基于IL-6/JAK2/STAT3信號通路探討灰樹花提取物對潰瘍性結腸炎大鼠結腸組織炎癥反應的影響

金雪 馬賢德 趙卓 徐銘 王建光 杜晗 關洪全 韓曉偉 （遼寧中醫藥大學，沈陽 110847）

潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種好發于結腸的自身免疫性疾病，其特點為反復發作的黏膜粘連性炎癥［1］。我國UC的患病率已高達11.6/100 000，若UC患者不能得到及時有效的治療，其患結、直腸癌的風險將大大增加，嚴重威脅患者生命健康［2-3］。目前普遍認為UC的致病因素與自身免疫系統異常、炎癥相關因子高表達以及腸道微生物群間的平衡紊亂等有關。西醫治療UC的常用藥物有柳氮磺吡啶、氨基水楊酸鹽類藥物、免疫調節劑等。盡管上述藥物被國際社會所普遍認可，但這些藥物對機體產生的副作用與不良反應通常較大。調查顯示，幾乎50%UC患者都經歷過皮質類固醇相關的不良事件，如痤瘡、失眠、情緒障礙、葡萄糖不耐受和消化不良等，長期用藥也會提高UC患者罹患慢性疾病或造成肝毒性的風險［4］。有限的臨床治療效果與多發的副作用及不良反應正促使人們努力開發新的治療手段與藥物。

灰樹花（Grifola frondosa）屬真菌科，為一種藥食兩用菌，作為中藥材的一種，灰樹花性平味甘，具有很好的補脾生肌、扶正祛邪之功效，可有效治療臨床以正氣不足、脾陽虛衰、外邪入侵等為主要病機的疾病，且其具有明顯的改善機體免疫功能、抑制腫瘤生長等作用［5-7］?；覙浠ㄖ兴奶烊换衔镞€可消除全身炎癥反應［8］，同西藥相比，灰樹花藥性具有更加溫和、無毒副作用，可從改善患者自身免疫力這一根本方向入手達到治療目的，這些為臨床使用灰樹花治療UC提供了依據與可能。白細胞介素6（interleukin-6，IL-6）/蛋白酪氨酸激酶2（Janus kinase 2，JAK2）/信號轉導和激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）信號通路是參與體內炎癥反應的重要通路，且對機體免疫調節發揮關鍵作用［9-10］。近年有研究表明，IL-6/JAK2/STAT3通路相關因子在UC患者體內表達明顯上調，證實此通路與UC發病存在密切聯系［11］。但目前鮮有文獻報道灰樹花提取物對UC大鼠炎癥反應影響的具體作用機制，本研究以IL-6/JAK2/STAT3信號通路為切入點，探究灰樹花提取物治療UC的分子機制，旨在為臨床治療UC提供可靠的理論和實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 6～8周齡雄性SPF級SD大鼠共40只，體質量200～240 g，購于遼寧長生生物技術股份有限公司，動物合格證號：SCXK（遼）2020-0001，本研究經遼寧中醫藥大學實驗動物倫理委員會審查批準，倫理審查編號：21000042022086。動物飼養條件：溫度20～25 ℃，相對濕度50%～60%。

1.1.2 實驗試劑與儀器 灰樹花提取物（浙江方格藥業有限公司）；柳氮磺吡啶（上海信誼天平藥業有限公司，批號：09220802）；葡聚糖酸鈉鹽（DSS）（美侖云細胞生物科技有限公司，批號：O1031C）；HE染色試劑盒（碧云天生物科技有限公司，批號：C0105S）；IL-6抗體、JAK2抗體（碧云天生物科技有限公司，批號：AF7236、AF1489）；STAT3抗體、p-STAT3抗體（艾博抗貿易有限公司，批號：ab30647、ab267373）；IL-6R、MPO抗體（武漢賽維爾生物科技有限公司，批號：GB11117-100、GB111237-100）；ELISA試劑盒（安迪華泰生物科技有限公司，批號：AD202304）。RM2016型病理切片機（上海徠卡儀器有限公司）；KD-P型組織攤片機（浙江省金華市科迪儀器設備有限公司）；MV-100型渦旋混勻儀（武漢賽維爾生物科技有限公司）；Power Pac 1645050型電泳儀（美國Bio-Rad公司）；1704150型轉膜儀（美國Bio-Rad公司）；Tanon-5200型顯影儀（上海天能科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 動物分組 將40只大鼠隨機分為5組，即空白對照組、UC模型組、灰樹花治療組、西藥治療組、聯合治療組，每組8只。

