白細胞介素-12促進氧化應激參與干燥綜合征肝臟病變

查潔 江婷婷 郭俊巧 肖幀 姚根宏 （.南京鼓樓醫院風濕免疫科，南京 20008；2 安慶醫藥高等?？茖W?；A醫學院，安慶 26052；.南京中醫藥大學中西醫結合鼓樓臨床醫學院，南京 20008；.南京大學金陵學院化學與生命科學學院，南京 20089）

原發性干燥綜合征（primary Sj?gren's syndrome，pSS）是一種慢性自身免疫性疾病，以唾液腺和淚腺功能障礙和破壞為特征，還可累及其他重要器官，如肝臟、腎臟和肺等，出現復雜的臨床表現［1-2］。肝臟是pSS常見的非外分泌腺作用靶點，患者可表現為乏力、黃疸、惡心、納差、嘔吐、皮膚瘙癢、肝區不適、腹脹和肝功能異常等癥狀［3］。不同患者肝損傷程度不一，有些癥狀輕微受重視程度不足而延誤治療，有些則較為嚴重甚至危及生命［4］。因此，pSS肝臟損傷不容忽視，明確pSS肝損傷發病機制、早期診斷、及時治療對于改善pSS預后有重要意義。但是，目前對pSS患者肝臟受累的發病機制尚不清楚。

研究表明白細胞介素等細胞因子在pSS發病中發揮重要作用。白細胞介素-12（IL-12）主要由活化的單核細胞和巨噬細胞產生，在T細胞介導的炎癥反應中起著關鍵作用［5］。IL-12通過引起淋巴亞群的紊亂、多種細胞因子表達失衡，與多數自身免疫病的發生密切相關，在一些常見自身免疫性疾病的發生中發揮重要致炎作用，如類風濕關節炎、系統性紅斑狼瘡、銀屑病、克羅恩病、pSS等［6-7］。既往研究表明，外源性注射重組小鼠IL-12加重小鼠pSS癥狀，注射抗IL-12抗體可以減輕小鼠pSS癥狀［8-9］。但是，IL-12是否參與pSS的肝臟病變及其機制尚不清楚。有大量研究發現，氧化應激發生在多種自身免疫性疾病中，比如類風濕關節炎、系統性硬化癥、pSS等，伴隨著活性氧（reactive oxygen species，ROS）的產生，促進了病情進展［10-11］。pSS患者唾液腺、淚腺功能損傷的原因，均可能涉及氧化應激，而IL-12具有調節氧化應激的功能。因此，本研究旨在明確IL-12是否通過促進氧化應激參與pSS肝臟病變的發生，從而探討pSS肝損害的發生機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 雌性C57BL/6小鼠、雌性NOD小鼠購自南京大學模式動物研究所。IL-12KO NOD小鼠為南京大學模式動物研究所繁配。所有小鼠均飼養在南京醫科大學鼓樓臨床醫學院動物中心SPF級環境中。實驗于南京醫科大學鼓樓臨床醫學院進行。本實驗獲得南京醫科大學鼓樓臨床醫學院動物保護倫理委員會的批準(實驗倫理號:20191021)。

1.1.2 試劑及材料 小鼠肝癌細胞系Hepa1-6及DMEM培養基（武漢普諾賽生命科技有限公司）；Mouse IL-12 ELISA試劑盒（杭州聯科生物有限公司）；Recombinant Murine IL-12p70（美國Peprotech公司）；Cell Counting Kit-8（廣州賽庫生物）；JAK2 和TYK2抑制劑（MCE公司）；過氧化氫酶（CAT）、還原型谷胱甘肽（GSH）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSHPX）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷丙轉氨酶（GPT）和谷草轉氨酶（GOT）檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所）。

1.2 方法

1.2.1 小鼠唾液流率檢測 小鼠麻醉后，腹腔注射100 μl毛果蕓香堿（0.1 mg/kg體質量），收集小鼠分泌15 min的唾液，計算唾液流率。

1.2.2 小鼠頜下腺和肝臟病理 取小鼠頜下腺及肝臟組織，4%多聚甲醛固定，進行脫水、石蠟包埋和切片，再經過脫蠟、復水、蘇木精染色和伊紅染色、脫水、封片，顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.3 小鼠肝功能檢測 分離小鼠血清，按GOT、GPT檢測試劑盒說明書進行。具體步驟如下：加入基質液、待測樣本，37 ℃反應30 min后，加入2-4二硝基苯肼，37 ℃反應20 min后，加入終止液。酶標儀讀取各樣本510 nm處的吸光度值，并通過標準曲線計算各樣本數值。

