膀胱癌共刺激因子相關基因預后模型的構建與驗證

湯鋕城 蔡月橋 廖海琴 盧澤潮 唐福才 盧澤廣 張嘉豪 賴永長 閻淑丹 何朝輝

（1.廣州醫科大學附屬第三醫院，廣州 510000；2.廣州醫科大學第一臨床學院，廣州 511436；3.廣州醫科大學第二臨床學院，廣州 511436；4.中山大學附屬第八醫院泌尿外科，深圳 518033；5.廣州醫科大學第六臨床學院，廣州 511436）

作為中國泌尿生殖系統中最常見的惡性腫瘤，膀胱癌發病率逐年攀升，即使應用根治性膀胱切除術，仍有約50%患者復發或遠處轉移，帶來沉重的社會負擔［1］。盡管基于順鉑的新輔助化療等新療法被應用于臨床，但仍存在療效不確切和治療反應差異大等難題，而基于新型生物標志物的靶向療法和免疫療法展現了光明的前景［2］。2016年以來，包括阿特朱單抗的5種免疫檢查點抑制劑已獲得美國食品和藥品監督管理局批準應用于一二線治療，標志著膀胱癌免疫治療開啟新篇章［3］。然而，僅有部分膀胱癌患者對特定的靶向治療有效，這很可能與某些基因位點突變密切相關［4］。因此，進一步探索膀胱癌中的免疫反應機制、開發新型生物標志物以評估患者的病情進展和指導個性化治療，對改善預后至關重要。

腫瘤微環境（tumor microenvironment，TME）是腫瘤發展、侵襲和轉移的關鍵點，不僅與惡性表型密切相關，也顯著影響治療效果［5］。TME主要由駐留的基質細胞和被招募的免疫細胞組成。研究表明，基質細胞與腫瘤細胞間的相互作用很可能參與胰腺癌、乳腺癌和膀胱癌等腫瘤的動態發展過程，并顯著影響患者預后［6-8］。WU等［9］研究表明，膀胱癌中的腫瘤浸潤免疫細胞豐度與患者預后密切相關。在TME中，T細胞的活化需要雙信號刺激，第一信號來自抗原，第二信號來自抗原提呈細胞，其提供的共刺激信號決定T細胞活化的方向。共刺激信號的缺失會導致T細胞不能被激活，并中止后續免疫過程，癌細胞可能通過這種方式實現腫瘤逃逸。作為潛在的治療靶點，共刺激因子近年備受關注。ENDER等［10］通過實驗表明，共刺激因子相關基因敲除顯著影響了系統性紅斑狼瘡、非肥胖性糖尿病等自身免疫病模型小鼠的生存情況。此外，共刺激因子也在癌癥的進展中起關鍵作用，研究證實，在肝細胞癌、頭頸鱗狀細胞癌中，共刺激因子相關基因與患者免疫治療反應和預后密切相關［11-13］。泌尿系統腫瘤中也有相關報道，在透明細胞腎細胞癌中，基于CMS的預后模型已被證實為腎透明細胞癌患者的獨立預后相關因素［14］。然而，目前關于膀胱癌中共刺激因子的表達模式和臨床意義的研究鮮有報道。綜上，課題組推測共刺激因子可能在膀胱癌進展中發揮重要作用，可能基于此開發新的生物標志物和預后模型。

本研究旨在篩選出影響膀胱癌患者預后的共刺激因子相關基因，并根據獲得的基因建立模型，進一步探索其背后機制。本研究從TCGA數據庫下載并分析了mRNA的表達數據集，篩選出3個具有顯著預后價值的基因，并構建預后風險模型，再于多數據集中驗證其有效性。此外，通過功能富集和免疫浸潤分析，比較高低風險組的免疫浸潤水平和生物通路差異，以探究膀胱癌發展機制。

1 資料與方法

1.1 數據的獲取與整理 通過腫瘤基因組圖譜（TCGA）數據庫下載人類膀胱癌患者的基因表達矩陣和臨床數據，剔除數據缺失樣本后，包含389例膀胱癌組織樣本和19例癌旁正常組織，隨機分為TCGA訓練組（n=287）和TCGA驗證組（n=121）。通過基因表達數據庫（GEO）下載GSE31684數據集的mRNA表達譜，剔除數據缺失樣本后包含93例膀胱癌組織樣本。

