開心散聯合氟西汀改善慢性壓力應激小鼠抑郁樣行為的效應評價研究＊

李 璇，李 鑫，陳 楊，仝佳祥，黃靈欣，伍嘉慧，董婷霞，詹華強，段金廒，朱 悅＊＊

（1.南京中醫藥大學藥學院，江蘇省方劑研究重點實驗室/江蘇省方劑高技術研究重點實驗室/中藥資源產業化與方劑創新藥物國家地方聯合工程研究中心/江蘇省中藥資源產業化過程協同創新中心 南京 210023；2.香港科技大學生命科學部中藥研發中心 香港 999077）

抑郁癥是一種以情緒低落、興趣減低、思維遲緩為主要癥狀的情志疾病[1-2]。據WHO 統計，全世界有超過3.5 億人受抑郁癥困擾，已成為世界第四大疾病。受COVID-19 影響，2020 年全球范圍內重度抑郁癥增加了28%[3]。抑郁癥患者持久心境低落，生活質量嚴重降低，同時也是自殺的高危人群。即使在非自然死亡人群中，抑郁癥患者高達30%的比例也遠遠高于其他精神疾病患者。因此抑郁癥已成為危害公眾身心健康的重大疾病[4-5]。

長期以來，5-羥色胺與多巴胺等單胺類神經遞質在突觸間隙的重攝取障礙與表達下降，被認為是抑郁癥的主要病理機制[6-7]?，F有抗抑郁藥物如氟西汀、帕羅西汀與文拉法辛等，均以抑制5-羥色胺在突觸間隙的重新攝取來提高其突觸間隙濃度為作用靶點。但這些藥物除了具有胃腸不適、睡眠障礙、性功能障礙等副作用之外，且對30%-50%患者無效。而對這些藥物有反應的患者，又普遍存在起效時間延遲（2-6 周）、缺乏認知改善甚至損害認知、甚至加劇部分患者自殺傾向等嚴重問題[8-9]?，F代研究發現，抑郁癥的發病機制尚涉及神經生長與可塑性障礙、中樞神經炎癥、“下丘腦-垂體-腎上腺”壓力應激系統亢進等多種環節，靶點單一的神經遞質再攝取抑制劑無法有效滿足抑郁癥的治療需要[10-11]。因此中藥復方多成分、多靶點、多途徑的作用特點使其在抗抑郁臨床應用備受關注，并有將甘麥大棗湯、逍遙散、越鞠丸等與氟西汀聯用進行抗抑郁的諸多報道，發現聯合用藥可以提升抗抑郁起效時間，減少不良反應，提升患者治療依從性，但是這些報道多為臨床觀察，對其聯合用藥的作用環節與機制缺乏深入研究[12-15]。

開心散始載于唐代“藥王”孫思邈《備急千金要方》。由人參、遠志、石菖蒲、茯苓組成，治療“心氣不足，五臟不足，甚者憂愁悲傷不樂，忽忽喜忘，朝差暮劇，暮差朝發狂?！迸c“好忘”，非常類似于今天的抑郁癥與老年癡呆癥。該方是經中醫臨床驗證有效的輕、中度抑郁癥治療方劑，并被納入2018年國家中醫藥管理局公布的首批古代經典名方目錄[13]。臨床也發現，以開心散為組方基礎的安神定志方與抗抑郁西藥聯用后起效更快，并顯著縮短病程治療，降低胃腸道不良反應[16]。因此本研究將基于慢性壓力應激小鼠抑郁模型，考察開心散與氟西汀聯合用藥的抗抑郁效用；并在此基礎上探索聯合用藥的作用環節與機制，以期為中西藥聯合治療抑郁癥提供更多的現代科學證據。

1 材料

1.1 動物

健康SPF 級ICR 小鼠，雄性，體質量20-23 g，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，動物合格證號為SCXX（滬）2022-0005。動物飼養于南京中醫藥大學實驗動物中心SPF 環境中，常規飼養，溫度22-25℃，濕度40%-70%，光照周期為12 h。本實驗方案獲得南京中醫藥大學動物實驗倫理委員會的批準，倫理編號為202206A036。