1.2.2 造模方法 采用3%DSS水溶液自由飲用法建立UC大鼠模型［12］。將DSS溶于蒸餾水，配制成3%DSS水溶液，實驗第1天開始，除空白對照組外，其余4組大鼠每日均給予足量的3%DSS水溶液自由飲用，連續7 d?？瞻讓φ战M大鼠給予等量純凈水自由飲用。造模期間持續觀察并記錄各組大鼠一般狀態及體質量、糞便性狀等變化情況。造模結束后，使用糞便隱血試劑盒分別檢測各組大鼠便隱血情況。若大鼠出現精神萎靡、體質量降低、黏液膿

血便等表現，且便隱血試驗呈陽性，則每組隨機取1只大鼠處死，觀察結腸組織病理改變，如有糜爛、潰瘍、炎癥細胞浸潤等病理學變化，表明造模成功。

1.2.3 給藥方法 實驗第8天（造模成功后）起，依據人與大鼠等效給藥劑量比值計算大鼠灌胃劑量［13］，灰樹花治療組給予灰樹花提取物10 mg/（kg·d），西藥治療組給予柳氮磺吡啶0.3 g/（kg·d），聯合治療組同時給予灰樹花提取物10 mg/（kg·d）和柳氮磺吡啶0.3 g/（kg·d），連續14 d?？瞻讓φ战M和UC模型組灌胃等量生理鹽水。

1.2.4 取材方法 藥物治療14 d后所有大鼠禁食24 h，實驗第22天，使用1%戊巴比妥麻醉大鼠，取腹主動脈血，3 500 r/min 離心15 min，收集上清；處死大鼠后，取結腸組織分別置于液氮及4%多聚甲醛溶液中固定。

1.2.5 大鼠一般狀態及疾病活動指數（DAI）評分 實驗第1天開始，每日觀察并記錄各組大鼠的一般狀態，隔日測量并記錄大鼠體質量、糞便性狀及便潛血情況，實驗結束后統計各組大鼠DAI，具體評分標準見表1。

表1 DAI評分標準Tab.1 DAI scoring criteria

1.2.6 HE染色觀察大鼠結腸組織病理改變 將大鼠結腸組織依次梯度脫水、包埋、切片，進行HE染色，光學顯微鏡下觀察染色后各組大鼠的結腸形態，每個樣本高倍鏡下隨機選取5個視野。

1.2.7 Western blot檢測大鼠結腸組織IL-6、JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白表達水平 每個樣本取100 mg結腸組織研磨、裂解、離心后取上清，使用BCA蛋白定量試劑盒檢測蛋白濃度，加入5×Buffer后煮沸使其變性。依次制備分離膠、濃縮膠，每組以70 μg/ml上樣量加入樣本，將電壓調至80 V與120 V分別進行電泳，而后采用濕轉法，70 V/70 min條件將蛋白轉印至PVDF膜，放入含5%BSA的封閉液中封閉70 min，TBST洗滌5 min后孵育一抗過夜，TBST洗滌10 min×3次后孵育二抗2 h，TBST洗滌5 min×6次，使用biosharp發光液化學發光后采集圖像，分析灰度值。

1.2.8 ELISA法檢測大鼠血清中IL-6含量 按照ELISA檢測試劑盒說明書操作，在96孔板中完成標準品的配制、加樣、洗滌等，最后加入顯色液，置于酶標儀中，對各孔的吸光度值進行測定，根據得到的標準曲線計算各組大鼠血清中IL-6含量。

1.2.9 免疫組化法測定大鼠結腸組織IL-6R、MPO含量 隨機選取各組大鼠結腸組織進行浸蠟包埋、切片、脫蠟、抗原修復、封閉，滴加一抗孵育過夜，滴加二抗孵育過夜，復染后封片、圖像采集，高倍鏡下隨機選取3個視野，使用Image J計算分析陽性面積比例。