1.2.4 ELISA測定血清和肝臟中IL-12水平 采用ELISA法檢測小鼠血清和肝臟組織中IL-12水平。檢測方法嚴格按IL-12試劑盒說明書操作。

1.2.5 小鼠肝癌細胞培養和處理 小鼠肝癌細胞（Hepa1-6細胞）采用含有1 mmol/L丙酮酸鈉、10%FBS和1%青霉素-鏈霉素的DMEM培養基在37 ℃5%CO2飽和濕度下培養，待細胞生長至90%左右，采用0.25%胰酶-EDTA消化細胞，接種至24孔板，并加入不同濃度重組小鼠IL-12（終濃度為0、2.5、5、10、20、40 ng/ml）和JAK2、TYK2抑制劑。24 h后留取培養上清，待測各種氧化應激指標。

1.2.6 CCK-8檢測細胞增殖 將Hepa1-6細胞按照100 μl/孔接種至96孔培養板，分別加入不同濃度（0、2.5、5、10、20、40 ng/ml）的重組小鼠IL-12，培養24 h后，每孔加入10 μl CCK-8試劑，將培養板繼續置于培養箱中孵育4 h，用酶標儀在450 nm處測定吸光度。

1.2.7 血清、肝臟勻漿和培養上清中氧化應激指標檢測 檢測小鼠血清、肝臟組織勻漿和細胞培養上清中SOD、CAT、GSH、GSH-PX和MDA 5項氧化應激指標，具體檢測方法按照試劑盒說明書進行。

1.3 統計學處理 采用GraphPad Prism 8對實驗數據進行分析并作圖，多組數據間比較進行單因素方差分析，兩組間進行t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠IL-12、頜下腺和肝臟病變情況比較 小鼠血清和肝臟勻漿中IL-12檢測結果顯示，與B6小鼠相比，同周齡pSS小鼠（NOD小鼠）血清和肝臟勻漿中IL-12水平明顯升高［B6vsNOD，血清（29.93±1.81） pg/mlvs（77.31±11.19） pg/ml；肝臟勻漿（181.2±12.67） pg/mlvs（256.90±36.53） pg/ml］，差異有統計學意義（P＜0.05，圖1A、B）。比較小鼠的唾液流率、GPT和GOT，結果發現，與B6組小鼠相比，NOD小鼠唾液流率明顯下降；IL-12基因敲除NOD（IL-12KO NOD）小鼠唾液流率較野生型NOD小鼠唾液流率明顯增加（圖1C）。與B6和IL-12KO NOD小鼠相比，NOD小鼠的GPT明顯增加（圖1D）。NOD小鼠的GOT明顯高于B6小鼠（P＜0.05），較IL-12KO NOD小鼠也有增加的趨勢（圖1E）。頜下腺和肝臟病理結果顯示，B6小鼠頜下腺和肝臟中無淋巴細胞浸潤，NOD小鼠的頜下腺和肝臟中可見明顯的淋巴細胞浸潤，而IL-12KO NOD小鼠的頜下腺和肝臟中浸潤的淋巴細胞很少（圖1F、G）。

圖1 各組小鼠IL-12、肝功能、頜下腺及肝臟病變情況比較Fig.1 Comparison of IL-12， liver function， submandibular glands and liver lesions in mice of each group

2.2 各組小鼠血清中氧化應激指標比較 小鼠血清中氧化應激指標檢測結果顯示，與B6小鼠相比，NOD小鼠CAT、GSH-PX、SOD活力明顯降低［CAT（65.19±19.37） U/mlvs（7.99±3.89） U/ml；GSH-PX（283.60±5.42） U/mlvs（215.50±22.42） U/ml；SOD （25.71±1.76） U/mlvs（20.89±0.78） U/ml，P＜0.05］，見圖2；IL-12KO NOD小鼠血清GSH-PX較野生型NOD小鼠明顯增多（圖2A），IL-12KO NOD小鼠血清CAT和SOD較野生型NOD小鼠有增加的趨勢（圖2B、C），但差異無統計學意義（P＞0.05）。

圖2 各組小鼠血清中氧化應激指標比較Fig.2 Comparison of oxidative stress indexes in serum of mice of each group

2.3 IL-12對小鼠肝細胞增殖及氧化應激的影響應用不同濃度的重組小鼠IL-12處理小鼠肝癌細胞系，結果表明2.5、5和10 ng/ml IL-12明顯促進Hepa1-6細胞增殖，20 ng/ml和40 ng/ml IL-12組的促增殖效應較10 ng/ml IL-12組下降（圖3A）。因此，選擇2.5、5和10 ng/ml IL-12處理Hepa1-6細胞，檢測培養上清中氧化應激指標。研究結果顯示，不同濃度IL-12處理后，CAT、GSH、GSH-PX和SOD有下降趨勢。與對照組相比，10 ng/ml IL-12處理組培養上清中CAT、GSH、GSH-PX和SOD下降，差異均有統計學意義（P＜0.05，圖3B～E）。而5 ng/ml和10 ng/ml IL-12處理組MDA顯著高于對照組（圖3F）。

