白藜蘆醇通過調節SIRT1/AMPK信號通路介導自噬反應對膝關節骨性關節炎大鼠細胞凋亡的影響

張磊 趙敏 （武漢市中醫醫院骨科，武漢 430000）

膝關節骨性關節炎（knee osteoarthritis，KOA）是骨性關節炎中的常見類型，影響患者美觀與身體健康，加重患者經濟負擔［1］。軟骨細胞的過度凋亡是KOA的發病機制之一，自噬可通過上調促進氧自由基促進細胞凋亡［2-3］。沉默信息調節因子1（silent information regulator 1，SIRT1）/腺苷酸活化蛋白激酶（adenylate activated protein kinase，AMPK）是自噬相關通路，從抑制軟骨細胞凋亡角度出發探尋治療藥物是KOA的潛在治療手段［4］。白藜蘆醇屬多酚化合物，在抗腫瘤、預防動脈粥樣硬化等方面發揮作用。研究顯示，其在兔膝骨關節炎中具有保護作用［5］。此外白藜蘆醇可調節多種細胞、動物模型的自噬［6-7］。本研究構建KOA損傷大鼠模型，探討白藜蘆醇基于SIRT1/AMPK信號通路介導的自噬途徑對KOA損傷大鼠的保護作用。

1 材料與方法

1.1 材料 SPF級Wistar大鼠［體質量200～250 g，SCXK（湘）20190015］購自長沙天勤生物技術有限公司；弗氏完全佐劑（FCA，S30541）、白藜蘆醇（S30630）購自上海源葉生物科技有限公司；SIRT1抑制劑EX527（HY-15452）、自噬激活劑雷帕霉素（HY-10219）購自MedChemExpress公司；大鼠IL-6 ELISA試劑盒（ml102828）、大鼠腫瘤壞死因子β（TNF-β）ELISA試劑盒（ml002953）購自上海酶聯生物科技有限公司；HE染色試劑盒（C0105S）、TUNEL細胞凋亡試劑盒（顯色法，C1091）、蛋白提取試劑盒（P0033）、BCA試劑盒（P0012S）購自上海碧云天生物技術有限公司；SIRT1（GT1189）、AMPK（GTX01105）、p-AMPK（GTX50224）、Beclin-1（GTX133555）、LC3B/A（GTX39752）、GAPDH（GTX100118）購自GeneTex公司；山羊抗兔二抗（ab6721）購自美國Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物分組 50只健康Wistar大鼠隨機分為對照組、模型組、白藜蘆醇組、白藜蘆醇+SIRT1抑制劑組、自噬激活劑組，每組10只。除對照組外，其余組別大鼠均參考文獻［8］復制KOA模型，即將大鼠右膝周圍毛發剃除，乙醇消毒，第1、3、7天于膝關節處注射0.1 ml FCA，大鼠出現膝關節紅腫、僵硬、行動受限代表造模成功，成功造模大鼠40只，造模成功率100%，對照組于第1、3、7天膝關節注射等量生理鹽水。造模結束后白藜蘆醇組大鼠鞘內注射10 μmol/kg白藜蘆醇［5］、白藜蘆醇+SIRT1抑制劑組注射10 μmol/kg白藜蘆醇與10 mg/kg EX527［9］，自噬激活劑組大鼠鞘內注射2 mg/kg自噬激活劑雷帕霉素［10］，1次/d，連續28 d，模型組和對照組注射等量生理鹽水，1次/d，連續28 d。

1.2.2 膝骨關節炎嚴重程度評估 給藥后觀察大鼠Lequesne MG膝關節級別［11］。局部疼痛刺激反應分為4級。步態觀察分為4級。關節活動范圍分為4級。關節腫脹分為3級。

1.2.3 關節液炎癥標志物水平測定 給藥結束后，向膝關節注入生理鹽水，反復回抽，得到的液體離心取上清，于-20 ℃保存備用。使用ELISA試劑盒檢測大鼠關節液IL-6、TNF-β水平。

