納米材料介導植物遺傳轉化的研究進展

楊得民 曹婷婷 呂敏 陳楠

DOI：?10.3969/J.ISSN.1000-5137.2024.01.016

收稿日期：?2023-11-01

基金項目：?國家自然科學基金（21974089）

作者簡介：?楊得民（1999—），?男，?碩士研究生，?主要從事納米材料用于植物基因表達調控等方面的研究. E-mail：15629733873@163.com

* 通信作者：?陳?楠（1979—），?女，?研究員，?主要從事納米生物效應、?納米熒光探針及納米藥物等方面的研究. E-mail：Nchen@shnu.edu.cn

引用格式：?楊得民，?曹婷婷，?呂敏，?等. 納米材料介導植物遺傳轉化的研究進展?［J］. 上海師范大學學報?（自然科學版中英文），?2024，53（1）：120?128.

Citation format：?YANG D M，?CAO T T，?LYU M，?et al. Research progress of nanomaterials in plant genetic transformation ［J］. Journal of Shanghai Normal University （Natural Sciences），?2024，53（1）：120?128.

摘??要：?植物遺傳轉化對于改善農作物的性狀，培育高產、優質、多抗性的新品種，從而降低農藥和肥料的使用量等至關重要. 傳統的遺傳轉化方法存在著諸多局限性，如物種的不普適性，植物組織易被破壞，成本高、耗時長和轉化效率低等. 近幾年，納米材料介導的植物遺傳轉化策略逐漸被研究和嘗試，并顯示出了不受物種限制、生物相容性良好和操作簡單等一系列優勢. 文章對常用的傳統遺傳轉化方法進行了總結，重點介紹了近年來多種納米材料在植物遺傳轉化中的研究和應用進展，并討論和展望了納米材料在植物遺傳轉化應用領域的挑戰和發展前景.

關鍵詞：?納米材料；?納米基因載體；?植物遺傳轉化；?基因表達調控

中圖分類號：?Q 943.2 ???文獻標志碼：?A ???文章編號：?1000-5137（2024）01-0120-09

Abstract：?Plant genetic transformation is crucial for improving quality of crop straits，?cultivating new varieties with high yield，?improved quality，?and multi-resistance，?thereby reducing the use of pesticides and fertilizers. Traditional genetic transformation approaches have great limitations，?including the non-universality of species，?susceptibility to plant tissue destruction，?high cost，?long time consumption，?and low transformation efficiency. In recent years，?strategies for plant genetic transformation mediated by nanomaterials have been developed and attempted，?and have shown a series of advantages such as no species limitation，?good biocompatibility，?and simple operation. This review introduces the commonly used traditional genetic transformation methods and focuses on the recent research and application progress of various nanomaterials in plant genetic transformation. Finally，?the challenges and prospects in the field of plant genetic transformation are discussed.

Key words：?nanomaterials；?nano-gene vetors；?plant genetic transformation；?regulation of gene expression

0 ?引?言

植物遺傳轉化指利用物理、化學方法或借助載體，將外源遺傳物質導入植物受體細胞，并整合到受體細胞的染色體中，從而調控目的基因在受體植物中的表達水平，達到改變植物性狀以及培育植物新品種的目的. 植物遺傳轉化技術是植物基因工程的關鍵，傳統的植物遺傳轉化方法主要包括農桿菌介導法、聚乙二醇（PEG）介導法、脂質體介導法、基因槍法、花粉管通道法和超聲波法等.

盡管植物遺傳轉化技術取得了許多突破，但仍遠落后于動物基因工程的發展. 植物細胞的細胞壁由纖維素、半纖維素、果糖和少量結構蛋白構成［1］，參與調節細胞的形狀和擴張、控制組織凝聚以及抵御微生物或病原體等生理功能［2］，細胞壁的存在使外源物質難以進入細胞內部，僅允許小粒徑的生物分子通過，極大程度地阻礙了外源基因載體進入植物細胞內部發揮功能. 因此，許多現有的基因轉導技術很難被應用于植物遺傳轉化［3］.