1.2 免疫評分和基質性評分的生成 免疫評分（estimate）是一種可用于評估腫瘤組織中基質細胞和免疫細胞浸潤水平的算法工具，由YOSHIHARA等［15］首創，可較為準確地預測非腫瘤細胞的浸潤情況。利用R包estimate進行基質和免疫微環境浸潤評估，得出StromalScore和ESTIMATEScore，分別與基質細胞、免疫和基質細胞之和呈正相關，相應分數越高，提示TME中相應成分比例越大。

1.3 共刺激因子相關基因預后模型的建立 Cox回歸模型是一種通過乘以風險系數解釋協變量對總體效能的模型，常被用于評估諸如年齡、性別等患者臨床性狀對生存率的預測價值［16］。多變量Cox比例回歸模型被廣泛應用于確定預后相關因子，并通過確定參數β和基因表達量計算獲得風險評分［17］。檢索最新文獻，獲得60個與共刺激因子相關的編碼基因。為獲得預后相關基因并建立風險評分模型，使用R包Survival在TCGA驗證組基因集進行單因素Cox比例風險回歸分析，獲得預后顯著相關的基因（P＜0.05）。再進行多因素Cox比例風險回歸分析，獲得獨立預后相關基因（P＜0.05），并構建風險評分公式。此公式由基因表達水平相應回歸系數進行加權后的線性組合確定。

1.4 預后模型的評價 根據風險評分中位數將患者分為低風險組和高風險組。使用R包pheatmap可視化兩組患者的生存情況和共刺激因子相關基因的表達量；使用R包Survminer繪制生存曲線比較兩組的總生存期；使用R包Survival進行單因素及多因素Cox回歸分析，并繪制森林圖可視化風險評分、年齡、性別、臨床分期、TMN分期與患者預后的相關性；通過R包timeROC繪制受試者工作特征（ROC）曲線，用以驗證風險評分模型的準確性。

1.5 列線圖的構建和驗證 為建立一個預測膀胱癌患者預后的臨床工具，綜合考慮風險評分模型與臨床特征（根據文獻報道，年齡≥65歲很可能是重要預后危險因素，因此將膀胱癌患者按年齡≥65歲或＜65歲分為高、低齡組［18］），并利用R包nomogramEx構建了列線圖模型。該模型能夠分析1年、3年和5年的生存概率。此外，為可視化實際情況與預測結果間的一致性，利用R包rms繪制校準曲線，其45°線代表最佳預測效能。

1.6 基因集合富集分析（Gene Set Enrichment Analysis，GSEA） 為分析膀胱癌患者在高風險組和低風險組之間的信號通路差異，進行功能富集分析。導入MsigDb數據庫的c2.cp.kegg.v7.5.1.symbols.gmt作為參考基因集，使用GSEA軟件（4.1.0）對標準化后的芯片矩陣進行分析。設置基因置換排列次數為1 000，P＜0.05和錯誤發現率（FDR）＜0.25為差異有統計學意義。

1.7 免疫浸潤分析 CIBERSORT是一種通過實體腫瘤中的基因表達值評估組織細胞組成的方法［19］。利用CIBERSORT分析免疫細胞浸潤的程度及不同類型免疫細胞的比例。

1.8 統計學分析 研究中的所有統計分析均采用R語言（版本4.1.1）進行。采用皮爾遜相關性算法計算相關性。采用Kaplan-Meier（KM）生存分析評估生存情況，并采用對數秩級檢驗評估分層組間的差異。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 臨床數據與ESTIMATE免疫評分 TCGA數據集患者的臨床信息見附表1（www.immune99.com），包含生存時間、生存狀態、年齡、性別、癌癥級別、TNM分級。為評估TME中基質組分與免疫組分的占比與膀胱癌患者臨床分期的相關性，通過ESTIMATE分析免疫評分與組織學分級（grade）、臨床分期（stage）的相關性。結果顯示，高組織學組ESTIMATEScore評分顯著增高（圖1A），且臨床分期Ⅱ組與臨床分期Ⅳ組之間的ESTIMATEScore評分差異有統計學意義（圖1B）。StromalScore評分同樣與組織學分級呈正相關（圖1C），不同臨床分期間StromalScore評分也存在明顯差異（圖1D）。以上結果提示，膀胱癌患者的臨床分期及組織學分級與TME中免疫細胞浸潤密切相關。