1.2.4 HE染色、TUNEL染色觀察膝關節軟骨組織形態及凋亡情況 處死大鼠，骨刀離斷大鼠雙側膝關節，仔細取出股骨端與脛骨端關節，4%多聚甲醛固定，EDTA脫鈣（10%，每2 d更換），脫鈣完成后流水沖洗，切開膝關節，取股骨內踝關節軟骨組織，制備為0.5 cm×0.5 cm×0.1 cm組織塊，標記、脫水、石蠟包埋，切片，HE試劑盒染色，光鏡下觀察軟骨組織形態；TUNEL細胞凋亡試劑盒檢測細胞凋亡率。凋亡率（%）=陽性細胞數/總細胞數×100%。

1.2.5 透射電子顯微鏡觀察軟骨細胞自噬情況取1 cm3左右軟骨組織，戊二醛內固定，4 h后PBS清洗，鋨酸后固定，乙醇脫水（30%、50%各15 min），環氧樹脂包埋后進行超薄切片（70 nm），醋酸鈾與枸櫞酸鈉染色，透射電鏡觀察細胞自噬情況。

1.2.6 Western blot法檢測SIRT1、AMPK、Beclin-1、LC3B/A蛋白表達 取一定量軟骨組織提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，取一定量樣品SDS-PAGE凝膠電泳處理，將蛋白轉膜，封閉（5%脫脂奶粉），加入一抗（SIRT1、AMPK、p-AMPK、Beclin-1、LC3B/A，稀釋比分別為1∶2 000、1∶2 000、1∶1 000、1∶1 000、1∶100；GAPDH（內參）按1∶5 000的比例稀釋，4 ℃下孵育過夜，添加羊抗鼠二抗（1∶5 000）室溫孵育1 h，ECL顯色，計算目的條帶與內參條帶的灰度比，分析SIRT1、AMPK、p-AMPK、Beclin-1、LC3B/A的相對表達量。

1.3 統計學分析 采用SPSS22.0軟件進行數據分析，計量數據以±s表示，兩組間的比較采用t檢驗（對照組、模型組；白藜蘆醇組、白藜蘆醇+SIRT1抑制劑組），多組間比較采用F檢驗（模型組、白藜蘆醇組、自噬激活劑組），進一步兩兩統計學比較采用SNK-q法。N描述等級資料，秩和檢驗進行組間比較。P＜0.05代表差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠Lequesne MG評估情況 與對照組相比，模型組局部反應、步態反應、關節活動、關節腫脹程度加重（P＜0.05）；與模型組相比，白藜蘆醇組、自噬激活劑組局部反應、步態反應、關節活動、關節腫脹程度減輕（P＜0.05）。見表1。

表1 治療后組間Lequesne MG評估結果Tab.1 Evaluation results of Lequesne MG between groups after treatment

2.2 白藜蘆醇對大鼠膝關節關節液炎癥的影響與對照組相比，模型組大鼠膝關節液IL-6、TNF-β水平升高（P＜0.05）；與模型組相比，白藜蘆醇組、自噬激活劑組大鼠膝關節液IL-6、TNF-β水平降低（P＜0.05）；與白藜蘆醇組相比，白藜蘆醇+SIRT1抑制劑組大鼠膝關節液IL-6、TNF-β水平升高（P＜0.05）。見表2。

表2 各組大鼠膝關節關節液炎癥水平情況（±s，n=10，pg/ml）Tab.2 Inflammatory level of knee joint fluid of rats in each group （±s， n=10， pg/ml）

表2 各組大鼠膝關節關節液炎癥水平情況（±s，n=10，pg/ml）Tab.2 Inflammatory level of knee joint fluid of rats in each group （±s， n=10， pg/ml）

Note：Compared with control group， 1）P＜0.05； compared with model group， 2）P＜0.05； compared with resveratrol group， 3）P＜0.05.

TNF-β 12.43±1.53 43.76±5.461）31.57±3.922）39.52±4.953）41.24±5.162）Groups Control Model Resveratrol Resveratrol+SIRT1 inhibitor Autophagy activator IL-6 21.50±2.61 79.54±9.721）51.26±6.372）62.80±7.763）48.76±6.012）

2.3 白藜蘆醇對大鼠膝關節軟骨組織形態的影響 對照組大鼠軟骨表面光滑，排列整齊，結構清晰，著色均勻，細胞核呈藍色，胞漿為粉紅色；模型組大鼠軟骨組織細胞排列紊亂，粗糙，存在纖維化變性、軟骨下骨硬化、邊緣有丘狀隆起；白藜蘆醇組、自噬激活劑組較模型組相比細胞排列紊亂、邊緣丘狀隆起等現象有改善；與白藜蘆醇組相比，白藜蘆醇+SIRT1抑制劑組細胞排列紊亂、邊緣丘狀隆起等現象又有加重。見圖1。

