RNA切割型脫氧核酶在生物醫學領域中的研究進展

鄭洪 成雨純 陳楠

DOI：?10.3969/J.ISSN.1000-5137.2024.01.017

收稿日期：?2023-11-01

基金項目：?國家自然科學基金（21974089）

作者簡介：?鄭?洪（2000—），?女，?碩士研究生，?主要從事核酸納米復合材料在RNA調控等方面的研究. E-mail：1838460180@qq.com

* 通信作者：?陳?楠（1979—），?女，?研究員，?主要從事納米生物效應、?納米熒光探針及納米藥物等方面的研究. E-mail：Nchen@shnu.edu.cn

引用格式：?鄭洪，?成雨純，?陳楠. RNA切割型脫氧核酶在生物醫學領域中的研究進展?［J］. 上海師范大學學報?（自然科學版中英文），?2024，53（1）：129?136.

Citation format：?ZHENG H，?CHENG Y C，?CHEN N. Advances in RNA-cleaving DNAzyme for biomedical field ［J］.Journal of Shanghai Normal University （Natural Sciences），?2024，53（1）：129?136.

摘??要：?RNA切割型脫氧核酶（RCD）是一類具有催化活性的單鏈DNA分子，具有靈活的可編程性、優異的穩定性、強底物特異性和高催化活性等優點，因而在生物醫學領域展現出了良好的應用前景. 基于RCD對于特定輔助因子的依賴和對于靶標RNA的特異性識別和切割，其被廣泛應用于一系列生物分子靶標的檢測以及多種臨床疾病的基因治療. 文章介紹了RCD的物理化學特性，并對其在生物醫學領域的研究現狀進行了總結，聚焦于RCD在生物傳感和癌癥治療等方面的應用進展. 此外，還對該領域面臨的挑戰及未來的發展方向進行了討論.

關鍵詞：?RNA切割型脫氧核酶（RCD）；?核酸納米復合物；?生物傳感；?癌癥治療

中圖分類號：?Q 786 ???文獻標志碼：?A ???文章編號：?1000-5137（2024）01-0129-08

Abstract：?RNA-cleaving DNAzyme（RCD）?is a type of single-stranded DNA with catalytic activity，?which has many advantages such as flexible programmability，?excellent stability，?strong substrate specificity，?and high catalytic activity. Therefore，?it has shown potential application in the field of biomedicine. Because of its selectivity on specific cofactors and recognition and cleavage of target RNAs，?RCD is widely used in the detection of a range of biological molecules and gene therapy for various clinical diseases. This review introduces the physicochemical properties of RCD，?summarizes its current research status in the biomedical field，?and focuses on the application progress of RCD in biosensing and cancer treatment. In addition，?the challenges and future development in this field are discussed.

Key words：?RNA-cleaving DNAzyme（RCD）；?nucleic acid nanocomposites；?biosensing；?cancer treatment

0 ?引?言

脫氧核酶（DNAzyme）是通過特定的指數富集配基系統進化篩選技術（SELEX）獲得的一類具有酶活性的單鏈DNA分子，能夠在輔助因子的作用下發揮特定的催化功能［1-2］. 1994年，BREAKER等［3］等首次在鉛離子（Pb2+）存在的條件下，篩選得到了一種具有RNA裂解能力的單鏈DNAzyme. 此后，越來越多具有不同結構和功能的DNAzyme被報道. 根據功能的不同，可以將DNAzyme大致分為七類：（1）?具有RNA切割活性的脫氧核酶（RCD）；（2）?具有DNA連接酶活性的DNAzyme；（3）?具有卟啉金屬化酶和過氧化酶活性的DNAzyme；（4）?具有DNA水解活性的DNAzyme；（5）?具有DNA激酶活性的DNAzyme；（6）?具有N糖基化酶活性的DNAzyme；（7）?具有DNA戴帽活性的DNAzyme［4］. 其中，針對RCD的研究和應用最為廣泛和成熟. RCD具有特異性的輔助因子依賴性和強大的催化能力，通過整合多種信號轉導和放大機制，可以將其廣泛用于金屬離子、代謝物以及生物大分子的高靈敏度和特異性檢測. 此外，可以通過設計底物結合臂來構建靶向特定RNA的RCD，選擇性地切割病毒RNA或疾病相關基因的RNA，調節相應蛋白的表達，達到治療目的. 與其他基因治療工具相比，RCD具有成本低廉、設計靈活、穩定性高、底物特異性好以及高效的RNA切割能力等諸多優勢，在病毒分析和癌癥臨床治療中均展示出了強大的應用潛力［1］. 本文對RCD的物理化學特性進行了介紹，并總結了目前RCD在生物傳感和癌癥治療方面的研究進展.