20世紀末，隨著納米技術的迅速發展，納米材料因其尺寸小、比表面積大、生物兼容性較好等優點被廣泛用作基因載體應用于生物醫學領域［4］. 近年來，研究者們嘗試將納米材料應用于植物遺傳轉化領域，并展示出了巨大的潛力. 目前，納米材料已經被作為核酸載體應用于煙草、棉花、水稻等植物［5］. 本文介紹了兩種最常用的傳統遺傳轉化方法以及納米材料介導的基因傳遞系統的研究現狀，并且討論了不同種類納米材料在介導植物基因傳遞方面的特點和優勢.

1 ?常用的植物遺傳轉化手段

1.1 農桿菌介導法

農桿菌侵染植物后，借助毒力蛋白將T-DNA插入植物細胞中. 毒力蛋白協助T-DNA從農桿菌轉運至植物細胞壁和質膜，并促進T-DNA整合到植物核基因組中，從而實現遺傳轉化. 1977年，CHILTON等［6］首次利用農桿菌介導法實現了質粒DNA（plasmids DNA，pDNA）向植物細胞中的有效遞送. 自此以后，農桿菌介導的植物遺傳轉化得到了迅速發展，目前已廣泛應用于多種雙子葉植物，如大豆［7］、棉花［8］、番茄［9］和煙草［10］等. 農桿菌介導的遺傳轉化依賴于化學物質誘導，如植物受傷后釋放的酚類物質乙酰丁香酮和α酰羥基乙酰丁香酮［11］，能夠誘導農桿菌吸附在植物傷口處，從而使農桿菌T-DNA發生轉移，實現基因轉化. 由于這些酚類物質通常不存在于單子葉植物，導致農桿菌介導的遺傳轉化應用范圍受到限制，遺傳轉化效率很低. 1984年，HERNALSTEENS等［12］首次利用農桿菌成功實現了單子葉植物石刁柏的遺傳轉化，為實現農桿菌介導的單子葉植物遺傳轉化提供了可能性. 近年來，農桿菌介導的轉化已經被成功應用于少部分農作物，如水稻［13］、小麥［14］和玉米［15］.

農桿菌介導法是目前研究最為成熟、應用最為廣泛的植物遺傳轉化方法. 其優勢在于操作相對簡單，重復性高且成本較低. 然而，該方法也存在一些明顯的缺陷：（1）?由于農桿菌的侵染特點，大多數單子葉植物都不會自然地被農桿菌所侵染；（2）?單子葉植物的轉化效率遠低于雙子葉植物；（3）?由于農桿菌侵染后，外源DNA被隨機整合到植物基因組中，很可能導致植物出現不理想的農藝性狀.

1.2 基因槍法

1987年，KILEIN等［16］首次開發了biolistic技術，即基因槍技術，也稱為粒子轟擊技術，并首次使用該技術將攜帶DNA的鎢顆粒轟擊進入洋蔥表皮細胞，成功轉化了洋蔥表皮細胞［17］. 隨著研究人員對物理參數、環境和生物條件的優化，改進后的基因槍法能夠轉化不同的受體材料，包括原生質體［18］、愈傷組織［19］、花粉［20］等. 與農桿菌介導法相比，基因槍法較少受到植物種屬的限制，適用范圍更廣，如CAIMI等［21］成功將解淀粉芽孢桿菌的SacB基因轉入單子葉植物玉米，促進了具有較高經濟價值的果聚糖合成，顯示出了該方法在農作物育種改良中的應用潛力. 基于其受體植物物種的多樣性，操作簡便以及可以轉化高達150 kb分子量的DNA等優點，基因槍法在植物基因工程中得到了廣泛的發展. 然而基因槍法也存在局限性：一方面粒子轟擊系統所使用的設備及材料（如金顆粒和基因槍等）較為昂貴，增加了遺傳轉化的成本；另一方面，粒子轟擊容易對植物造成損傷，導致其轉化效率降低，以及轉化后的DNA片段容易發生斷裂，進一步限制了轉化的成功率.