1.3 統計學處理 采用Prism 8.0軟件進行數據統計分析，計量資料以±s表示，多組間比較采用方差分析，P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠一般狀態觀察及DAI評分 實驗期間，空白對照組大鼠精神狀態佳，毛色柔順有光澤，食欲良好，體質量穩步增加，大便規律且性狀無異常。使用3%DSS水溶液造模7 d后，除空白對照組外，其余4組大鼠均出現不同程度的活動度下降，毛色光澤度變差，飲食攝入減少，大便次數增多，糞便不成形甚至肉眼血便表現，DAI評分顯著升高，差異有統計學意義（P＜0.01）。藥物治療7 d后，與UC模型組比較，灰樹花治療組、西藥治療組與聯合治療組大鼠一般狀態有明顯改善，食欲有所提升，大便逐漸規律且成形，DAI評分明顯降低，差異有統計學意義（P＜0.01）。連續給藥14 d后，各治療組大鼠體質量顯著增加，DAI評分降低更為明顯，而UC模型組大鼠DAI評分雖有所下降，但仍有較為明顯的精神狀態不佳、排便次數多、便溏等表現，大便不成形未見好轉，便隱血呈陽性。與UC模型組比較，其他3個治療組大鼠DAI評分均顯著下降（P＜0.01），尤以聯合治療組降低最為明顯，且與灰樹花治療組和西藥治療組比較差異有統計學意義（P＜0.05），見圖1。

圖1 大鼠DAI評分情況Fig.1 DAI score of rats

2.2 大鼠結腸組織病理改變 結果顯示，空白對照組大鼠結腸黏膜結構完整，腺體排列整齊，無明顯異常；與空白對照組比較，UC模型組大鼠可見結腸組織黏膜缺損或脫落，腺體排列紊亂，炎癥細胞浸潤明顯，黏膜基層增厚；與UC模型組比較，灰樹花治療組、西藥治療組與聯合治療組大鼠結腸黏膜病變均有減輕，黏膜缺損有不同程度改善，腺體排列趨向規則，但部分仍可見炎癥細胞浸潤，見圖2。

圖2 大鼠結腸組織病理改變（HE，×200）Fig.2 Histological changes of rats colon （HE，×200）

2.3 大鼠結腸組織IL-6、JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白表達水平 與空白對照組比較，UC模型組大鼠結腸組織IL-6、JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白表達顯著升高（P＜0.01）；與UC模型組比較，灰樹花治療組、西藥治療組、聯合治療組大鼠結腸組織IL-6、JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白表達水平顯著降低（P＜0.01），但各治療組間上述蛋白表達水平差異無統計學意義，見圖3。

圖3 大鼠結腸組織IL-6、JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白表達水平Fig.3 Expression levels of IL-6， JAK2， STAT3 and p-STAT3 proteins in rats colon tissue

2.4 大鼠結腸組織IL-6R、MPO含量 與空白對照組比較，UC模型組大鼠結腸組織中IL-6R、MPO含量均顯著增高（P＜0.01）；與UC模型組比較，各治療組大鼠結腸組織中IL-6R含量均顯著降低（P＜0.01），MPO含量也明顯降低，其中灰樹花治療組和西藥治療組（P＜0.05），聯合治療組（P＜0.01），見圖4。

圖4 大鼠結腸組織IL-6R、MPO表達情況（免疫組化，DAB染色，×400）Fig.4 Expressions of IL-6R and MPO in colon tissue of rats （immunohistochemistry，DAB staining，×400）

2.5 大鼠血清中IL-6含量 與空白對照組比較，UC模型組大鼠血清中IL-6含量顯著升高（P＜0.01）；與UC模型組比較，灰樹花治療組、西藥治療組大鼠血清中IL-6含量明顯減少（P＜0.05），聯合治療組大鼠血清中IL-6含量顯著減少，差異有統計學意義（P＜0.01），見圖5。

圖5 大鼠血清IL-6含量Fig.5 IL-6 content in rats serum

3 討論

近幾十年來，新興工業化國家UC的發病率迅速上升，由其誘發的炎癥相關結腸癌較其他類型的結腸癌預后更差，病死率更高［14-15］。目前西醫治療UC的主要手段都存在一定的局限性，如根治困難、長期使用后極易出現不良反應、耐藥性升高等，因此，研制和開發治療UC的新藥迫在眉睫。