1 ?RCD的物理化學特性

1.1 RCD的通用結構及代表性RCD分子

迄今為止，研究者們尚未發現天然的具有催化功能的DNAzyme. 幾乎所有的DNAzyme都是利用SELEX技術在體外篩選分離獲得的，如圖1（a）所示. 該技術主要由制備篩選文庫、與輔助因子孵育、分離切割產物、聚合酶鏈式反應（PCR）擴增及再合成文庫等步驟的多輪循環構成［5］.

在所篩選獲得的具備不同催化能力的DNAzymes中，RCD是最典型、研究最為充分的一類分子. 一般來說，RCD由3部分組成：催化域、結合臂Ⅰ和結合臂Ⅱ［1］?，如圖1（b）所示. 結合臂Ⅰ和結合臂Ⅱ分別位于催化域的兩側，可以通過堿基互補配對原則識別并結合相應的RNA底物；而催化域通常位于中部環區，在特定輔助因子存在的情況下，折疊形成活性結構，通過破壞磷酸二酯鍵來切割RNA底物［5］.

圖1 RCD的通用結構及代表性RCD分子. （a）?體外篩選過程的通用原理［5］；?（b）?DNAzyme的通用結構及其與底物的結合［1］；?（c）?幾種典型的RCD：?8-17 DNAzyme，?10-23 DNAzyme和17E DNAzyme［6-7］

目前，最具代表性RCD主要包括：SANTORO等［6］篩選得到的8-17 DNAzyme（從約1×1014個隨機序列中進行體外篩選時，所得到的第8輪循環第17個克?。┖?0-23 DNAzyme（從約1×1014 個隨機序列中進行體外篩選時，所得到的第10輪循環第23個克?。?］. 8-17 DNAzme的經典結構包含有14個核苷酸構成的催化域序列，其中9個形成發夾結構，其余5個呈單鏈. 最初被認定的8-17 DNAzyme底物切割位點為A～G，后來擴展為N～G（N=A，U，C或G）［1，?4］. 8-17 DNAzyme家族中有一個值得注意的成員是17E DNAzyme［7］，如圖1（c）所示. LI等［7］在鋅離子（Zn2+）的存在下篩選獲得了17E DNAzyme，并針對其對于多種金屬離子的響應進行了深入研究. 結果表明：17E DNAzyme在Zn2+存在下活性非常強，在等濃度二價錳離子（Mn2+）和鈷離子（Co2+）存在下活性較強，在鎘離子（Cd2+）、鎳離子（Ni2+）、鎂離子（Mg2+）、鈣離子（Ca2+）和鍶離子（Sr2+）存在下活性中等. 進一步研究表明：17E DNAzyme在鉛離子（Pb2+）作為輔助因子的條件下活性最強，這種活性差異為其在多維檢測平臺中的應用提供了基礎. 10-23 DNAzyme也是迄今為止發現的最為高效的DNAzyme之一，在Mg2+高物質的量濃度（10 mmol·L-1或以上）的情況下，10-23 DNAzyme在由kcat/Km（kcat表示單位時間內一個酶分子催化底物轉化的最高速率，Km表示酶促反應速度達到最大反應速度一半時所對應的底物濃度）定義的催化效率方面可以與蛋白酶競爭，kcat約為10 min-1；同時在模擬生理條件即Mg2+物質的量濃度低于5 mmol·L-1時，該DNAzyme的kcat 仍然達到0.1 min-1左右［8］. 10-23 DNAzyme的另一個優勢是可以切割所有的嘌呤-嘧啶連接，這使對靶向RNA序列中特定位點的選擇具有極大的靈活性，大大拓展了其適用范圍. 研究者們進一步對10-23 DNAzyme的4個裂解位點AC，AU，GC和GU的切割效率進行了比較，發現它們的裂解效率差異如下：GU>AU>GC>AC［1］. 基于以上特性，8-17DNAzyme和10-23 DNAzyme是目前最常見的被應用于生物傳感和癌癥治療的代表性RCD分子.