2 ?納米材料介導的植物遺傳轉化

與傳統的植物遺傳轉化方法相比，納米材料介導的基因遞送策略具有多種優勢，例如細胞毒性較低、操作簡單和不受物種限制且能同時遞送多種生物分子等. 此外，納米材料還具有易于設計和改性的獨特優勢，例如，納米材料可經過表面修飾后，實現針對特定植物細胞器（葉綠體［22］和線粒體［23］）的靶向遞送. 目前，已有多種納米材料被報道應用于植物體內的基因表達調控，主要包括碳基、納米金、層狀雙氫氧化物（LDH）和肽載體等納米材料.

2.1 碳基納米材料在植物中遺傳轉化的應用

碳基納米材料因具有出色的光學性能、良好的生物相容性、豐富的表面官能團等優點，被廣泛應用于電子、傳感、納米醫學等各個領域. 碳納米管、碳點、石墨烯和氧化石墨烯等是碳基納米材料家族的主要成員. 已有大量研究聚焦于碳基納米材料與哺乳動物之間的相互作用，然而將其應用于植物基因遞送的研究目前仍處于起步階段，其作為植物遺傳轉化中的基因遞送載體的效率和相關機制仍在探索中.

2.1.1 碳??點

碳點是直徑小于10 nm的零維碳納米材料，因其優異的光學性能，良好的生物相容性而被廣泛應用于生物醫學、光催化等領域. 近年來，碳點在植物方面的研究主要聚焦于其對于植物生長、發育［24］、光合作用［25］和抵抗生物脅迫［26］的影響等. 碳點的小粒徑和表面豐富的官能團為其負載核酸，穿過細胞壁提供了可能性，因此研究人員嘗試將碳點應用于植物核酸遞送中. 碳點通常因表面帶羥基或羧基而呈負電荷，WANG等［27］將聚乙烯亞胺（PEI）引入碳點表面，使其帶正電荷，并通過靜電吸附攜帶pDNA，在水稻、小麥、綠豆等多種植物中實現了基因遞送和功能的表達，成功誘導水稻葉片組織產生了潮霉素抗性，如圖1（a）所示. SCHWARTZ等［28］使用PEI作為碳源，通過溶劑熱反應合成了用于吸附siRNA（小干擾RNA，small interfering RNA）的水溶性碳點，該納米復合物進一步與非離子型表面活性劑混合制備成制劑，使用低壓噴霧方法噴灑至煙草和番茄葉片上，沉默了綠色熒光蛋白（GFP）和內源性基因鎂螯合酶H亞基（Magnesium Chelatase H，CHLH，一種葉綠素合成關鍵酶），如圖1（b）所示，成功觀察到葉片白化，并通過定量聚合酶鏈反應證明了相關基因mRNA轉錄水平的降低，如圖1（c）所示.

圖1 碳點在植物遺傳轉化中的應用. （a）?利用碳點將潮霉素抗性基因導入水稻葉片中，?成功誘導水稻產生潮霉素抗性［27］；利用碳點將用于沉默CHLH的siRNA注入煙草葉片中，成功實現相關基因敲除［28］；?（b）?煙草葉片表現出葉片白化（白色箭頭所指）；?（c）?CHLH的轉錄本分析. 葉片處理后5 d，?從四株植物的4片葉子中取樣進行實時熒光定量PCR（RT-qPCR）分析

2.1.2 碳納米管

碳納米管可分為直徑為1～3 nm的單壁碳納米管（SWCNTs）和直徑為5～40 nm的多壁碳納米管（MWCNTs）［29］. 使用碳納米管作為核酸遞送系統的相關研究在哺乳動物體系取得了理想的結果，但很少有人關注其在植物基因遞送方面的研究.

