IL-10通過上調socs3抑制衣原體感染細胞炎癥因子表達

羅玲艷 杜昆 （長江大學附屬第一醫院輸血科，荊州 434000）

衣原體是一種全球普遍流行的性傳播疾病的病原體，常常感染生殖道、肛門直腸和口咽部的黏膜上皮細胞。女性生殖道感染衣原體后，易引起輸卵管性不孕及宮頸炎等并發癥［1-3］。有研究表明，衣原體感染后能誘導機體產生大量炎癥因子，如IL-6、IL-8、IL-12及TNF-α等，過度產生的炎癥因子會對機體組織造成損傷［4-5］。因此，有效抑制炎癥因子的產生可降低對機體組織的損傷。IL-10具有很強的免疫抑制能力，能防止過度炎癥對機體組織造成的損傷［6］。IL-10與其受體結合后，通過激活JAK/STAT信號通路發揮作用。STAT3能誘導細胞因子信號轉導抑制因子3（suppressors of cytokine signaling 3，SOCS3)蛋白產生，而SOCS3具有很強的抑制炎癥因子產生的能力。因此，推測IL-10可能通過誘導SOCS3蛋白抑制衣原體感染細胞炎癥因子的產生。本研究旨在探討IL-10抑制衣原體感染細胞炎癥因子的產生是否與SOCS3蛋白有關及其可能的機制，為衣原體感染防治工作提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料 沙眼衣原體L2血清型和HeLa細胞均由中南大學余平教授惠贈；DMEM培養基購自Invitrogen；RT-PCR試劑盒購自碧云天生物技術有限公司；ELISA試劑盒購自武漢博士德生物公司；人IL-10購自RD公司；所有抗體及socs3siRNA均購自Santa Cruz公司；Stattic購自Merck公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養與沙眼衣原體增殖 將HeLa細胞解凍后接種到50 cm2的細胞培養瓶中，DMEM培養基作為細胞培養液（含10%小牛血清）。細胞置于37 ℃、含5%CO2培養箱中培養，待細胞長成單層后用胰蛋白酶消化細胞并傳代培養。將沙眼衣原體L2懸液加入長有細胞的培養瓶中，2 h后棄上清，加入含有2 mg/L放線菌酮的細胞培養液繼續培養，感染48 h并收集細胞，反復凍融3次，3 000 r/min，10 min離心，吸取上清并于-80 ℃保存備用。

1.2.2 RT-PCR 提取培養細胞總RNA，然后按照試劑盒說明書進行逆轉錄。PCR擴增基因，socs3基因正向引物5'-ATGGTCACCCACAGCAAGTT-3'，反向引物5'-CTTAAAGCGGGGCATCGTACTG-3'；β-actin基因正向引物5'-AGGCTGTGCTGTCCCTCT-3'，反向引物5'-TCCGGTGAGGAGGATGCG-3'。擴增條件：95 ℃預變性15 min；94 ℃變性15 s，55 ℃退火10 s，40個循環；最后72 ℃延伸30 s。

1.2.3 ELISA檢測細胞因子 按試劑盒說明書進行。加100 μl標準品和已用樣品稀釋液稀釋的待測樣本到反應孔中，37 ℃反應90 min；吸棄液體，每孔加入100 μl相應抗體工作液，37 ℃反應60 min；洗滌3次，每孔加入100 μl ABC工作液，37 ℃反應30 min；洗滌5次，每孔加入90 μl TMB顯色液，37 ℃避光反應15 min；每孔加入100 μl終止液，在450 nm處測定OD值。

1.2.4 Western blot 實驗 提取細胞總蛋白，取80 μg蛋白加入2×SDS緩沖液中，100 ℃沸水中加熱5 min，冷卻后上樣電泳；4 ℃、80 V轉膜 2 h，5%脫脂奶粉封閉1 h；加入一抗4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3次；加入HRP 標記二抗，孵育1 h，洗膜3次。最后用ECL發光試劑盒檢測蛋白條帶。

1.3 統計學分析 采用SPSS26.0軟件統計分析數據，計量資料用±s表示，采用t檢驗，P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 IL-10上調沙眼衣原體感染細胞socs3基因表達 檢測外源性IL-10對STAT3的活化情況，結果如圖1A所示，沙眼衣原體對STAT3活化不明顯，但IL-10（10 ng/ml）能使磷酸化的STAT3蛋白增多。進一步研究在IL-10作用下socs3基因表達情況，結果如圖1B所示，衣原體感染和未感染細胞，在IL-10（10 ng/ml）的作用下，socs3mRNA表達明顯增強；但在抑制劑Stattic作用下，socs3mRNA表達明顯降低。加抑制劑組和未加抑制組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。

圖1 沙眼衣原體通過活化STAT3蛋白上調socs3基因表達Fig.1 Chlamydia trachomatis up-regulates socs3 expression by activating STAT3 protein

2.2 沙眼衣原體感染誘導IL-6、IL-12表達 用不同滴度的衣原體感染細胞，在感染后不同時間點檢測細胞培養上清中IL-6和IL-12產生情況。結果如圖2A、B所示，沙眼衣原體能誘導感染細胞產生IL-6和IL-12，且隨著感染時間的延長，產生的量越多；同時在感染相同的時間點，感染滴度越大，產生的量也越多。感染后12 h，不同滴度的衣原體誘導的IL-6和IL-12比較差異均有統計學意義（P＜0.05）；相同滴度的衣原體在感染不同時間誘導IL-6和IL-12比較差異也均有統計學意義（P＜0.05）。

圖2 沙眼衣原體感染誘導IL-6和IL-12表達Fig.2 Chlamydia trachomatis induces IL-6 and IL-12 expression in infected cells