1.2 常用的RCD的底物

RCD在輔助因子存在下，對底物鏈具有切割的能力，其底物鏈必須是RNA分子或切割位點為RNA堿基的嵌合DNA/RNA分子. 最初，利用RCD進行基因調控的主要目標是通過切割病毒的RNA來抑制病毒復制. 隨著研究的深入，更多的RCD被應用于切割一些參與重要生理病理過程的基因的mRNA或調節性RNA，如微小RNA（microRNA）［1，9-12］，從而為腫瘤等疾病的基因治療藥物開發提供了新型的核酸工具.

mRNA負責將遺傳信息從DNA傳遞到核糖體，在核糖體中，mRNA作為蛋白質合成模板，決定蛋白產物的氨基酸序列［1］. 由于mRNA直接調控蛋白質的表達，某些mRNA的表達水平失調是多種疾病發展的直接原因，特異性地對mRNA水平進行調控一直是基因治療的重點和難點. 與其他調控手段相比，RCD設計靈活，且其作為單鏈DNA分子，很容易通過堿基互補等方式與其他DNA工具相結合，實現特定mRNA的識別、檢測或切割.

microRNA是近年來被發現廣泛存在于動物、植物和病毒中的內源性、非編碼RNA分子，其長度約為22個核苷酸，在RNA沉默和基因調控中發揮重要作用［13］. 通過與靶標RNA分子發生完全或不完全互補的堿基配對，microRNA可以降解或阻斷靶mRNA的翻譯，從而調節蛋白表達. 越來越多的研究證據表明：microRNA的異常表達與多種癌癥和其他病理狀況的發生密切相關［14］. 例如，microRNA-21水平的異常與惡性腫瘤的增殖、凋亡、侵襲和遷移密切相關，并且經常在慢性淋巴細胞白血病、宮頸癌、肺癌、乳腺癌和前列腺癌中過度表達［13］. 因此，microRNA現在被認為是重要細胞過程的關鍵調節因子. 目前，基于RCD針對microRNA分子進行檢測和調控的工作尚在起步階段，其應用前景非常廣闊.

1.3 激活RCD催化功能所需的輔助因子

RCD的催化域序列只有在輔助因子的協助下，才能折疊形成活性構象，發揮對底物RNA的切割功能. RCD所需的輔助因子種類繁多，常見的輔助因子包括金屬離子［15-16］、代謝物小分子［17］、生物大分子［18-19］等. 基于RCD對輔助因子的選擇性和依賴性，可以設計以輔助因子為開關的檢測平臺，將RCD應用于輔酶因子特異性識別和檢測［4］，將RCD轉化為高靈敏度和選擇性的熒光、比色、電化學和電化學發光傳感器. 另一方面，對于RCD在細胞內或體內的應用，特別是將其用于內源RNA分子的切割和基因調控時，由于內源性輔助因子的生理濃度達不到充分激活RCD所需的濃度，導致其體內催化活性較低，制約了其進一步應用.

2 ?RCD在生物醫學領域的應用

RCD作為一種功能核酸，具有輔助因子響應的RNA切割特性以及成本低、穩定性強、催化效率高等特點，在生物醫藥領域展現出廣闊的應用前景. 一方面，由于RCD的激活依賴某種特定條件，如金屬離子［20-21］、中性分子［22-23］?以及生物大分子［24-25］等，才能切割底物分子，其自身既是生物識別元件，又可以作為信號發生器，常常被應用于構建生物傳感器進行輔助因子的檢測［5］. 另一方面，可以通過設計RCD的結合臂序列，實現對于特定RNA的切割，下調某些致病基因的表達，因此RCD作為一種新興的基因表達抑制劑或調節劑備受關注. 以下將重點討論RCD在生物傳感以及腫瘤治療方面的應用.

