彈性蛋白酶調節中性粒細胞炎性募集的功能研究

劉洋 孟玲 范思佳 任春光 張歡

（重慶醫科大學基礎醫學院細胞與遺傳教研室發育生物學研究室，重慶 400016）

中性粒細胞彈性蛋白酶（neutrophil elastase，NE）是一種絲氨酸蛋白酶，儲存在中性粒細胞嗜天青顆粒中［1］。NE最初被認為其主要功能是與髓過氧化物酶和NADPH氧化酶復合物產生的活性氧協作，參與吞噬溶酶體中入侵病原體的殺傷［1］。近年來，NE參與炎癥反應調節的其他作用逐漸被報道，中性粒細胞由外界激活，脫粒時釋放大量NE，釋放的一部分NE以活性形式結合在質膜的外表面，可溶性和膜結合的NE通過蛋白水解切割多種趨化因子、細胞因子、黏附分子和細胞表面的活性受體，進而參與細胞的趨化、黏附等生物學功能的調節［2］。除此之外，NE還作為中性粒細胞外捕獲網的組成，在清除入侵病原體和造成組織損傷的過程中扮演重要角色。

中性粒細胞的迅速募集是先天免疫反應的關鍵，也是急性炎癥的標志性事件［3］。盡管目前對于中性粒細胞遷移到炎癥部位的級聯反應已經有了大量的研究，建立起了包括滾動、黏附、爬行、跨內皮遷移、跨基底膜遷移以及間質遷移在內的中性粒細胞炎癥募集級聯學說［4］。NE一度被認為通過降解細胞外基質與基底膜促進中性粒細胞的炎性募集［5］，但ROSENGREN等［6］及ISHII等［7］指出NE的敲除并不影響中性粒細胞對細胞外基質的降解，可見NE在中性粒細胞炎性募集中的功能還存在爭議。

因此，理清NE在中性粒細胞炎性募集級聯反應過程中的具體作用，對明確中性粒細胞遷移動力學以及探索中性粒細胞主導炎癥的靶向藥物篩選至關重要。本研究旨在系統性探索NE對中性粒細胞炎性募集級聯反應各關鍵步驟的調控，及其對中性粒細胞病原體殺傷功能的調節作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 小鼠胰島內皮細胞系（MS-1）購自中國科學院細胞庫； N-甲酰-蛋氨酸-亮氨酸-苯丙氨酸（N-formyl-Met-Leu-Phe， f-MLF）、西維來司鈉鹽水合物購自Sigma公司；重組小鼠TNF-α、重組小鼠GMCSF購自Peprotech公司；D-hanks平衡鹽溶液、牛纖維蛋白原（fibrinogen，FN）、D-PBS緩沖液、牛血清白蛋白（bovine albumin，BSA）、辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）、異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）、Hanks平衡鹽溶液（HBSS）、羥乙基呱嗪乙硫磺酸溶液（Hepes）、二甲基亞砜（DMSO）、RPMI-1640培養基購自Solarbio公司；胎牛血清購自BI Bioscience公司；Percoll購自Cytiva公司；魯米諾（Luminol）、異魯米諾（Isoluminol）購自CTI公司；磷酸肌球蛋白輕鏈2-Ser19（pMLC）小鼠單克隆抗體購自CST公司；山羊抗小鼠IgG（H+L）耦聯647紅色熒光二抗、細胞遠紅外標記（Far Red）購自Thermo Fisher Scientific公司；微絲綠色熒光探針（Actin-Tracker Green-488）、抗熒光淬滅封片劑（含DAPI）、細胞膜紅色熒光探針（Dil）、羧基熒光素二乙酸琥珀酰亞胺酯（carboxyfluorescein diacetate，CFSE）、臺盼藍購自Beyotime Biotechnology公司；4%多聚甲醛購自Sangon Biotech公司；流動池裝置購自GlycoTech公司；細胞體外遷移小室（Dunn chamber 16802）購自HAWKSLEY公司；DMi8倒置熒光顯微鏡、SP8 激光共聚焦顯微鏡（Leica）；Infinite Pro 200酶標儀（Tecan）。