LIU等［30］首次驗證了SWCNTs能穿過完整的植物細胞，使用SWCNTs攜帶異硫氰酸熒光素（FITC）標記的單鏈DNA，通過與煙草黃亮細胞BY-2共孵育，在共聚焦熒光顯微鏡下觀察到了明顯的FITC綠色熒光，該工作證明了無需外部幫助（例如粒子轟擊），攜帶DNA的SWCNTs即可成功進入完整的植物細胞. 在此之后，使用碳納米管向植物中遞送其他生物分子的相關研究逐漸被報道. DEMIRER等［5］通過共價結合的方式使用PEI對SWCNTs進行修飾（PEI-SWCNTs），使其表面呈正電，靜電吸附pDNA，負載在碳納米管上的pDNA不會受到核酸內切酶的影響而被降解. 該工作首先將DNA-Cy3負載在PEI-SWNT表面，DNA-Cy3與內源性GFP共定位結果表明：與裸DNA-Cy3不同，負載在PEI-SWNTs上的DNA能被遞送進入成熟植物葉片中；隨后，使用PEI-SWCNTs攜帶表達GFP的質粒DNA，將其注射到不同植物葉片中，包括雙子葉植物煙草、芝麻、棉花和單子葉植物小麥，在其葉片中均觀察到了明顯的綠色熒光，并通過定量聚合酶鏈反應證明了GFP的表達，如圖2所示. 該工作證明了在不依賴外力（如基因槍）的條件下，SWCNTs能夠實現植物的基因遞送，并且不受植物種屬的限制. 通過對碳管表面進行修飾，還能實現針對植物細胞器的靶向遞送. KWAK等［22］通過在SWCNTs表面共價結合殼聚糖，可在不需要外力輔助的情況下實現pDNA的葉綠體靶向遞送. 使用該復合納米材料遞送pDNA進入分離的原生質體和成熟植物的葉綠體中，成功實現了黃色熒光蛋白的瞬時表達. 在后續研究中，SANTANA等［31］開發了靶向葉綠體的碳基納米管材料，通過植物生物識別的方法提高了靶向遞送效率. 在該研究中，研究人員在SWCNTs表面修飾能靶向葉綠體的肽，該肽可以選擇性地結合葉綠體膜上的蛋白質易位子外通道（TOC），從而實現靶向遞送，成功提高了pDNA在葉綠體中的表達. LAW等［23］利用類似的方式實現了pDNA在成熟植物葉片的線粒體中表達. RNA干擾（RNA interference，RNAi）可以實現有效的轉錄后基因沉默，有利于研究和控制植物的代謝途徑以及構建抗病毒植物等. 局部應用小干擾RNA來激活RNAi，可幫助植物功能基因組學的研究、作物改良和作物保護等. siRNA的高效遞送是該技術發展的主要障礙. DEMIRER等［32］利用π-π堆疊的方式構建了siRNA-SWCNTs系統. SWCNTs可以保護RNA免受核酸酶的降解，該工作實現了RNA向成熟植物細胞中遞送，并有效沉默了突變體植物的GFP基因.

圖2 SWCNTs遞送pDNA進入植物細胞中［5］. （a）?SWCNTs攜帶DNA進入植物細胞中并實現表達示意圖；（b）?不同植物葉片中瞬時GFP表達的共焦顯微鏡圖像