2.1 RCD應用于生物傳感平臺的構建

2.1.1 金屬離子傳感

眾所周知，金屬離子在從細胞到生態系統層面的各級系統中都發揮著至關重要的作用. 例如，金屬離子濃度失調與多種疾病的發生有關，包括滲透壓失衡、神經功能障礙和癌癥等［20］. 因此，對特定金屬離子的靈敏檢測具有重要的應用價值. 與針對金屬離子的諸多小分子探針相比，體外篩選獲得的RCD提供了一個普適性的設計平臺，且具有易于合成、可編程性高、靈敏度高等優點［8］. 因此，利用RCD檢測環境樣品、生物基質和生物系統中的金屬離子一直是許多研究人員關注的重點. 例如，YANG等［20］開發了光籠Zn2+特異性的RCD-上轉換納米粒子（UCNP）納米探針，用于斑馬魚早期胚胎的實時金屬離子示蹤和時空控制，如圖2（a）所示. UCNP能夠將980 nm的紅外激發光上轉換為365 nm的紫外發射光，紫外光能夠有效地裂解底物鏈上修飾的對硝基芐基基團，隨后，Zn2+特異性的RCD就可以裂解底物，釋放出含有FAM熒光基團的底物片段鏈，這樣就實現了對于活細胞或斑馬魚體內Zn2+的光激活檢測. 然而，由于光對活體組織的滲透有限，光激活傳感的方法在進一步的應用中始終存在困難. 在另一項研究中，YI等［21］構建了一種內源性酶APE1激活的RCD傳感器，可以在體內鑒別腫瘤細胞和正常細胞中的金屬離子信號. 與傳統的RCD傳感器相比，其阻斷序列包含一個可被癌細胞的細胞質內特異性高表達的酶APE1切割的位點，從而可以選擇性地恢復了對癌細胞中金屬離子的感知能力，其檢測限為0.6 μmol·L-1，如圖2（b）所示.

2.1.2 核酸傳感

核酸在生物體中發揮著多種重要作用，包括遺傳信息的編碼、傳遞和調控等.特定核酸分子的表達失衡往往與疾病發生發展相關. 例如，多種miRNA的異常表達被證明與癌癥的發生發展密切相關，因而被認為是癌癥早期診斷的生物標志物. HUANG等［24］設計了一種基于RCD級聯催化發夾組裝（CHA）的納米系統（DCC），實現了活細胞內miRNA的放大成像檢測. 這種無酶擴增的DCC基于RCD的擴增和CHA的順序激活，使低豐度的靶miRNA能夠激活大量的RCD，并形成大量的CHA觸發序列（TS），從而實現靶標miRNA的放大檢測，其檢測限為5.4 pmol·L-1，是傳統的CHA系統的1/18. 這種穩定、靈敏的DCC在miRNA的臨床診斷和其他相關生物醫學應用方面均具有巨大潛力，如圖2（c）所示.

2.1.3 蛋白質傳感

蛋白質是生物組織的主要結構元素和功能分子. 蛋白質檢測可以評估樣品中蛋白質的濃度和種類，這對于了解它們的生理和病理功能、識別疾病的生物標志物等至關重要. 例如，最近的研究表明：脂肪量和肥胖相關蛋白（FTO）與兒童和成人的肥胖、2型糖尿病以及乳腺癌等多種惡性癌癥的發生和發展有關，因此?FTO 可以作為新的癌癥檢測標志物和新型的治療靶點［2］. SHI等［25］開發了一種m6A去甲基化激活的RCD比色傳感器，用于靈敏地檢測FTO.m6A阻斷的RCD生物傳感器可以被FTO打開，引發底物裂解，通過RCD的催化循環產生多個引物，然后通過滾環擴增（RCA）生成G-四聚體/血紅素RCD，催化2，2-氮基-雙-（3-乙基苯-并噻唑啉-6-磺酸（ABTS）氧化，可以肉眼觀察到顏色變化，檢測限低至69.9 fmol·L-1，其靈敏度明顯高于以往報道的，如圖2（d）所示.