2.3 IL-10通過誘導socs3抑制沙眼衣原體感染細胞IL-6、IL-12表達 用不同濃度的IL-10作用于衣原體感染細胞后檢測IL-6和IL-12表達情況，結果如圖3A所示，IL-10能明顯抑制IL-6和IL-12產生，差異具有統計學意義（P＜0.05）。由于IL-10能誘導socs3表達，而SOCS3蛋白具有抑制細胞因子產生的能力。采用RNA干擾抑制socs3表達，結果如圖3B所示，抑制socs3表達后，IL-10對IL-6和IL-12的抑制作用明顯減弱，差異具有統計學意義（P＜0.05）。

圖3 IL-10通過誘導socs3抑制沙眼衣原體感染細胞IL-6和IL-12表達Fig.3 IL-10 inhibits expressions of IL-6 and IL-12 in Chlamydia infected cells by inducing socs3

2.4 SOCS3蛋白抑制p38和ERK活化 利用RNA干擾抑制socs3基因轉錄，然后檢測p38和ERK1/2活化情況。結果如圖4所示，沙眼衣原體感染能活化細胞p38和ERK1/2信號通路，而IL-10（10 ng/ml）能抑制該信號通路；但當socs3基因轉錄被抑制時，IL-10抑制感染細胞p38和ERK1/2信號通路的作用明顯減弱。表明IL-10能通過SOCS3蛋白抑制p38和ERK1/2通路活化。

圖4 SOCS3蛋白抑制p38和ERK活化Fig.4 SOCS3 protein inhibits p38 and ERK activation

3 討論

病原微生物入侵機體后，機體免疫系統會通過多種不同方式清除入侵的病原體。其中，炎癥因子的產生是清除入侵病原體的重要因素之一［7］。然而，炎癥因子產生過多，導致機體炎癥過強，雖然有利于病原體的清除，但同時也會對機體組織造成不可逆性的損害［8-9］。衣原體具有二相性生活周期，其整個生活周期都必須依賴宿主細胞。女性生殖道感染沙眼衣原體后，會發生盆腔炎、宮頸炎等并發癥，嚴重時甚至會發生輸卵管性不孕［10-11］。因此，有效抑制衣原體感染后機體過強的炎癥反應，能減少并發癥的發生。

IL-10能抑制衣原體感染細胞炎癥因子的產生，然而對其機制的報道較少［12-13］。IL-10與其受體結合后，主要通過JAK/STAT信號通路產生作用。為研究IL-10抑制衣原體感染細胞炎癥因子產生的機制，課題組首先檢測了IL-10對STAT的活化情況。結果表明，沙眼衣原體對STAT3活化并不明顯，但IL-10能使磷酸化的STAT3蛋白增多，證實IL-10能有效激活STAT3蛋白。STAT3蛋白活化后進入細胞核內并調節許多基因的表達，其中socs基因是其重要的調節基因之一。為證實IL-10活化STAT3后是否調節socs3基因表達，本研究利用Stattic抑制STAT3活性，檢測在STAT3活性被抑制后，socs3基因表達是否發生變化。結果顯示，未加抑制劑時，在IL-10的作用下，衣原體感染和未感染細胞socs3基因表達明顯上調；但當加入抑制劑時，感染和未感染細胞socs3基因表達明顯降低；表明IL-10能通過STAT3蛋白誘導socs3基因表達。沙眼衣原體感染后能誘導感染細胞產生炎癥因子，課題組也進一步研究了本實驗中炎癥因子產生情況，用不同滴度的衣原體感染細胞，在感染后不同時間點檢測細胞培養上清IL-6和IL-12產生情況。結果顯示沙眼衣原體能誘導感染細胞產生IL-6和IL-12，且呈時間和劑量依賴性，與以往的報道相同［5，14］。由于IL-10有很強的抑制炎癥因子產生的能力，課題組繼續研究了IL-10是否能夠抑制衣原體感染細胞IL-6和IL-12的產生。課題組用3個不同濃度的IL-10作用于沙眼衣原體感染細胞，結果發現不同濃度的IL-10均能抑制IL-6和IL-12的產生，且隨著IL-10濃度的增加，抑制作用越明顯。課題組前期的研究顯示IL-10能誘導socs3基因表達，而SOCS3蛋白具有抑制細胞因子產生的能力［15］。為證實IL-10抑制IL-6和IL-12產生的能力是否與SOCS3蛋白有關，本研究通過RNA干擾抑制socs3基因表達，然后檢測socs3基因表達被抑制后，IL-10是否還能抑制IL-6和IL-12的產生。結果顯示，socs3基因表達被抑制后，IL-10的抑制作用明顯減弱。以上結果表明，IL-10有可能通過誘導SOCS3蛋白表達從而抑制衣原體感染細胞IL-6和IL-12產生。衣原體感染細胞后主要通過激活不同信號通路而誘導炎癥因子的產生，如p38、ERK1/2等信號通路［16-17］。為研究IL-10是否可能通過誘導SOCS3蛋白影響細胞信號通路，從而影響炎癥因子的表達。本研究通過RNA干擾抑制SOCS3蛋白表達，然后檢測p38和ERK1/2活化情況。結果顯示衣原體感染后，宿主細胞p38和ERK1/2信號通路被活化；當感染細胞預先加入IL-10時，該信號通路明顯被抑制；但當socs3基因表達被抑制時，IL-10抑制感染細胞p38和ERK1/2信號通路的作用明顯減弱。表明IL-10可能通過SOCS3蛋白抑制p38和ERK1/2通路活性。

總之，IL-10能活化STAT3蛋白并誘導SOCS3蛋白表達，進一步抑制p38和ERK1/2通路活化，從而抑制炎癥因子的產生。這可能是IL-10抑制沙眼衣原體感染細胞炎癥因子產生的機制之一。