2.2 納米金

使用基因槍將DNA包覆的納米金顆粒注入植物組織，從而實現遺傳轉化的方法已經得到了廣泛研究，但納米金本身是否可以作為介導外源基因進入植物細胞的載體尚待研究. 納米金有著超小的尺寸（小于10 nm），使得納米金有機會穿過植物細胞壁. ZHANG等［33］合成了PEI功能化的金納米團簇（PEI-AuNCs）. PEI-AuNCs通過靜電吸附的形式負載siRNA，可以有效地保護siRNA不被降解. 該研究觀察了PEI-AuNCs在20 min至24 h的內化程度，結果表明：在滲透1 h時，其內化程度最高，1 h后內化程度逐漸降低. 該工作設計了針對GFP基因的siRNA，PEI-AuNCs可以成功地將siRNA傳遞到表達GFP的成熟煙草葉片中；通過RT-qPCR分析和蛋白質印跡實驗（Western Blot），分別驗證了靶基因的敲除. 在該課題組的另一項研究中，ZHANG等［34］合成了4種不同直徑的納米金顆粒（5，10，15和20 nm）和納米金棒（13 nm×68 nm，長寬比為5.2），用于遞送siRNA到成熟植物葉片中，他們發現顆粒形狀是影響納米金載體內化和基因傳遞效率的關鍵因素，如圖3（a）所示. 結果顯示：金棒可以通過一定角度穿過細胞壁并被細胞內吞，實現RNA的遞送，如圖3（b）所示. 而金球載帶siRNA并不需要穿過細胞壁，通過附著在細胞壁上也能實現基因沉默，并且10 nm金球具有更高的基因沉默效率，如圖3（c）所示. 該結果提示了納米載體的內化機制需要進一步研究探索.

圖3 納米金進入植物細胞的機制探索［34］. （a）?金球和金棒附著或內化到植物細胞中的機制示意圖；（b）?金棒穿過植物細胞壁電鏡圖；?（c）?不同尺寸金球附著在細胞壁上電鏡圖

2.3 LDH

LDH是一類表面帶正電的離子層狀無機材料，在自然界中以礦物形式存在. 由于LDH的陽離子特性，它可以與帶負電荷的DNA強烈結合.

BAO等［35］首次證明了LDH可以遞送生物分子進入植物細胞. 該工作將FITC標記的單鏈DNA（FITC-ssDNA）負載在LDH上，與懸浮的擬南芥根細胞進行共培養，結果顯示：DNA被細胞成功內化. 該研究進一步對攝取機制進行了探究，結果表明：不論是抑制劑還是低溫處理，均不影響材料的內化，即內化與網格蛋白介導的內吞作用以及能量相關的內化途徑無關. MITTER等［36］合成了攜帶雙鏈RNA（double strand RNA，dsRNA）的LDH，使用局部噴灑的方式，使CMV2b-dsRNA-Cy3-LDH（對照為CMV2b-dsRNA-Cy3）附著在煙草葉片上且無法被水流沖洗，如圖4（a）所示. 在植株的培養過程中LDH被緩慢降解，隨后dsRNA逐漸釋放，起到基因調控和抗病毒的作用；由于材料的高附著性和能被逐漸降解，LDH實現了長達30 d的抗病毒效果，且未被噴灑的新葉也獲得了20 d的保護，如圖4（b）所示. 該工作發展了一種能夠有效抑制番茄黃化曲葉病毒的納米制劑，作為一種可持續且易于采用的局部噴霧劑，這項研究為將納米技術應用于作物保護提供了全新的思路.

圖4 LDH應用于植物抗病毒研究［36］. （a）?分別噴灑CMV2b-dsRNA-Cy3和CMV2b-dsRNA-Cy3-LDH后，?擬南芥葉子清洗前后的共聚焦圖像；?（b）?煙草葉片使用不同材料噴灑處理后5 d及20 d，?用黃瓜花葉病毒PMMoV攻擊，?煙草壞死病灶情況

2.4 肽載體

肽載體是近年來迅速發展起來的一類非病毒納米載體. 聚陽離子肽可以凝聚帶負電荷的DNA，并保護DNA免受核酸酶降解. 細胞穿透肽（CPP）可促進細胞攝取小分子化合物、DNA片段和納米尺寸的顆粒等. CPP的作用已經在哺乳動物細胞中得到了廣泛的研究. 2005年，CHANG等［37］首次利用富含精氨酸的細胞內轉運肽將完全生物活性形式的GFP和紅色熒光蛋遞送到番茄和洋蔥組織中，表明CPP可以穿過細胞壁和細胞膜將外源生物分子遞送到完整的植物細胞中. 此外，多種細胞器靶向肽也已被應用于將基因傳遞到植物的線粒體［38］和葉綠體［39］等. 例如2019年，THAGUN等［39］合成了葉綠體靶向肽和細胞穿透肽復合肽（CTP/CPP），可以較為快速地將pDNA轉染到葉綠體中，如圖5（a）所示. 該工作使用細胞器靶向精準地將DNA遞送至不同植物葉細胞葉綠體中，利用無針注射的方式將pDNA/CTP/CPP復合物注入擬南芥葉片和煙草葉片中，如圖5（b）和5（c）所示，為靶向遞送物質進入植物細胞器中提供了一種新策略. 該方法不僅簡單有效，而且無需復雜材料和昂貴儀器.