2.1.4 其他分析物傳感

一些中性的代謝物小分子如三磷酸腺苷（ATP）、組氨酸等也可以作為RCD傳感的方向底物. 其中ATP作為重要的小分子，是生物體內一切生命活動所需能量的直接來源，在調節生物體內許多生化合成和代謝過程中起著不可或缺的作用［2］. 因此，開發靈敏和特異的ATP 識別和成像方法對于生化研究和臨床診斷均具有重要意義. ZHOU等［22］設計了一種分裂適配體-RCD的組合探針，用于ATP的熒光檢測，如圖2（e）所示. 兩條適體酶序列分別由分裂的ATP 適體模塊和分裂的RCD模塊組成，利用蜂窩二氧化錳（hMnO2）納米材料作為遞送載體，將其遞送進入細胞. 隨后，細胞內ATP觸發分裂的ATP適體模塊整合形成完整的適體酶，切割底物釋放熒光，特異性地對腫瘤細胞中的ATP進行成像. RCD傳感器還可以用于組氨酸檢測，組氨酸是一種半必需氨基酸，?具有多種生理學作用，比如組氨酸能降低胃液酸度、緩和胃腸手術時的疼痛等. YU等［23］開發了一種基于RCD的微型熱泳動（MST）方法，利用RCD進行組氨酸的識別和酶催化，導致分子結構改變和MST熒光信號的顯著變化，從而實現組氨酸的靈敏檢測，其檢測限為3.9 μmol·L-1. 值得指出的是，該傳感策略具有較好的普適性，有望在多種代謝物分子的檢測中得到廣泛應用.

圖2 RCD在生物傳感方面的應用. （a）?利用光籠RCD偶聯鑭系摻雜UCNPs實現體內Zn2+檢測［20］；?（b）?酶激活的RCD傳感器用于體內金屬離子檢測［21］；?（c）?RCD-CHA級聯DCC實現細胞內microRNA-21的放大檢測［24］；?（d）?m6A去甲基化激活的RCD比色傳感器用于檢測FTO［25］；?（e）?一種可協同激活的DNA納米探針用于體內ATP的腫瘤特異性成像［22］

2.2 RCD應用于癌癥治療

除了用于構建生物傳感器外，RCD在癌癥治療方面的應用也是目前的研究熱點，特別是在癌癥治療中的轉移和耐藥性等治療難點上［26］.

2.2.1 抑制血管生成和腫瘤轉移

轉移是腫瘤發展進程中最危險的階段，也是導致病人死亡的最主要原因之一［27］，血管生成是腫瘤轉移的條件和重要過程. 控制腫瘤血管生成和促進癌細胞轉移的關鍵轉錄因子包括VEGFR和EGR-1等［26］. 因而，抑制這些轉錄因子的表達對于抑制癌細胞的轉移至關重要，也是目前臨床癌癥治療的重要研究方向. 例如，LIU等［28］合成了銅離子（Cu2+）和?RCD 通過配位相互作用共組裝成的納米復合物Cu-RCD，能夠同時有效地遞送Cu2+和RCD進入癌細胞，進行聯合催化治療，如圖3（a）所示. 其中，RCD可有效地催化裂解VEGFR2 mRNA，實現基因沉默，從而抑制血管生成，增強納米復合物的抗腫瘤效果. 在另一項研究工作中，PENG等［29］開發了一種多功能的MnO2納米片修飾PEI后吸附RCD的納米器件MnO2-PEI-RCD（MnPDs），能夠實現自給自足的基因沉默，如圖3（b）所示. MnPDs進入細胞后，釋放的RCD分別能夠有效切割早期生長反應因子-1（EGR-1）mRNA 和存活蛋白（Survivin）mRNA，實現兩種基因的同時下調，從而能夠在引發腫瘤細胞凋亡的同時，抑制血管生成和轉移，達到協同基因治療的效果.

