軸突導向因子受體3缺陷促進化療藥物誘導的巨噬細胞泡沫化進程

劉永 程曉雷 崔香麗 唐顥 陳還珍

1山西醫科大學基礎醫學院生理學系（太原 030012）；2南京鼓樓醫院（南京 210008）；3國家心血管病中心華中分中心（鄭州 450003）；4山西醫科大學第一醫院（太原 030001）

腫瘤和心血管疾病是目前全球發病率和病死率最高的兩大類疾?。?-2］。隨著腫瘤治療藥物和方法的日益精進，與腫瘤治療相關的心血管疾病對患者的生存率與生存質量的影響愈發凸顯出來，化療藥物可對動脈血管的功能產生長期的負面影響，使其功能發生紊亂，引起一系列血管并發癥［3-4］。其中，以化療相關動脈粥樣硬化（athero?sclerosis， AS）最具代表性，嚴重威脅腫瘤患者的生存健康與生存質量［5］。以順鉑為代表的常規化療藥物的應用與化療相關AS 聯系最為密切［6］。此外，蒽環類化療藥物可引起血管功能損傷，增加心血管事件風險［7-8］。這表明常規化療藥物的應用與腫瘤患者的AS 發生風險密切相關。

AS 是膽固醇代謝紊亂衍生的疾病。巨噬細胞吞噬富含膽固醇的氧化低密度脂蛋白或其他修飾的脂蛋白后成為泡沫細胞，隨后沉積于內皮下形成“脂質條紋”，是AS 早期病變的標志［9］。因此，維持膽固醇代謝的穩態，對延緩泡沫細胞形成及AS 病變的發展至關重要。

巨噬細胞內膽固醇蓄積是刺激巨噬細胞向泡沫細胞轉變的直接原因［10］。巨噬細胞的膽固醇代謝過程主要涉及以下環節：膽固醇攝取、內源合成、胞內轉運、酯化與外排等。其中類固醇受體激活物（steroid receptor activator， SR-A）、B 類Ⅰ型清道夫受體（scavenger receptor class B member 1，SRB1）等清道夫受體介導膽固醇的攝?。?1］；C 型1 類尼曼-匹克（Niemann-Pick type C1， NPC1）蛋白介導膽固醇轉運［12］；固醇?；D移酶1 和2（sterol O-acyltransferase 1/2， SOAT1/SOAT2）介導膽固醇酯化［13］；而24-脫氫膽固醇還原酶（24-dehydrocho?lesterol reductase， DHCR24）是膽固醇合成的關鍵酶［14］；細胞內中性膽固醇酯水解酶（neutral choles?teryl ester hydrolases， NCEHs）可水解膽固醇酯［15］；轉運蛋白ATP 結合盒轉運體A1（ATP-binding cas?sette transporters A1， ABCA1）和轉運蛋白ATP 結合盒轉運體G1（ATP-binding cassette transporters G1，ABCG1）介導膽固醇反向轉運，將膽固醇排出胞外［16］。在本研究中，我們利用小鼠巨噬細胞系RAW264.7 探討了化療藥物（阿霉素和順鉑）對其膽固醇代謝和泡沫化的影響，并在此基礎上，借助轉錄組學手段篩查細胞在化療應激情況下的基因表達變化。

1 材料與方法

1.1 細胞株及細胞培養 小鼠單核巨噬細胞RAW264.7和人胚胎腎細胞HEK293T購自于美國細胞培養物收藏中心（american type culture collection，ATCC）。用含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素混合液的高糖DMEM 培養基，在37 ℃、5% CO2的恒溫培養箱中進行培養。

1.2 試劑與儀器 細胞培養皿、載玻片及蓋玻片購于BIOFIL 公司，高糖DMEM 培養基、蛋白酶抑制劑及胎牛血清購于DiNing 公司，PEI 轉染試劑購于Polysciences 公司，ECL 發光試劑盒、逆轉錄試劑盒、Trizol 試劑及Q-PCR 試劑盒購于南京Vazyme公司，DHCR24、ABCG1、ROBO3 抗體購于Protein?tech 公司。RIPA 裂解液及組織細胞脂質水平測定試劑盒購于北京普利萊基因技術有限公司，oxldl及dil-oxldl 購于廣州奕元生物有限公司。細胞培養箱、蛋白Marker 及BCA 蛋白定量試劑盒購于美國Thermo 公司；VICTOR Nivo 酶標儀購于珀金埃爾默公司，油紅O 染液購于南京建成科技有限公司。