表1 TCGA訓練組中預后相關的共刺激因子相關基因單因素Cox分析結果Tab.1 Univariate Cox analysis of prognostic costimulatory genes in TCGA training group

圖1 TCGA數據集中TME免疫評分箱型圖Fig.1 Box plot of ESTIMATE score in TCGA dataset

2.2 基于CMS的風險評分的構建與驗證 對60個CMS相關基因進行單因素Cox回歸分析，篩選得到4個與預后顯著相關的基因，結果如表1所示。利用多因素Cox比例風險回歸分析確定獨立預后因素并優化模型，最終篩選出3個基因：TNFRSF14、CD276、ICOS?；?個基因的表達水平和回歸系數構建風險公式：風險評分=（-0.026 040 787 258 630 7）×TNFRSF14+（0.015 842 801 886 645 3）×CD276+（-0.279 64）×ICOS。

根據中位數將患者分為高風險組和低風險組。在TCGA訓練組中，散點圖結果顯示，高風險組患者存活率更低（圖2A）；基因表達熱圖提示，高/低風險組中這3個基因的表達量有明顯差異（圖2B）；繪制KM曲線可視化患者的生存情況，高風險組的生存率明顯較低（圖2C）。在TCGA驗證組和GEO組中評估患者的生存狀態和基因表達情況（圖2D～I）得到相同結論：低風險組患者存活率更高，3個CMSs表達水平差異顯著且總生存期較長。

圖2 CMS預后模型的建立與驗證Fig.2 Establishment and validation of CMS prognostic model

為進一步探究風險評分及其他臨床特征與膀胱癌患者預后的關系，進行單因素Cox及多因素回歸分析。單因素Cox回歸分析結果顯示，臨床分期（stage）、T分期、M分期、N分期、風險評分均與預后顯著相關（圖3A）。多因素Cox回歸分析結果顯示風險評分是膀胱癌患者的獨立預后因素（圖3B）。

圖3 風險評分與臨床特征的單因素和多因素Cox回歸分析森林圖Fig.3 Forest map of univariate and multivariate Cox analysis of risk score and clinical characteristics

在TCGA訓練組、TCGA驗證組和GEO組中繪制風險評分和年齡、性別等臨床特征的ROC曲線，三組的風險評分在ROC曲線中所對應的1年AUC值分別為0.698、0.706、0.620（圖4），均高于其他臨床特征。ROC分析結果提示，基于CMS的風險評分模型對膀胱癌患者的預后評估準確性優于傳統臨床特征。

圖4 TCGA訓練組、TCGA驗證組和GEO驗證組中風險評分及其他臨床特征的ROC曲線Fig.4 ROC curves of risk scores and other clinical features among TCGA training group， TCGA validation group and GEO group

2.3 預后列線圖的構建與驗證 綜合考慮臨床分期、風險評分等臨床病理特征構建了預測總生存期的列線圖。將預后相關因素在點軸上對應的評分相加可得到總得分，再向下繪制到1年、3年、5年的生存軸，可預測1年、3年、5年的生存率。由圖5可知，大部分患者的總分為190～240分。

圖5 1年，3年和5年總生存期的預后預測列線圖Fig.5 Nomogram for predicting 1- ，3- and 5-year OS

為檢驗列線圖的預后預測效能，使用校準曲線進行驗證。結果顯示，在TCGA訓練組和GEO驗證組中，預測結果與實際觀測具有良好的一致性（圖6A、C）。隨后，對列線圖預測結果的準確性進行評估，訓練組在ROC曲線中對應的1年、3年、5年的AUC值分別為0.740、0.710、0.718（圖6B），驗證組在ROC曲線中對應的1年、3年、5年的AUC值分別為0.730、0740、0.718（圖6D）。綜上所述，基于CMS的列線圖顯示出良好的預后預測效能。

圖6 TCGA組和GEO組中列線圖1年、3年及5年總生存期校準曲線與ROC曲線Fig.6 1-， 3- and 5 year OS correction curve and ROC curve of bladder cancer patients in TCGA and GEO group