1.1.2 實驗動物 8周齡SPF級C57BL/6N小鼠，17～23 g，購自浙江維通利華實驗動物技術有限公司［SCXK（浙）2019-0001］。本研究所有動物實驗由重慶醫科大學實驗動物倫理委員會批準（IACUCCQMU-2024-0111），小鼠飼養在25 ℃、12 h光/暗循環的SPF環境中，自由飲食，所有小鼠均適應性喂養2周后進入實驗，所有小鼠斷頸處理后分離骨髓。

1.2 方法

1.2.1 細胞分組 小鼠骨髓來源的中性粒細胞隨機分為兩組，添加終濃度為10 μmol/L的西維來司鈉鹽（標記為SIVE組）或1‰DMSO（標記為DMSO組），兩組細胞均在37 ℃、5%CO2條件下，于含有10%熱滅活胎牛血清和25 ng/ml重組小鼠GM-CSF的RPMI1640培養基中培養4 h。

1.2.2 小鼠骨髓來源中性粒細胞的分離 骨髓用于分離小鼠中性粒細胞。在Hanks-1緩沖液［Hanks平衡鹽溶液（HBSS）+0.5%牛血清白蛋白+10 mmol/L HEPES］中收獲小鼠骨髓細胞，紅細胞裂解液裂解紅細胞，進行Percoll不連續密度梯度離心。從分布在Percoll的81%和60%層間收集中性粒細胞。

1.2.3 體內腹膜炎模型檢測細胞過繼性遷移 提前1.5 h，向小鼠腹腔注射1 ml濃度為1 mg/ml的酵母多糖懸液，誘導無菌腹膜炎；將DMSO組和SIVE組中性粒細胞分別以0.8 μmol/L CFSE和0.2 μmol/L Far Red標記，將兩種細胞1∶1混合后冰上靜置1 h，向每只腹膜炎小鼠單側眼眶后靜脈竇注射5×107個混合標記細胞；6 h后從對側眼眶后靜脈竇收集外周血，并以預冷的D-PBS灌洗小鼠腹腔，收集腹膜灌洗液。通過流式細胞術檢測遷移到外周血及腹膜灌洗液中DMSO預處理 （CSFE標記）或SIVE預處理（Far Red標記）的中性粒細胞比例。

1.2.4 細胞體外趨化 以FITC監測催化劑f-MLF濃度梯度，使用5 μmol/L Dil標記SIVE預處理的中性粒細胞，并將其1∶1混合接種在100 μg/ml FN預包被的玻片上，等待細胞黏附30 min。組裝好細胞體外遷移小室Dunn chamber，中性粒細胞會沿f-MLF濃度梯度在遷移小室中發生趨化性遷移，以30 s間隔采集30 min所有的延時圖像序列，并使用Image J和Chemotaxis And Migration Tools對單個細胞趨化路徑進行分析。

1.2.5 細胞黏附流動室實驗 將小鼠胰島內皮細胞 MS-1接種在100 μg/ml FN預包被的3.5 cm細胞培養皿上并生長至匯合，在37 ℃下采用濃度為50 ng/ml的TNF-α預處理4 h。D-PBS洗滌MS-1的培養皿，并將其置于流動室裝置中。分別用1 μmol/L CFSE和5 μmol/L Dil標記DMSO或SIVE組細胞，按1∶1的比例混合后，以0.4 dyn/cm2的剪切流速流入。然后在熒光顯微鏡下觀察黏附細胞并計數，每組計數10個視野。

1.2.6 細胞伸展 100 μg/ml終濃度的FN包被玻片過夜，Hanks洗滌玻片2次，封閉緩沖液（Hanks+0.25%BSA）封閉30 min，Hanks洗滌玻片2次，無塵紙蘸干水分，玻片放入6孔板中備用。細胞懸液在接種玻片上等待貼附15 min，終濃度為10 μmol/L f-MLF嚴格刺激2 min后用4%多聚甲醛固定后用含DAPI的封片劑封片，每組采用Image J計數不少于100顆伸展之后的細胞面積。