1.2 藥物

1.2.1 藥材

人參（Panax ginsengC.A.Mey，批號：220801）、石菖蒲（Acorus tatarinowiiSchott，批號：220621）、茯苓（Poria cocos(Schw.) Wolf，批號：220701）、遠志（Polygala tenuifoliaWilld，批號：210601）采購于蘇州市天靈中藥飲片有限公司，經南京中醫藥大學鑒定教研室劉圣金教授鑒定為合格藥材。

1.2.2 實驗試劑

氟西汀鹽酸鹽（≥98%）購自上海阿拉丁生化科技有限公司（F131623-25 g）；蔗糖購自上海阿拉丁生化科技有限公司（S112228-500 g）；小鼠皮質醇（Cortisol）ELISA 試劑盒（AF30178-A）、小鼠促腎上皮質激素釋放因子（CRF）ELISA 試劑盒（AF2554-A）、小鼠促腎上腺皮質激素（ACTH）ELISA 試劑盒（AF2110-A）均購自湖南艾方生物科技有限公司; 實驗所用抗體Caspase-3 Antibody、Caspase-9 Antibody、Anti-rabbit IgG 均購自CST 公司，β-actin Monoclonal Antibody 購自湖南艾方生物科技有限公司。

1.3 儀器

小鼠電子計重秤（YHW-L01，英衡）、精密分析天平（瑞士Mettler Toledo 公司）、旋轉蒸發儀（瑞士Buchi公司）、全自動樣品快速研磨儀（上海凈業信發展有限公司）、AXIO Vert.A1 熒光倒置顯微鏡、ImageXpress Pico 自動細胞成像系統和Cell ReporterXpress 自動成像分析軟件（上海美谷分子儀器公司）、凝膠成像系統（Bio-Rad）。

2 方法

2.1 開心散提取物的制備

稱取人參、遠志、石菖蒲、茯苓四種藥材共100 g，比例為3∶2∶2∶3，加入1000 mL水，回流提取2 h，過濾。重復上述回流提取過程并合并兩次回流提取液，減壓濃縮至濃度為1 g·mL-1。

2.2 CUMS模型建立及分組

動物安置7 天以適應環境，進行體質量與糖水偏嗜率測試，剔除數值異常小鼠。選取測試評分正常的小鼠80 只，隨機分為8 組，每組10 只。組別分別為空白組（Control）、模型組（Model）、開心散組（KXS）、氟西汀低量組（FXT-L）、開心散+氟西汀低量組（KXS+FXT-L）、氟西汀中劑量組（FXT-M）、開心散+氟西汀中劑量組（KXS+FXT-M）、氟西汀高劑量組（FXT-H）?？瞻捉M小鼠與模型小鼠分開飼養，不給予任何刺激。模型小鼠每天隨機給予不同的1-2 種刺激，刺激方式包括：禁水24 h、禁食24 h、斜籠、電擊、束縛4 h、濕籠、晝夜顛倒。每周進行體質量和糖水偏嗜測試，記錄小鼠體質量變化與糖水偏嗜率。持續6 周，待抑郁表型出現后，對抑郁小鼠進行灌胃給藥。動物的分組和給藥劑量詳見表1。

表1 小鼠分組和給藥劑量

2.3 行為學檢測

采用糖水偏嗜實驗評價小鼠的抑郁樣行為，具體過程參照本課題組已發表過文章[17]。

2.4 ELISA法測定壓力應激因子的表達

行為學測試結束后小鼠眼眶取血，靜置2 h 后離心2 次，20 min 后取上清。按照小鼠各ELISA 試劑盒所列步驟，測定小鼠血清中壓力應激因子的水平。

處死小鼠快速剝取大腦海馬和下丘腦，用PBS 沖洗，迅速冷凍在-80℃冰箱中。使用精密天平每組稱取一定量組織，用PBS 溶液低溫研磨，制成10%的勻漿液。取上清，按照小鼠ELISA 試劑盒所列步驟，測定小鼠海馬和下丘腦組織中壓力應激因子的水平。