圖1 軟骨細胞結構觀察HE染色圖（×100）Fig.1 HE staining of chondrocyte structure （×100）

2.4 白藜蘆醇對大鼠膝關節軟骨組織細胞凋亡的影響 與對照組［（4.32±0.54）%］相比，模型組大鼠軟骨細胞凋亡率［（22.54±2.80）%］升高（P＜0.05）；與模型組相比，白藜蘆醇組［（13.46±1.66）%］、自噬激活劑組［（12.17±1.51）%］大鼠軟骨細胞凋亡率降低（P＜0.05）；與白藜蘆醇相比，白藜蘆醇+SIRT1抑制劑組［（18.53±2.32）%］大鼠軟骨細胞凋亡率升高（P＜0.05）。見圖2。

圖2 各組大鼠膝關節軟骨細胞凋亡TUNEL染色圖（×400）Fig.2 TUNEL staining of chondrocyte apoptosis in knee joint of rats in each group （×400）

2.5 白藜蘆醇對大鼠膝關節軟骨組織細胞自噬的影響 對照組細胞結構完整，胞質內可見完整細胞器，可見少量雙層膜的自噬小體；模型組細胞細胞器減少，可見空泡變性，自噬小體數目增多；與模型組相比，白藜蘆醇組、自噬激活劑組自噬小體數目增多；與白藜蘆醇組相比，白藜蘆醇+SIRT1抑制劑組細胞自噬小體數目減少。見圖3。

圖3 各組大鼠膝關節軟骨細胞自噬情況（×8 000）Fig.3 Autophagy of chondrocytes in knee joint of rats in each group （×8 000）

2.6 白藜蘆醇對大鼠膝關節軟骨組織SIRT1、AMPK、Beclin-1、LC3-B/A蛋白的影響 與對照組相比，模型組大鼠膝關節軟骨組織SIRT1、p-AMPK/AMPK降低（P＜0.05），Beclin-1和LC3-B/A表達顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，白藜蘆醇組、自噬激活劑組大鼠膝關節軟骨組織SIRT1、p-AMPK/AMPK、Beclin-1和LC3-B/LC3-A表達顯著升高（P＜0.05）；與白藜蘆醇組相比，白藜蘆醇+SIRT1抑制劑組大鼠膝關節軟骨組織SIRT1、p-AMPK/AMPK、Beclin-1和LC3B/A表達降低（P＜0.05）。見表3、圖4。

圖4 各組大鼠膝關節軟骨組織SIRT1、p-AMPK、AMPK、Beclin-1、LC3-B/A蛋白Western blot圖Fig.4 Western blot of SIRT1， p-AMPK， AMPK， Beclin-1 and LC3-B/A proteins in knee cartilage of rats in each group

表3 各組大鼠膝關節軟骨組織SIRT1、p-AMPK、AMPK、Beclin-1、LC3-B/A蛋白表達（±s，n=10）Tab.3 Protein expressions of SIRT1， p-AMPK， AMPK， Beclin-1 and LC3-B/A in knee cartilage of rats in each group（±s， n=10）

表3 各組大鼠膝關節軟骨組織SIRT1、p-AMPK、AMPK、Beclin-1、LC3-B/A蛋白表達（±s，n=10）Tab.3 Protein expressions of SIRT1， p-AMPK， AMPK， Beclin-1 and LC3-B/A in knee cartilage of rats in each group（±s， n=10）

Note：Compared with control group， 1）P＜0.05； compared with model group， 2）P＜0.05； compared with resveratrol group， 3）P＜0.05.