1.2.7 中性粒細胞極化 100 μg/ml終濃度FN包被玻片3 h，D-PBS洗滌玻片3次。細胞懸液接種在玻片上等待貼附15 min，終濃度為10 μmol/L的f-MLF嚴格刺激2 min后4%PFA固定。1∶200稀釋兔抗小鼠p-MLC一抗，4 ℃孵育過夜，1∶200稀釋山羊抗鼠耦連647紅色熒光二抗避光孵育1 h，D-PBS清洗之后，綠色微絲熒光探針避光孵育45 min，D-PBS洗滌后用含DAPI抗熒光淬滅劑封片。

1.2.8 活性氧（ROS）釋放 100 μg/ml FN預包被96孔板5 h，D-PBS清洗后備用；加入細胞懸液和HRP及Isoluminol、Luminol配制的反應工作液；室溫放置5 min后讀板檢測本底值；隨后加入f-MLF刺激劑，立刻讀取化學發光值，計算ROS釋放動力學曲線。

1.2.9 細胞吞噬作用 終濃度為0.5 mg/ml的FITC和熱滅活的銅綠假單胞菌室溫下孵育20 min以標記細胞，D-PBS洗滌3次去除多余染料；在含20%小鼠血清的D-PBS中37 ℃孵育30 min以調理細菌，細胞與細菌按1∶50比例，在37 ℃下共孵育30 min，用0.4%臺盼藍淬滅黏附在細胞表面的FITC熒光，流式細胞儀檢測中性粒細胞吞噬熒光標記的銅綠假單胞菌比例。

1.3 統計學分析 所有數據均使用GraphPad Prism軟件版本9.0繪制和分析，數據均采用3個及以上獨立實驗的±s，兩組數據用t檢驗法分析，多組采用One-way ANOVA分析，組間采用Two-way ANOVA分析，P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 NE調節中性粒細胞炎性募集 如圖1A所示，在小鼠外周血中回收到了相近數目的DMSO或SIVE預處理的中性粒細胞，但腹膜灌洗液中回收到的SIVE預處理后的中性粒細胞數目與DMSO組相比顯著降低（P＜0.001，圖1B），提示NE的抑制顯著減少中性粒細胞在體內的炎性募集。

圖1 NE在腹膜炎模型中對中性粒細胞過繼性遷移的影響Fig.1 Effect of elastase on adoptive migration of NE in peritonitis model

2.2 NE對中性粒細胞趨化的影響 采用Dunn Chamber評估NE是否影響中性粒細胞對催化劑濃度梯度的感知能力及體外定向趨化能力（圖2A、B）。Dunn Chamber時間序列圖像顯示，NE的抑制不僅降低了中性粒細胞順從催化劑f-MLF濃度梯度的遷移速度（P＜0.05，圖2C）、干擾了中性粒細胞遷移方向性（P＜0.05，圖2D），同時縮短了遷移距離（P＜0.05，圖2E、F），表明抑制NE減弱了f-MLF誘導的中性粒細胞趨化能力。

圖2 NE對中性粒細胞體外趨化的影響Fig.2 Effect of elastase on chemotaxis of NE in vitro

2.3 NE對中性粒細胞與內皮細胞黏附的影響 與DMSO預處理組相比，SIVE預處理后的中性粒細胞在存在持續性的流動剪切應力的情況下，黏附在TNF-α預處理的小鼠內皮細胞上的數目顯著降低（P＜0.000 1，圖3A、B），即抑制NE顯著減弱中性粒細胞對發炎內皮細胞的黏附能力。

圖3 NE對中性粒細胞與內皮細胞黏附的影響Fig.3 Effect of NE on adhesion of neutrophils to endothelial cells

2.4 NE對中性粒細胞伸展的影響 評估兩組細胞伸展能力的差異，結果發現在伸展過程中，兩組細胞具有相似的形態和相似的面積，即使外源性添加了刺激劑f-MLF，兩組細胞仍然具有類似的伸展形變模式（P＞0.05，圖4A、B），即抑制NE對中性粒細胞的伸展能力無顯著影響。