圖5 使用肽介導的靶向基因遞送至各種植物細胞質體種的研究［39］. （a）?pDNA/CTP/CPP復合物介導的質體轉化示意圖；（b）?擬南芥葉片細胞中綠色體特異性GFP瞬時表達的共聚焦圖像；?（c）?煙草葉片細胞中綠色體特異性GFP瞬時表達的共聚焦圖像

3 ?總結與展望

植物基因工程育種可以定向改良農作物的目標性狀，實現作物品質和產量的同步提高，以滿足人們需求. 因此，建立高效、簡便、通用的植物遺傳轉化方法至關重要. 納米材料介導的植物遺傳轉化具有如下優點：（1）?納米材料無需外力輔助即可穿過植物細胞壁，通過簡單的注射或噴灑的方式就能實現納米基因載體的內化和核酸的遞送、表達；（2）?納米載體較少受到植物種屬的限制，由于農桿菌的侵染特性，對于絕大多數單子葉植物無法實現農桿菌介導的轉化，而多數納米材料沒有嚴格的宿主選擇性；（3）?納米載體對核酸具有保護性，核酸負載在納米材料后，不會受到核酸酶影響而被快速降解，有效降低了其降解速率；（4）?納米載體可負載大量核酸，實現大片段基因遞送和多基因共同遞送. 目前納米材料介導的遺傳轉化已經被嘗試應用于煙草、擬南芥、小麥、玉米、棉花、菠菜、水稻等多個種屬的植物.

作為植物基因工程中的新興領域，納米材料介導的基因遞送尚在起步階段，仍存在許多問題亟待解決：（1）?納米材料內化進入植物細胞的機制尚不明確，研究工作的結論不一. 在現有的研究中，以LDH為例，BAO等［35］所報道的工作中，擬南芥根部細胞無論是抑制劑處理后的還是低溫處理后的，均不影響納米材料的內化，而在后續的另一篇研究中，YONG等［40］對分離出來的番茄花粉細胞進行低溫處理過后，納米材料的內化效率明顯降低，提示兩者的內化機制存在很大差異. （2）?核酸的遞送是否需要納米材料進入植物細胞中. 在ZHANG等［34］的研究中，使用金作為遞送系統時，其實驗結果表明：具有穿過細胞壁能力的金棒遞送siRNA的效率低于未穿過細胞壁的金球（10 nm），其具體機制仍需進一步探究. （3）?納米材料作為遞送系統是否安全. 納米材料作為遞送系統施用于植物后，可以經生物鏈流入土壤，水系，最終到達動物體內，而納米材料的是否會發生累積，其對生態環境及動物是否會造成不可逆的影響也需要進一步探究. （4）?目前納米材料介導的遺傳轉化仍處于探索階段，大多數應用聚焦于植物葉片或根部細胞，且所遞送核酸均是瞬時過表達或敲除熒光蛋白等非功能基因，其進一步效用尚待開發. 為了實現目的基因的穩定表達，利用納米材料對CRISPR-Cas基因編輯系統進行遞送是一個全新和有潛力的方向，其優勢包括穩定性高、毒性低、負載能力強、受體植物種類廣泛等. 可以預見，納米材料與CRISPR-Cas系統的結合將在植物基因工程領域拓展全新的應用前景.

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（責任編輯：郁慧，包震宇）