1.3 RNA 測序（RNA?seqence） 所有RNA-seq 實驗均至少2 次生物重復。細胞在化療藥物（DOX-0.2 μmol/L 或CPT- 5 μmol/L）處理24 h 后，加入Trizol 試劑（Life Technologies）提取和純化RNA。用DnaseI（Sigma）進一步處理RNA，然后用RNeasy mini 試劑盒（Qiagen）純化。NEBNext rRNA Deple?tion Kit（New England BioLabs）和NEBNext Ultra II Directional RNA Kit（New England BioLabs）分別用于去除核糖體RNA 和制備RNA-seq 文庫。文庫匯集后在HiSeq 平臺（Illumina）上測序，每端讀長配置為150 bp。

1.4 質粒構建 PHBLV-shCtrl-ZsGreen-puro 質粒購于漢恒生物公司，將目的片段插入到質粒的多克隆位點中。shROBO3 的引物序列如下：Forward primer（5'-3'）：GATCCGGGGAAGAGCTACAGACC?TTTTCAAGAGAAAGGTCTGTAGCTCTTCCCTTTTT?TC；Reverse primer （5'-3'）：ATTGAAAAAAGGGAA?GAGCTACAGACCTTTCTCTTGAAAAGGTCTGTAGC?TCTTCCCCG，引物由上海生物工程有限公司合成。

1.5 病毒包裝與感染 病毒包裝骨架質粒PSPAX2，PMD2G和PHBLV-shROBO3-ZsGreen-puro或PHBLVshCtrl-ZsGreen-puro 三質粒共轉染HEK293T 細胞，48 h 后，收集細胞上清的病毒顆粒，隨后感染RAW 264.7 細胞，48 h 后用嘌呤霉素藥物進行篩選，細胞密度達到80% ~ 90%時進行傳代，建立ROBO3穩定敲低細胞株（shROBO3 細胞）和對照細胞株（shCtrl 細胞）。

1.6 油紅O 染色實驗 將細胞鋪種于細胞爬片上，并進行相應處理；PBS 清洗細胞后，用4 %多聚甲醛固定細胞20 min；雙蒸水清洗細胞后，加入提前配制好的油紅O 染液，染色10 ~ 15 min；雙蒸水洗去染色液后用蘇木素復染液細胞核；雙蒸水洗去復染液后，滴加水性封固劑，用細胞爬片進行封片；顯微鏡下進行拍攝。

1.7 細胞內脂質水平測定 收取一定數量細胞，加入10 倍細胞壓積的裂解液，震蕩混勻，靜置10 min。轉移上清到離心管中，70 ℃加熱10 min，室溫2 000g離心5 min，取上清進行酶學測定。

1.8 蛋白質免疫印跡實驗（Western blot） 收集細胞到離心管中，加入含蛋白酶抑制劑的細胞裂解液，冰上裂解，高速離心，收集上清于新的離心管，BCA 法測定蛋白質濃度，加入上樣緩沖液后98 ℃變性10 min，經SDS-PAGE 凝膠電泳分離蛋白質后，將蛋白質轉移至NC 膜上，以5 %的脫脂奶粉進行封閉，加入對應一抗后于4 ℃搖床過夜孵育，之后TBST 洗膜，室溫孵育二抗1 h，TBST 洗膜，化學發光成像系統進行成像。

1.9 實時熒光定量Q?PCR 收集細胞，用Triol 試劑提取RNA，逆轉錄為cDNA。以ACTIN 作為內參校正，以3 次獨立重復實驗平均結果作為結果，本文Q-PCR 引物序列見表1，PCR 儀反應條件為：95 ℃預變性3 min，95 ℃變性15 s、55 ℃退火15 s、72 ℃延伸30 s（共35 個循環）。以2-△△Ct法計算相應基因的mRNA 表達水平。

表1 實驗所用引物序列Tab.1 Primer sequence in study

1.10 脂質吸附和內吞實驗 實驗參考以往的研究［18-19］，將細胞接種至預先鋪細胞爬片的12 孔板，進行相應誘導，用PBS 清洗細胞后，加入含dil-oxldl（20 μg/mL）的培養基進行孵育，分別在4 ℃孵育2 h（檢測脂質與巨噬細胞膜的結合，binding）或37 ℃孵育4 h（檢測脂質的內吞，uptake），PBS 清洗后用4%多聚甲醛固定細胞20 min，PBS 清洗后加入DAPI 染液染核10 min，共聚焦熒光顯微鏡進行鏡檢及拍攝。