圖4 NE對中性粒細胞伸展的影響Fig.4 Effect of NE on neutrophil extension

2.5 NE對中性粒細胞極化的影響 結果顯示，無論是靜息或f-MLF刺激后，DMSO或SIVE預處理后的中性粒細胞具有相似的極化現象與極化比例，即抑制NE對中性粒細胞的極化無顯著影響（P＞0.05，圖5A～C）。

圖5 NE對中性粒細胞極化的影響Fig.5 Effect of NE on the polarization of neutrophils

2.6 NE對中性粒細胞ROS釋放的影響 結果顯示，NE的抑制對中性粒細胞外（圖6A、B）及總ROS（圖6C、D）的釋放無顯著影響（P＞0.05）。

圖6 NE對中性粒細胞ROS釋放的影響Fig.6 Effect of NE on ROS release in neutrophils

2.7 NE對中性粒細胞體外吞噬細菌的影響 結果顯示，抑制NE可顯著降低中性粒細胞吞噬細菌的能力（P＜0.05，圖7）。

圖7 NE對中性粒細胞體外吞噬細菌的影響Fig.7 Effect of elastase on phagocytosis of NE in vitro

3 討論

本研究系統性探索了NE在中性粒細胞炎癥募集級聯反應各個環節的獨立作用。研究結果顯示，抑制NE顯著減少了中性粒細胞黏附在發炎內皮上的數目，影響了中性粒細胞對催化劑濃度梯度的感知，降低了趨化速率及距離并最終導致中性粒細胞體內炎性募集及吞噬能力的損害；進一步，本研究發現F-actin及p-MLC的極化不受NE的影響，排除了F-actin聚合減少及細胞極性建立異常在此過程中的貢獻，且NE的抑制對中性粒細胞的ROS釋放也無顯著影響。

中性粒細胞作為急性炎癥反應期率先被招募到損傷部位的先鋒細胞，對機體免疫反應具有重要調節作用［3］。為了快速到達損傷部位，中性粒細胞具有獨特且迅速的細胞遷移機制，到達損傷部位后中性粒細胞通過吞噬、ROS釋放及蛋白酶庫的釋放等手段消滅入侵的病原體，維持體內環境穩態［8］。因此，明確中性粒細胞的遷移動力學過程尤為重要。關于中性粒細胞遷移，最新鑒定出了多種新的分子相互作用機制，他們可能參與介導或調節中性粒細胞遷移，對先天免疫和適應性免疫至關重要［9］。盡管對細胞運動領域的探索在一直深入，但迄今為止，中性粒細胞遷移過程中涉及許多特定分子功能作用的報道仍然存在一些爭議，ROS則是其中的代表分子［10］。

中性粒細胞NE由于其對內皮細胞造成損害、切割關鍵的內皮細胞相關黏附分子（例如，ICAM-1和VCAM-1）及其水解基底膜和血管外組織成分的能力，被視為導致血管和組織損傷的介質［2，11-12］。事實上，NE的不適當釋放與許多炎癥性疾病的病理相關，例如局部缺血/再灌注損傷和慢性阻塞性肺?。?3-14］。

西維來司鈉鹽作為現階段唯一投入臨床使用的中性粒細胞NE特異性抑制劑，在臨床和動物實驗中均顯示出良好的NE活性抑制能力［15-16］。在動物實驗研究中，在許多炎癥模型中西維來司鈉鹽表現出對中性粒細胞介導的組織損傷具有保護作用［17］，體外研究也有相似結果的報道，即NE抑制劑損害白細胞的體外遷移［18］，但也有研究給出了相悖的結論［6］，目前藥理學抑制劑對白細胞特別是中性粒細胞遷移能力影響的報道仍具有矛盾性。