2.4 基因集合富集分析 通過GESA方法分析TCGA數據集和GEO數據集中高、低風險組間差異的生物功能通路。結果顯示，高風險組主要富集在細胞外基質（extracellular matrix，ECM）互作受體、抗原處理與提呈、自身免疫性甲狀腺病、卵母細胞成熟分裂、細胞周期等功能通路中；低風險組主要富集在1型糖尿病、產生IgA的腸道免疫網絡、系統性紅斑狼瘡等功能通路中（圖7）。

圖7 基于CMS構建的預后模型得到高、低風險組基因富集通路Fig.7 Gene enrichment analysis of high and low risk groups based on CMS risk score

2.5 免疫浸潤分析 為研究膀胱癌中腫瘤浸潤免疫細胞含量情況，使用CIBERSORT算法計算TME浸潤免疫細胞。藍色為高風險組，紅色為低風險組。如圖8所示，差異浸潤免疫細胞組分的箱形圖顯示，CD8+T細胞（P＜0.001）、濾泡輔助性T細胞（P＜0.01）、調節性T細胞（P＜0.001）、活化的NK細胞（P＜0.05）在低風險組中更豐富，M0巨噬細胞（P＜0.001）則在高風險組浸潤程度更高。

圖8 高、低風險組間不同免疫細胞組成的小提琴圖Fig.8 Violin plot of different immune cell components between high and low risk groups

3 討論

作為全球范圍內常見癌癥之一，膀胱癌2020年報告新增病例約573 000例，男性患者多見，病死率居高不下，造成巨大社會負擔［20］。因其早期診斷困難，易遠處轉移和復發的特點，膀胱癌患者的預后始終較差［2］。近年來，免疫治療展現出光明前景，促使與之密切相關的TME重回大眾視野［21］。ZHOU等［22］研究提示，在膀胱癌中，腫瘤浸潤性B淋巴細胞的長鏈非編碼RNA可能成為TME中的免疫細胞浸潤指標，用以預測免疫治療療效；CHEN等［23］則從細胞焦亡方面證實了TME浸潤對膀胱癌免疫治療策略的指導意義重大。

作為TME的重要調控分子，共刺激因子已成為時下研究熱點。其被證實在不同腫瘤的發展中發揮雙向調控作用：TNFRSF14高表達淋巴瘤患者往往預后較差，而TNFRSF14過表達與膀胱癌細胞凋亡和增殖減慢相關［24-25］。作為預后評估指標，其已在肺腺癌、神經膠質瘤和頭頸部鱗狀細胞癌等惡性腫瘤中有相關研究，并取得一定進展［26-28］。而在膀胱癌中，相關研究鮮有報道。綜上所述，課題組設計本研究以篩選潛在預后生物標志物，并探究共刺激因子在膀胱癌進展的可能機制。

免疫評分結果顯示，TME中免疫和基質成分比例與患者臨床與組織學分期密切相關：免疫評分越高，組織學分級、臨床分期越高，患者預后越差，表明免疫細胞浸潤在膀胱癌的進展中發揮重要作用。隨后，從相關文獻中選取60個與共刺激因子相關的編碼基因，通過單因素和多因素Cox回歸分析，篩選預后相關基因并優化模型，最終得到TNFRSF14、CD276、ICOS 3個基因，并開發了一種新的生存預測風險評分。生存分析顯示，高風險組患者總生存期明顯較短，存活率較低。該模型在TCGA驗證組和GEO組中均得到了良好的驗證。多因素Cox分析也證明，該風險評分模型是膀胱癌患者的獨立預后因素。以上結果提示，基于CMS的預后模型有較好的預測準確性，篩選出的TNFRSF14、CD276、ICOS可能成為膀胱癌診斷或免疫治療的潛在靶點。