1.11 統計學方法 計量資料以均數±標準差表示，統計分析使用GraphPad Prism 8.0 軟件完成，兩組數據之間的比較采用獨立樣本t檢驗分析，多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA）的基礎上進行Tukey 檢驗的方法進行分析。以P< 0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 化療藥物導致巨噬細胞泡沫化水平增加 使用兩種常規化療藥物：阿霉素（DOX）和順鉑（CPT）分別處理RAW264.7，48 h 后，進行油紅O 染色評估巨噬細胞內膽固醇的蓄積水平，結果顯示，與未處理組相比，化療藥物處理組的細胞胞內脂滴數量明顯增加（圖1A、1C），統計結果如圖1B 和1D 所示，脂滴含量分別增加了2.270 ± 0.098 和2.271 ±0.164 倍（P< 0.01 和P< 0.05）。隨后，我們測定了各組細胞胞內的甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）和膽固醇酯（CE）的水平，結果如圖所示，化療藥物處理后，巨噬細胞中TG、TC 和CE 的水平顯著高于對照組，其中，DOX 處理組的TG、TC 和CE 的水平分別增加了1.948 ± 0.948（P< 0.01）、1.628 ± 0.627（P< 0.01）和1.492 ± 0.492 倍（P< 0.05）（圖1E），CPT 處理組則分別增加了4.336 ± 0.252（P< 0.01）、1.817 ± 0.022（P< 0.01）和2.617 ± 1.617倍（P< 0.001）（圖1F）。以上結果說明，巨噬細胞經阿霉素或順鉑類化療藥物處理后，細胞內的脂質水平明顯增加，泡沫化加劇。

圖1 化療藥物加劇巨噬細胞RAW264.7 細胞泡沫化Fig.1 Chemotherapeutic drugs exacerbated macrophage foaminess in RAW264.7

DOX處理RAW264.7細胞48 h后加入20 μg/mL的熒光標記的oxldl （dil-oxldl），并分別在4 ℃孵育2 h（檢測oxldl 與巨噬細胞的膜結合能力）或37 ℃孵育4 h（檢測巨噬細胞對oxldl 的內吞能力），隨后使用共聚焦熒光顯微鏡進行檢測。結果顯示，與對照組相比，化療藥物處理組dil-oxldl 與細胞膜的結合以及細胞胞內dil-oxldl 的水平并沒有顯著差異（圖2A-D）。以上結果提示，化療藥物對巨噬細胞的膽固醇攝入過程無影響。

圖2 化療藥物處理對RAW264.7 的脂質結合和吞噬無影響Fig.2 Chemotherapeutic drugs did not affect lipid binding and uptake in RAW264.7

綜上所述，化療藥物刺激可加劇巨噬細胞泡沫化，但化療藥物引起的胞內脂滴蓄積與胞內膽固醇攝取過程無關。

2.2 探索化療藥物引起巨噬細胞泡沫化的效應靶標 利用化療藥物（DOX 或CPT）處理小鼠巨噬細胞RAW264.7，24 h 后提取RNA 進行轉錄組測序。以log2倍數變化≥ 5 和P值< 0.05 作為基因表達顯著上調的篩選標準，并將DOX 和CPT 處理后顯著上調的基因進行交互分析，結果如圖3A 所示，篩出12 個共同顯著上調的基因，基因信息在表2 中展示。差異基因火山圖顯示，軸突導向因子受體3（ROBO3）在兩種化療藥處理后表達升高最為顯著（圖3B）。

圖3 化療藥物處理RAW264.7 后ROBO3 水平明顯增高Fig.3 ROBO3 levels increased in chemotherapeutic drug-treated RAW264.7

表2 RAW264.7 經過DOX 或CPT 處理后共同表達變化的基因Tab.2 Co-altered genes in RAW264.7 treated with DOX and CPT

2.3 ROBO3 在化療誘導巨噬細胞泡沫化進程中表達水平先增高后降低 分別用DOX 和CPT 處理RAW264.7，在0、12、24、48、72 h 收集細胞，Western blot 檢測ROBO3 的蛋白表達水平變化。與轉錄組學結果一致，ROBO3 的表達水平于DOX 和CPT 刺激24 h 內均表達增高；然而，在兩種化療藥物誘導48 h 之后，ROBO3 則均出現表達缺陷（圖4A、B）。ROBO3 的表達改變是否參與調控化療引起的巨噬細胞泡沫化進程，值得進一步探討。