2.2.2 逆轉腫瘤耐藥性

腫瘤耐藥性是指癌細胞對化療、放療和熱療等的耐受性增加，導致治療效果下降. 腫瘤的多藥耐藥性（MDR）是人類癌癥化療失敗的最主要原因，嚴重威脅著人類健康［26］. 因此，開發一種高效的策略來逆轉腫瘤MDR，重建腫瘤細胞對藥物的敏感性是腫瘤治療的關鍵. 近幾年來，利用RCD靶向MDR相關基因被認為是一種有潛力的治療策略，可以顯著提高癌癥治療的效果. 例如，LIANG等［30］通過滾環擴增（RCA）策略構建了P-糖蛋白（P-gp）靶向的RCD納米花（RCD NFs）應用于阿霉素（Dox）的遞送，如圖3（c）所示. RCD能夠特異性地降解癌細胞中的P-gp mRNA，P-gp水平的下調能夠減少癌細胞將Dox或其他抗癌藥物運輸出細胞，從而逆轉MDR效應，因此該納米復合物能夠有效地消融原本具有Dox 抗性的乳腺癌. 體外和體內結果表明：RCD NFs不僅具有較高的載藥量（69.21%）和酸響應的細胞內降解能力，還能有效抑制P-gp的表達，大大增強乳腺癌細胞對Dox的敏感性.

光熱療法（PTT）是一種新興的癌癥治療方法，但隨之產生的腫瘤細胞的耐熱性極大地限制了其臨床應用. 相關研究表明：熱應激引發腫瘤細胞中熱休克蛋白（HSPs）的異常上調，特別是HSP70和HSP90，是賦予癌細胞較高耐熱性的關鍵因子［26，?31］. 基于此特性，XI等［32］開發了一種花狀MnO2包覆的聚多巴胺（PDA@MnO2）核殼納米平臺，并在其表面吸附靶向HSP70 mRNA的RCD，如圖3（d）所示.體內外分析結果表明：RCD確實能夠有效地下調HSP70 mRNA的表達，逆轉腫瘤細胞的耐熱性，從而使PTT的功效顯著增強，在激光照射下可實現腫瘤的完全消除.

圖3 RCD在癌癥治療方面的應用.（a）靶向VEGFR2 mRNA的RCD納米平臺，用于增強腫瘤治療［33］；（b）一種具有雙基因沉默特性的多功能納米復合材料，用于高效的基因治療［29］；（c）RCD NFs靶向P-gp mRNA逆轉腫瘤MDR［30］；（d）靶向HSP70 mRNA的RCD納米平臺克服腫瘤耐熱性，實現增強的PTT［32］

3 ?結論與展望

本文系統介紹了RCD的物理化學特性，重點介紹了近幾年來RCD在生物傳感和癌癥治療中的應用. 由于RCD具有特異性的輔助因子依賴性以及高穩定性、高催化活性、易合成、易修飾等優勢，通過整合其他的信號轉導和放大機制，適用于構建針對金屬離子、代謝物小分子和生物大分子等多種物質進行高靈敏度和特異性監測的傳感平臺. 基于RCD的生物傳感系統的進一步應用仍然面臨許多挑戰，例如，目前基于RCD生物傳感系統的應用仍然主要集中在實驗室中體外樣品的測試上，其體內檢測應用仍受到生物遞送和生物降解困難、內源性靶標分子的生理濃度較低等諸多因素的限制. 目前的RCD生物傳感器很少能達到其他類型的傳感器（如基于酶和抗體的傳感器）的應用水平，未來還需要在提高傳感體系的抗干擾能力、提高RCD在體內的穩定性和放大信號等方面展開更深入的研究.雖然多種RCD已經被用于癌癥基因治療領域，但是其遞送效率有限，特別是體內輔助因子的含量降低和選擇性較差等問題阻礙了RCD在臨床應用中的發展，尋找和利用新的腫瘤特異性因子作為RCD的體內調控開關是解決這一問題的一種新思路.

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（責任編輯：郁慧，包震宇）