TNFRSF14又稱皰疹病毒進入介質（HVEM），作為TNFRSF家族成員之一，可與TNF家族成員LIGHT交聯刺激T細胞，從而促進T細胞增殖和細胞因子產生，也可與BTLA結合，觸發T細胞的抑制信號［29］。文獻報道，在黑色素瘤等腫瘤中，HVEM在腫瘤細胞中的表達比PD-L1更廣泛，有作為預后標志物的潛在價值［30］。WANG等［31］發現TNFRSF14可能通過Wnt-β-catenin依賴途徑在膀胱癌進展中發揮作用，其可能是一種腫瘤抑制因子，與本研究結果一致。CD276也稱B7-H3，是上皮-間質轉化途徑中的免疫檢查點因子。LIU等［32］研究表明，在膀胱癌、乳腺癌等癌組織中，CD276的表達水平較癌旁組織顯著上調。研究證實，CD276與CTLA-4具有協同作用，可在乳腺癌腫瘤、黑色素瘤、肝細胞癌和宮頸癌等癌癥的增殖和進展方面起到關鍵作用［33-34］。此外，CD276也在膀胱癌中的研究取得一定進展：ZHENG等［35］研究表明，在膀胱癌中，CD276高表達者免疫治療后預后顯著優于低表達者。ICOS（CD278、AILIM、H4）屬于B7-CD28/CTLA-4家族成員，在多種癌癥進展發揮作用：AMATORE等［36］指出，一方面，ICOS促進細胞毒性T細胞激活，發揮抗腫瘤作用；另一方面，ICOS通過調節性T細胞增加腫瘤免疫逃逸的機會，促進腫瘤發展。數據研究表明，在非小細胞肺癌中，ICOS可顯著增強CTLA-4抑制劑的療效［37］；但在黑色素瘤患者中，ICOS擴增預示著更差的預后［38］。而ICOS與膀胱癌的關系鮮有研究，LIAKOU等［39］設計術前臨床試驗發現，應用抗CTLA-4的單克隆抗體后，患者外周血和腫瘤組織中ICOS濃度顯著增加，可反映治療進展。本研究側面驗證ICOS可能是CTLA-4單抗發揮抗腫瘤活性的重要一環，具有用于監測和指導用藥的潛在價值。

通過GSEA探索相關生物通路，結果主要富集在以下3個功能通路：ECM-受體相互作用、卵母細胞減數分裂、細胞周期。ECM是一種非細胞的三維大分子網絡，由膠原蛋白，蛋白聚糖/糖胺聚糖、彈性蛋白、纖連蛋白、層狀體和糖蛋白組成，其在細胞的生長、分化、存活和形態轉換的過程中舉足輕重［40］。ECM在TME中含量豐富，據RIEGLER等［41］研究，膠原蛋白和ECM與腫瘤細胞生物行為方面的功能密切相關。ECM在癌癥等疾病中呈現混沌狀態，ECM異常將促進細胞分化與轉移，加速癌癥進程［42］。文獻報道，ECM微環境Ⅰ型膠原蛋白的變化可能會促進非肌層浸潤性膀胱癌的進展［43］。細胞周期是所有生物體細胞生長和繁殖的共有過程，包括在有絲分裂期間染色體DNA的復制［44］。大量實驗已證實，誘導白血病細胞的G2/M期的細胞周期停滯，可發揮抗腫瘤作用［45］。此外，多項研究表明，卵母細胞的減數分裂和細胞周期通路是膀胱癌的顯著富集信號通路［46-47］。綜上，課題組推測，膀胱癌細胞可能通過影響減數分裂過程，改變正常細胞周期，并誘導ECM，促進ECM-受體相互作用，完成其增殖和侵襲，而阻斷細胞周期和抑制黏附信號轉導可能成為膀胱癌的潛在治療方法。

膀胱癌發生發展與免疫密不可分，免疫浸潤分析結果顯示，高?；颊吆芸赡芴幱诿庖咭种茽顟B。CD8+T細胞及濾泡輔助性T細胞浸潤程度低，M0巨噬細胞浸潤程度高，對腫瘤抑制力弱，且難以刺激B細胞增殖產生后續抗體。低?；颊叩腃D8+T細胞浸潤程度高，提示這些患者的抗腫瘤免疫應答可能處于相對活躍的狀態，與理論分析一致。

本研究所建立的基于CMS的預后模型具有較好的預后預測準確性，但仍然具有局限之處。首先，本研究的病例均為回顧性樣本，未獲得前瞻性研究驗證。其次，本研究主要基于TCGA和GEO在線數據庫的相關數據進行研究，亞裔樣本量小，分析結果具有一定的提示作用，但結論尚需結合實際情況和臨床成果進一步驗證。

綜上所述，本研究篩選出TNFRSF14、CD276、ICOS 3個基因，它們有可能成為膀胱癌潛在的預后標志物和治療靶點；基于CMS建立了膀胱癌患者的預后模型和臨床列線圖，可較為準確地預測膀胱癌患者的預后，并反映癌組織中不同免疫細胞的浸潤程度，有助于膀胱癌患者早期預后評估和治療方案選擇。