在中醫學中，UC屬“大瘕瀉”“痢疾”“腸澼”等范疇。在隋代巢元方所著《諸病源候論》中就曾有論述：“凡痢皆由榮衛不足，腸胃虛弱，冷熱之氣乘虛入客于腸間，腸虛則泄，故為痢也”。UC的中醫病機極為復雜，先天不足或后天失養導致脾腎虛弱是主要病因之一，由于脾氣不能散布精氣于全身，腎氣不能溫煦、蒸化、制約陰寒，體內正氣不足，進而寒從中生，腸道運化能力失司，病情遷延不愈［16-18］。因此，在治療UC時，首先應考慮補益脾氣，兼以辨證施治，如此才能在最大程度上緩解UC病情?；覙浠ㄓ置踝幽?、千佛菌，其性平味甘，具有健脾益氣、扶正補虛之功效，可從根本改善患者體質，補益正氣、驅邪外出，很大程度上解決了目前西藥在治療UC方面所面臨的難題。據文獻報道，干灰樹花子實體中含蛋白質31.5%、碳水化合物49.69%、粗纖維10.7%，營養元素遠超其他食用菌，居首位［5］。由于灰樹花子實體中含有大量的天門冬氨酸與谷氨酸，有“食用菌之王”“華北人參”的美譽，其含有的多糖、肽類等具有很好的抗腫瘤、抑制炎癥感染、改善免疫功能的作用，含有的多酚具有明顯的抗氧化功效，可起到一定的治療和緩解作用［7-8，19］。也有實驗證實灰樹花具有一定的免疫調節及抗炎活性，能夠顯著增強動物脾淋巴細胞的增殖能力，灰樹花中的吡喃糖環及α型和β型糖苷鍵還可有效抗擊腫瘤［20-22］。本研究結果顯示，與空白對照組比較，UC模型組大鼠一般狀態欠佳，大便次數增多，糞便不成形，甚至肉眼可見血便表現，DAI評分顯著升高，且結腸組織可見黏膜缺損與炎癥細胞浸潤，MPO活性也顯著升高，說明UC大鼠模型制備成功。與UC模型組比較，各治療組大鼠的一般狀態有所改善，DAI評分均有不同程度的降低，且結腸黏膜損傷減輕，尤以聯合治療組下降最為明顯。說明灰樹花提取物可在一定程度上有效改善DSS誘導的UC大鼠結腸炎癥反應。

IL-6是一種典型的促炎細胞因子，主要由巨噬細胞及T細胞產生，多數在炎癥反應的急性期分泌，可將其視作炎癥反應發生發展過程的主要標志物之一。在既往的實驗及臨床觀察中發現，UC患者的血清檢測和組織活檢中IL-6含量均大幅增加。JAK2是一類重要的酪氨酸蛋白激酶，在UC的炎性級聯式反應中發揮重要的傳導和銜接作用。STAT3是信號傳導通路家族的重要成員之一，與細胞增殖分化和凋亡密切相關，其在人體免疫反應、炎癥反應等病理過程中發揮重要調控作用。在IL-6/JAK2/STAT3通路中，大量IL-6首先與靶細胞表面IL-6受體（sIL-6R）識別并結合，形成sIL-6R/IL-6復合物，進而活化細胞膜表面gp130，然后激活JAK2，使受體酪氨酸激酶活化，并與STAT3蛋白結合，使STAT3磷酸化激活下游轉錄因子，調控炎癥細胞因子表達，從而介導炎癥反應發生。本研究結果顯示，與空白對照組比較，UC模型組大鼠結腸組織IL-6、IL-6R、JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白表達均顯著升高，經藥物治療后上述蛋白含量明顯降低，其中聯合治療組IL-6、STAT3、p-STAT3蛋白含量下降最為明顯，提示灰樹花提取物與西藥聯合治療效果優于單一西藥治療作用。此外，本研究結果還顯示灰樹花提取物可降低UC大鼠血清中IL-6含量，且與西藥聯合應用后，效果明顯優于西藥治療組。

綜上所述，灰樹花提取物調控IL-6/JAK2/STAT3信號通路相關因子表達，可能是改善UC大鼠結腸炎癥反應的重要機制之一。本研究結果提示灰樹花提取物在改善UC炎癥方面具有一定優勢，協同西藥治療后優于單獨應用西藥治療效果?？煽紤]在臨床治療UC疾病時協同或交替用藥，降低西藥的不良反應。因UC病機復雜，病情又多隨病程轉變，用藥治療機制還待進一步探索，課題組后續也將深入探討影響UC病程進展的其他可能機制。