mRNA表達水平均顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，各藥物組大鼠肝組織中TGF-β1、Smad2、ERK1、Keap1 mRNA 表達水平均顯著降低，Nrf2、HO-1（燈盞花素低劑量組除外） mRNA水平均顯著升高（P＜0.05）。結果見表6。

表6 各組大鼠肝組織中TGF-β1、Smad2、ERK1、Nrf2、Keap1、HO-1 mRNA表達水平的檢測結果（±s，n＝10）

表6 各組大鼠肝組織中TGF-β1、Smad2、ERK1、Nrf2、Keap1、HO-1 mRNA表達水平的檢測結果（±s，n＝10）

a：與正常對照組比較，P＜0.05；b：與模型組比較，P＜0.05。

組別正常對照組模型組秋水仙堿組燈盞花素低劑量組燈盞花素中劑量組燈盞花素高劑量組TGF-β1 1 2.51±0.84a 0.20±0.13b 0.54±0.37b 0.76±0.21b 0.52±0.17b Smad2 1 2.36±0.26a 0.47±0.19b 0.32±0.08b 0.28±0.04b 0.33±0.10b ERK1 1 3.64±0.73a 0.54±0.18b 0.57±0.14b 0.49±0.14b 0.56±0.19b Nrf2 1 0.22±0.03a 0.80±0.22b 0.20±0.03 0.84±0.08b 1.34±0.33b Keap1 1 2.66±0.24a 0.61±0.12b 0.15±0.03b 0.38±0.06b 0.39±0.04b HO-1 1 0.59±0.04a 1.57±0.31b 0.83±0.14 1.69±0.43b 1.98±0.40b

4 討論

HF 是肝臟功能減退的關鍵環節，動物模型可由化學誘導、飲食誘導、手術和病毒感染等途徑構建，其中由CCl4誘導構建的HF模型應用較為廣泛。CCl4對嚙齒類動物具有廣泛的肝臟毒性，可通過灌胃或腹腔注射的方式進入機體，由門靜脈入肝后被肝細胞吸收，從而使細胞膜磷脂分子過氧化，引起肝細胞壞死和炎癥反應；同時，CCl4還可作用于HSCs，使其活化并轉化為MFB，MFB大量增殖并合成ECM，使得ECM在短時間內成倍堆積，從而形成HF[15]。研究表明，CCl4誘導構建的HF模型具有造模周期短、可靠性強、重復性高的優點，與人類HF的病理改變較為一致，可用于HF的發病機制研究及藥物篩選[5]。

HF 是各種慢性肝病發展的常見病理過程，對該過程進行干預是治療慢性肝病、防止其轉化為肝硬化和肝癌的重要環節。研究指出，除晚期肝硬化外的多種慢性肝病的纖維化均可逆[15]。本研究基于HF 濕、熱、瘀、毒損傷肝絡，導致氣機不暢、瘀血絡阻的病機特點，以秋水仙堿為陽性對照藥物，初步考察燈盞花素對HF 的干預作用?？紤]到秋水仙堿可在抗纖維化過程中下調肝組織中TGF-β1的表達，上調Nrf2的表達，可作為TGF-β1抑制劑和Nrf2 激動劑，故本研究將其作為陽性對照藥物[16―17]。

本研究結果顯示，低、中、高劑量的燈盞花素能不同程度地縮小肝臟白色結節灶，降低HF 大鼠血清和肝組織中ALT、AST 水平和肝臟指數，提示燈盞花素能有效延緩HF 進展，具有較好的肝保護作用；同時，病理染色觀察結果顯示，經燈盞花素干預后，HF大鼠肝細胞排列趨于正常，細胞間纖維組織和炎癥細胞浸潤減少，且Masson染色陽性面積百分比較模型組顯著降低，提示該成分能減輕HF 大鼠肝組織的炎癥反應，并改善其纖維化損傷。

TGF-β1蛋白是纖維化的主要因子，與HF的發生、發展密切相關；Smad2 作為TGF-β1下游調節因子，可通過磷酸化來促進TGF-β1介導的HF[18]。ERK 已被證實是TGF-β1誘導纖維化的重要分子[19]，而TGF-β1又能反向促進ERK1 的磷酸化，進而導致纖維化的發生[20]。本研究結果顯示，TGF-β1、Smad2、ERK1蛋白及mRNA在HF大鼠肝組織中呈高表達；經燈盞花素干預后，HF大鼠肝組織中TGFβ1、Smad2、ERK1 蛋白及mRNA 的表達水平均顯著降低，說明該成分的HF抑制作用可能與抑制TGFβ1/Smad2/ERK1通路有關。

氧化應激是體內氧化與抗氧化作用失衡的一種狀態，能促進動脈硬化和纖維化的進程。研究證實，受Keap1/Nrf2/HO-1 通路調控的氧化應激相關指標SOD、GSH-Px、MDA 與HF 的發生、發展密切相關[13，21]。本研究結果顯示，SOD和GSH-Px在HF大鼠肝組織中呈低表達，MDA 則呈高表達，說明CCl4誘導的HF 與氧化應激相關；經燈盞花素干預后，HF大鼠肝組織中SOD、GSHPx水平均顯著升高，MDA水平均顯著降低，提示該成分具有較好的抗氧化應激作用。進一步研究結果顯示，Keap1 蛋白及mRNA 在HF 大鼠肝組織中呈高表達，Nrf2、HO-1蛋白及mRNA則呈低表達，提示Keap1/Nrf2/HO-1 通路與CCl4誘發HF 相關；經燈盞花素干預后，HF大鼠肝組織中Keap1 蛋白及mRNA 的表達水平均顯著降低，Nrf2、HO-1蛋白及mRNA的表達水平均有不同程度升高，說明該成分能通過調控Keap1/Nrf2/HO-1 通路來改善大鼠的氧化應激，從而抑制HF的進展。

綜上所述，燈盞花素對大鼠HF有較好的干預作用，其作用可能與抑制TGF-β1/Smad2/ERK1 通路來抗纖維化，調控Keap1/Nrf2/HO-1通路來抑制氧化應激有關。