LC3-B/A 0.15±0.02 0.65±0.081）0.89±0.112）0.71±0.083）1.52±0.192）Groups Control Model Resveratrol Resveratrol+SIRT1 inhibitor Autophagy activator SIRT1/GAPDH 1.24±0.15 0.54±0.061）0.92±0.112）0.68±0.083）0.89±0.112）p-AMPK/AMPK 0.94±0.12 0.51±0.061）0.73±0.092）0.66±0.083）0.69±0.082）Beclin-1/GAPDH 0.42±0.05 0.60±0.071）1.04±0.132）0.82±0.093）1.35±0.162）

3 討論

KOA是膝關節的退行性疾病，發病機制涉及關節軟骨細胞合成失調，細胞外基質分泌異常等，其中軟骨細胞凋亡在KOA中發揮關鍵作用［12］。生理狀態下，軟骨細胞凋亡、增殖趨于平衡，正常水平的凋亡對軟骨的形態完整、成熟有維持作用，但在外界應激的病理狀態下，細胞通過自噬來避免細胞凋亡，但應激長期不清除，自噬不足導致軟骨細胞凋亡過度，細胞外基質合成較少，軟骨細胞凋亡進一步增加，形成惡性循環，加重膝關節的結構與功能損傷。ZHANG等［13］研究顯示，骨性關節炎軟骨細胞中關鍵自噬基因減少、凋亡增加，mTOR可通過增加自噬降低軟骨細胞凋亡以及滑膜纖維化。本研究將基于自噬從抑制膝關節軟骨細胞凋亡角度找尋KOA的治療藥物。

本研究采用FCA注射法構建大鼠KOA模型，所構建模型膝關節明顯紅腫、變粗，病理切片顯示有炎癥浸潤、新生血管，結構紊亂，提示所構建的KOA模型關節損傷嚴重，可用于后續研究。白藜蘆醇是一種多酚類化合物，具有抗炎等多種生物學活性，白藜蘆醇通過激活自噬和抑制SIRT1/AMPK信號通路介導的細胞凋亡來保護脊髓免受損傷［14］；白藜蘆醇可通過調控自噬影響破骨細胞的分化［15］。此外，白藜蘆醇在控制粥樣硬化、蛛網膜下腔出血等疾病防控中發揮作用［16-17］。本研究中經白藜蘆醇治療的KOA大鼠較KOA模型大鼠軟骨細胞退化減輕，形態趨向完整，局部反應、步態反應、關節活動、關節腫脹程度分級降低，同時膝關節液IL-6、TNF-β水平降低，TUNEL染色證實軟骨細胞凋亡減少，提示白藜蘆醇能夠抑制KOA大鼠軟骨細胞凋亡，緩解病情，可能是KOA有效治療藥物之一，但治療機制尚不明確。

SIRT1與延緩細胞衰老、調節氧化應激、能量代謝等多種細胞功能有關。MA等［18］研究顯示，SIRT1可直接調節自噬相關分子Atg5/Atg7/LC3乙?；絽⑴c細胞自噬反應。AMPK高度保守，作為AMP的能量傳感器存在于真核細胞中對自噬起正調節作用，AMPK與SIRT1可互相調控。自噬與炎癥、細胞凋亡關系密切，炎癥因子通過與細胞質膜的特異性受體結合可調節自噬過程，自噬可抑制炎癥因子過程［19］；17β-雌二醇通過SIRT1介導的AMPK信號通路誘導線粒體自噬上調以保護軟骨細胞，進而達到治療骨關節炎的作用［20］。本研究中，KOA大鼠自噬水平升高，表現為自噬小體數目增多，LC3-B/A、Beclin-1水平升高，白藜蘆醇處理后，自噬水平進一步升高，提示KOA大鼠自噬不足可能是致病機理之一，白藜蘆醇可通過促進自噬抑制軟骨細胞的凋亡，且白藜蘆醇處理大鼠SIRT1、AMPK水平均升高，提示白藜蘆醇促進自噬抑制軟骨細胞凋亡的可能機制是介導SIRT1/AMPK通路引起的。為此本研究分別添加在白藜蘆醇治療KOA模型大鼠基礎上添加AMPK抑制劑，發現白藜蘆醇對KOA的炎癥、凋亡緩解作用可被部分逆轉，即白藜蘆醇可能是通過激活SIRT1/AMPK通路促進自噬抑制軟骨細胞凋亡，進而緩解KOA癥狀。

綜上所述，白藜蘆醇可能通過激活SIRT1/AMPK通路促進自噬抑制KOA大鼠軟骨細胞凋亡，為KOA的治療藥物選擇提供了理論依據。但本研究仍存在一定不足，白藜蘆醇與SIRT1/AMPK的具體調控機制仍需進一步探討。