考慮到既往研究通常僅關注中性粒細胞炎性募集的單個環節，且體外實驗難以完全模擬體內細胞遷移的整體炎癥微環境。為了排除潛在因素的影響，本研究首先通過向腹膜炎小鼠眼眶后靜脈竇注射等量不同標記的野生型或NE抑制的中性粒細胞，使兩種細胞處在完全一致的體內炎癥微環境中，證實了NE的抑制顯著降低了中性粒細胞體內炎癥募集［19］。在明確了抑制NE對體內募集的影響后，本研究將炎癥募集過程中的關鍵步驟進行拆分，逐一驗證NE對其是否具有調控作用?；瘜W趨化，即細胞定向遷移，發生在跨內皮和間質遷移過程中［3］。與CAI等［20］報道拮抗NE阻斷中性粒細胞的趨化性類似，本研究同樣證實了NE的抑制損害了中性粒細胞定向趨化的能力，包括偏移角度的增加、趨化速度的降低，趨化距離的縮短。這將NE對遷移作用的影響節點從DELCLAUX等［21］報道的對細胞外基質與基底膜的降解提前到了定向趨化。本研究進一步探索了定向趨化的前置步驟——牢固黏附，有效的免疫反應取決于白細胞迅速從身體的一個位置移動到另一個位置的能力；中性粒細胞在血管中面臨血液流動帶來的剪切應力，在遇到激活分子（如受到炎癥因子刺激后的內皮細胞上表達的趨化因子）時通過整合素黏附，以駐留在內皮細胞表面，流動室實驗在最大程度上模擬了這個過程，等量差異標記的DMSO或SIVE預處理后的中性粒細胞，通過流動室流經炎癥因子預處理的內皮細胞，在持續性剪切應力的條件下，NE抑制的中性粒細胞黏附在內皮細胞上的數目顯著變少［22］。以上結果可能歸因于中性粒細胞受到炎癥因子刺激后，分泌到細胞外環境中或結合在質膜外表面的NE活性被抑制，進而無法對趨化因子、細胞因子、生長因子和細胞表面的活性受體進行正確加工，最終導致中性粒細胞黏附及趨化異常［23-24］。

此外，細胞的伸展形變是中性粒細胞黏附和沿血管遷移以及間質組織遷移的初始步驟，由此本研究檢測了中性粒細胞伸展形變的形態與面積［4］。但無論是否存在f-MLF刺激，DMSO或SIVE預處理的中性粒細胞都具有類似的伸展能力。肌動蛋白是中性粒細胞伸展形變的關鍵參與者，肌動蛋白多聚化可直接促進細胞伸展形變，與前一部分研究結果相一致，NE的抑制并沒有影響F-actin的聚合，兩種細胞具有相似的F-actin極化比例［25］?？紤]到細胞極化是細胞發生遷移性行為的前提條件，極化的方向性也決定了細胞遷移的方向［26-27］。但REN等［26］報道化學信號的刺激并不是引起中性粒細胞骨架極化的充要條件，而是細胞貼附引起的形變即誘導了細胞最初極性的建立。由此，本研究探索了外源性化學信號刺激時DMSO或SIVE預處理對中性粒細胞極化的影響，結果顯示無論是否添加f-MLF，NE抑制均影響中性蛋白酶的極化?？傊?，NE抑制中性粒細胞體內炎癥募集可能依賴于阻止了膜結合NE對細胞表面趨化因子受體的切割這種獨立于F-actin的途徑發生。隨后，本研究回歸到了NE與中性粒細胞免疫學功能的串擾，既往研究報道中性粒細胞ROS的釋放可能是細胞伸展形變的下游表型［28］，與之一致的是，本研究并沒有發現NE的抑制對中性粒細胞ROS的釋放有顯著影響。與YOUNG等［29］報道NE的敲除影響中性粒細胞吞噬功能一致，本研究同樣觀察到NE的抑制損害了中性粒細胞的吞噬功能，對吞噬的影響可能是由于NE抑制后對中性粒細胞感知病原體的表面分子無法進行正確的切割導致參與吞噬作用的受體（如CD14、CD206）異常，最終引發吞噬能力減弱［30］。

綜上所述，本研究探索了NE在中性粒細胞體內炎性募集各個關鍵環節的作用，通過體內腹膜炎過繼性遷移實驗結合體外Dunn Chamber與流動室實驗對體內遷移過程的模擬，將NE影響中性粒細胞募集可能環節從既往報道的跨基底膜遷移前移到了牢固黏附。但本研究仍然缺乏對炎性募集過程中中性粒細胞表面受體的定量分析，同時也需要遺傳NE缺陷模型和更詳細的機制研究來進一步鞏固以上發現。本研究系統性地報道了中性粒細胞經由藥理學抑制劑處理后對中性粒細胞炎癥募集各個關鍵環節的影響，為闡明中性粒細胞遷移動力學，尋找干預中性粒細胞介導的炎癥疾病靶向藥物的篩選提供了分子基礎。