圖4 ROBO3 的表達在化療藥物誘導巨噬細胞泡沫化進程中先增高后降低Fig.4 ROBO3 was increased and then decreased during chemotherapy-induced macrophage foaminess

2.4 沉默ROBO3 加劇巨噬細胞膽固醇蓄積 利用慢病毒構建穩定敲低ROBO3 的RAW264.7 細胞，Western blot 驗證ROBO3 敲低效果（圖5A），隨后檢測細胞內的脂質水平，結果顯示，沉默ROBO3 后胞內甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）、游離膽固醇（FC）和膽固醇酯（CE）水平在正常情況下并沒有明顯改變，但在氧化性低密度脂蛋白（oxldl）的刺激下，上述指標顯著增高（shCtrl+oxldlvs.shROBO3+oxldl，TG：1.554 ± 0.089vs.2.104 ±0.157，P< 0.05；TC：1.784 ± 0.102vs.2.258 ± 0.122，P< 0.05；FC：1.507 ± 0.058vs.2.258 ± 0.122，P<0.01；CE：1.382 ± 0.071vs.1.994 ± 0.191，P< 0.05）（圖5B）。同時，油紅O 結果顯示，正常情況下沉默ROBO3，胞內脂滴蓄積并沒有明顯差異；而在加入oxldl 刺激后，沉默ROBO3 胞內脂滴蓄積顯著增加，相較對照組，沉默ROBO3 增加1.799 ± 0.084 倍（圖5C、D，P< 0.05）。以上結果提示，沉默ROBO3可促進巨噬細胞向泡沫細胞轉化，ROBO3或在維持巨噬細胞膽固醇代謝穩態中發揮重要調控作用。

圖5 沉默ROBO3 加劇RAW264.7 細胞脂質蓄積Fig.5 Silencing of ROBO3 exacerbated lipid accumulation in RAW264.7

給予dil-oxldl 刺激，檢測干預ROBO3 后對巨噬細胞膽固醇攝取能力的影響，結果表明，沉默ROBO3，dil-oxldl 與細胞膜的結合及內吞均沒有顯著差異（圖6A、D）。以上說明，ROBO3 缺陷引起的巨噬細胞胞內膽固醇蓄積不依賴于細胞對膽固醇的攝取。

圖6 沉默ROBO3 不影響RAW264.7 細胞的脂質結合和吞噬Fig.6 Knockdown of ROBO3 did not affect the lipid binding and uptake of RAW264.7

綜上所述，ROBO3 表達缺陷加劇了巨噬細胞胞內膽固醇蓄積和泡沫化進程，但并不影響膽固醇攝取過程，這與化療藥物刺激引起的巨噬細胞泡沫化所觀察到的現象一致。因此，需要進一步探討ROBO3 是否通過影響膽固醇代謝的其他過程來調控化療誘導的巨噬細胞泡沫化。

2.5 ROBO3 調控膽固醇代謝關鍵基因 在沉默ROBO3 表達的RAW264.7 細胞中，用Q-PCR 手段篩選參與膽固醇代謝相關基因的表達變化，結果如圖7A 所示，SRA、SRB1、SOAT1、SOAT2、NPC1、NCEH1 和ABCA1 均沒有變化，而與膽固醇合成相關基因DHCR24 mRNA 水平明顯增高（1.686 ±0.088，P< 0.01），同時，負責膽固醇外排相關基因ABCG1 的mRNA 水平顯著下降（0.364 7 ± 0.015，P< 0.001）。進一步，用Western blot 檢測沉默ROBO3 后DHCR24 和ABCG1 的蛋白水平表達變化，結果顯示，沉默ROBO3 后，DHCR24 表達水平升高，ABCG1表達水平降低（圖7B）。隨后，在DOX處理的RAW264.7 細胞中檢測DHCR24 和ABCG1的表達情況，結果表明，DHCR24 的表達隨著化療藥物的處理時間先降低后升高的同時，ABCG1的蛋白表達水平先增高后降低，兩者的變化趨勢與ROBO3 對其調控的趨勢一致（圖7C），說明ROBO3-DHCR24/ABCG1 調控軸參與調節化療引起的巨噬細胞泡沫化。