圖3 IL-12作用下小鼠肝細胞增殖及氧化應激情況Fig.3 Effects of IL-12 on proliferation and oxidative stress in hepatocytes of mice

2.4 IL-12通路抑制劑對IL-12處理肝細胞氧化應激的影響 在IL-12處理Hepa1-6細胞培養液中加入IL-12通路抑制劑（JAK2和TYK2特異性抑制劑），作用24 h后檢測培養上清中氧化應激指標。結果發現，JAK2和TYK2抑制劑能部分逆轉IL-12對Hepa1-6細胞CAT和GSH-PX的降低作用，但差異無統計學意義（圖4A、B）。IL-12對Hepa1-6細胞SOD抑制效應能被JAK2抑制劑顯著逆轉（P＜0.05，圖4C）。IL-12對Hepa1-6細胞GSH的抑制作用則只能被TYK2抑制劑逆轉（P＜0.05，圖4D）。與IL-12處理組相比，JAK2和TYK2抑制劑能顯著降低培養上清中MDA水平（P＜0.05，圖4E）。

圖4 IL-12抑制劑對肝細胞氧化應激的影響Fig.4 Effects of IL-12 inhibitors on oxidative stress in hepatocytes

3 討論

pSS是一種常見的結締組織病，以外分泌腺被淋巴細胞浸潤，導致口干和眼干為主要特征的慢性自身免疫病。pSS可累及多種內臟器官，比如肺和肝臟等。研究報道，約10%pSS患者在病程中出現肝功能異常［12-14］。pSS的肝臟病變機制不明確，有研究認為自身反應性免疫先引起肝臟細胞損傷，然后造成肌成纖維細胞擴增和肝星狀細胞活化，并最終加速膠原和糖蛋白在肝臟沉積，形成肝纖維化。但是，pSS中引起肝臟細胞損傷的自身免疫因素尚不清楚。因此，本研究旨在探索引起pSS肝臟病變的具體分子和可能機制。

NOD小鼠是公認的研究pSS的小鼠模型，本結果顯示NOD小鼠血清肝功能指標異常，這與JIANG等［15］的研究結果一致。另外，本課題組發現小鼠肝臟中有淋巴細胞浸潤，說明肝臟細胞受到了炎癥損傷。既往研究表明，致炎癥細胞因子IL-12會加重NOD小鼠pSS癥狀［8］。但是，IL-12是否與pSS肝臟損傷相關尚不清楚。本研究檢測了NOD小鼠血清和肝臟中IL-12水平，結果發現NOD小鼠中IL-12水平明顯升高。進一步研究發現，與野生型NOD小鼠相比，IL-12基因敲除NOD小鼠的唾液流率明顯增加，頜下腺中炎癥細胞浸潤數量和浸潤面積也相應減少。以往的研究發現IL-12轉基因小鼠唾液流率降低，唾液腺中淋巴細胞浸潤灶的數量、大小均增加，抗SSB/La抗體滴度增加，提示IL-12促進了pSS病情的進展［16-18］。這與本研究結論一致。另外，本研究發現IL-12基因敲除NOD小鼠肝功能指標，GPT和GOT也較野生型NOD小鼠改善，肝臟中浸潤的淋巴細胞也明顯減少。以上結果提示IL-12可能加重NOD小鼠pSS及其肝臟病變。

研究發現多種自身免疫性疾病中存在氧化應激狀態，在pSS中，血清或局部ROS和活性氮（reactive nitrogen species，RNS）增加，抗氧化酶表達降低，唾液腺、頜下腺、淚腺的損傷均與氧化應激有關［19-21］。本研究結果也驗證了以上研究結果，即pSS小鼠血清中GSH-PX、CAT和SOD降低。為了探索IL-12是否通過調節氧化應激參與pSS肝臟病變，課題組檢測了IL-12基因敲除NOD小鼠血清中氧化應激指標，結果發現，與野生型NOD小鼠相比，GSHPX、CAT和SOD的水平有所增加。以上結果提示，IL-12可能通過調節氧化應激參與pSS。為了明確IL-12通過調節pSS肝臟病變的直接證據，本研究應用IL-12處理肝臟細胞，結果發現IL-12使肝臟細胞的CAT、GSH、GSH-PX和SOD下降，而使肝臟細胞中MDA增加，以上結果提示IL-12會促進氧化應激狀態，從而參與pSS肝臟病變。

綜上所述，IL-12可加重pSS及其肝臟病變，而氧化應激指標是IL-12發揮作用的分子。以上結論有望為臨床pSS肝損傷患者的診斷提供新生物學標志物和治療新策略。