圖7 ROBO3 調控脂質代謝關鍵基因Fig.7 ROBO3 regulated key genes of lipid metabolism

以上結果表明，ROBO3 可抑制DHCR24 表達和促進ABCG1 的表達。在化療藥物刺激早期，ROBO3 先應激反應性升高，下調DHCR24 并上調ABCG1 表達，抑制膽固醇合成的同時促進膽固醇流出，以抵御化療引起的巨噬細胞胞內膽固醇擾動；在化療藥物持續刺激下，ROBO3 難抵胞內膽固醇穩態持續失衡而逐漸表現為表達缺陷，最終DHCR24 表達不再受到抑制而ABCG1 表達缺陷，導致膽固醇合成增加、流出受阻，胞內膽固醇蓄積，加速巨噬細胞泡沫化進程。見圖8。

圖8 機制圖Fig.8 Graphic abstract

3 討論

巨噬細胞在動脈粥樣硬化的發生發展過程中扮演著重要角色。既往有相關研究［20］顯示，嗅覺受體（olfactory receptors， OLFRS）在巨噬細胞的膽固醇代謝及動脈粥樣硬化發揮中調控作用。ROBO3 作為一種在神經系統中廣泛表達的受體，在控制軸突生長、生長錐引導和軸突束化的環行交叉等方面的重要功能已被闡釋，然而其是否參與到巨噬細胞膽固醇代謝，尚未可知。而本研究聚焦于ROBO3 對血管的應激保護調節功能，致力于闡明ROBO3 在化療相關巨噬細胞泡沫化中的調控作用及其調控靶點。在研究過程中，我們使用小鼠巨噬細胞系RAW264.7，在細胞水平上進行了相關實驗探索。結果顯示，阿霉素和順鉑類化療藥物可以促進巨噬細胞泡沫化進程，而在該過程中，ROBO3 的表達在前期應激反應性升高，而隨著刺激時間的延長，ROBO3 的表達水平又逐漸降低；同時在ROBO3 缺陷的RAW264.7 細胞中，其胞內膽固醇蓄積明顯增加；但膽固醇攝取的能力并沒有明顯變化，這說明ROBO3 參與了巨噬細胞泡沫化進程中，但并不影響其膽固醇攝取能力。在進一步探討過程中，我們發現沉默ROBO3 使得巨噬細胞中的DHCR24 表達上調，促進了膽固醇的合成，同時抑制ABCG1 的表達使得胞內膽固醇排除受阻，膽固醇在細胞內聚集增加。至此，我們首次發現了ROBO3 對化療藥物刺激下的巨噬細胞泡沫化進程具有調節作用，通過調控DHCR24和ABCG1 的表達，在抑制膽固醇的合成的同時，促進膽固醇外排，實現了對化療相關巨噬細胞泡沫化的保護作用；我們的研究拓展了ROBO3 的功能和理解，為臨床干預化療相關血管事件奠定了理論基礎，提供了新思路。

雖然我們的研究已基本闡明了ROBO3 調控DHCR24與ABCG1對化療促泡沫細胞生成的影響，但是，在體內條件下ROBO3是否同樣調控DHCR24和ABCG1 并影響巨噬細胞泡沫化進程，仍需要進一步驗證。值得注意的是，有研究［21］顯示DHCR24負調控ABCA1 與ABCG1 的表達，但在本研究中發現，ROBO3 表達缺陷時，DHCR24 升高，ABCG1的表達水平降低，沒有觀察到ABCA1 表達水平的變化，這其中隱藏的生物學機制還有待進一步探討。此外巨噬細胞的膽固醇代謝過程，涉及多種酶、受體及轉運體的參與，本研究中并未涵蓋到所有的膽固醇代謝相關基因，鑒于此，ROBO3是否還調控其他基因而進一步參與到巨噬細胞泡沫化進程中，還有待探討。而RNA 測序結果中，在DOX 及CPT 的刺激下，除ROBO3 外，尚有其他基因的表達也在RAW264.7 細胞中發生著較大的變化，這些基因的生物學功能和意義也仍有待探討。

【Author contributions】LIU Yong performed the experiments and wrote the article. CHENG Xiaolei performed the experiments designed the study. CUI Xiangli and CHEN Huanzhen revised the article. TANG Hao designed the study and wrote the article. All authors read and ap?proved the final manuscript as submitted.

【Conflict of interest】The authors declare no conflict of interest.