2.5 腦片HE染色

小鼠行為學測試后，解剖受試動物，取出完整大腦，用冰冷的生理鹽水沖洗，4%的多聚甲醛固定72 h。梯度蔗糖脫水，將固定的腦組織常規處理石蠟包埋，旋轉切片機切取5 μm 切片。切片用蘇木精染色10 min，蒸餾水洗2 次，于70%乙醇中分化20-30 s，伊紅復染10 min，蒸餾水洗2 次，梯度乙醇脫水，二甲苯透明后中性樹膠封片。光學顯微鏡下觀察小鼠海馬切片的病理情況，光學顯微鏡下觀察小鼠海馬區的凋亡情況。

2.6 腦片Nissl染色

將“2.5”項下所制得的石蠟切片用尼氏染色液染色10 min，蒸餾水洗2 次，梯度乙醇脫水，二甲苯透明后中性樹膠封片。光學顯微鏡下觀察小鼠海馬區神經元的排列與數目以及尼氏小體破碎情況，光學顯微鏡下觀察小鼠海馬區的凋亡情況。

2.7 TUNEL檢測海馬區凋亡

將“2.5”項下所制得的石蠟切片脫蠟，根據TUNEL 試劑盒檢測步驟進行檢測，熒光顯微鏡下觀察小鼠海馬區的凋亡情況。

2.8 蛋白免疫印跡法

行為學測試結束后，快速處死動物并剝取海馬組織，PBS 沖洗，迅速冷凍于-80℃冰箱中。稱取一定量組織，RIPA 蛋白裂解液提取組織總蛋白，BCA 法測定總蛋白濃度，于98℃，5 min 高溫變性。制備10%聚丙烯酰胺凝膠，上樣后90 V 2 h 電泳，300 mA 轉膜2 h，5% BSA 封閉，一抗（Caspase-3 Antibody、Caspase-9 Antibody、β-actin Monoclonal Antibody），抗體比例1:3000。4℃過夜，孵育二抗（Anti-rabbit IgG），二抗比例1:10 000，室溫50min。ECL試劑盒顯色。

2.9 統計學處理與數據表示

采用SPSS 19.0 統計軟件對實驗數據進行統計分析，組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA）。P<0.05 為有差異；P<0.01 為有極顯著差異。

3 結果

3.1 開心散聯合氟西汀改善抗抑郁效用評價

小鼠CUMS 抑郁模型建立成功后，按照表1 給藥方案對動物進行灌胃給藥。開心散組給藥劑量根據臨床常用生藥材劑量進行折算；氟西汀低劑量組參照氟西汀臨床常用劑量的1/2 進行設置；氟西汀中劑量組參照氟西汀臨床常用劑量進行設置；氟西汀高劑量組參照氟西汀臨床使用的最高劑量進行設置。

給藥后第3 天，測試糖水偏嗜率評價動物抑郁樣行為。與空白組小鼠相比，模型組小鼠糖水偏嗜率顯著降低（P<0.01）。與模型組小鼠相比，開心散組、氟西汀低劑量組以及中劑量組小鼠的糖水偏嗜率與模型組相比未見顯著性差異，氟西汀高劑量組糖水偏嗜率顯著升高。聯用后，開心散聯合氟西汀低劑量組與中劑量組糖水偏嗜率相比模型組顯著升高（P<0.05），其中開心散聯合氟西汀中劑量組的作用趨勢與氟西汀高劑量組相似（P<0.01）。給藥第7 天后，與空白組小鼠相比，模型組小鼠糖水偏嗜率顯著降低（P<0.01）。與模型組小鼠相比，開心散組、氟西汀中劑量組與高劑量組小鼠糖水偏嗜率顯著上升（P<0.05），氟西汀低劑量組仍無顯著差異。聯合用藥組中，開心散聯合氟西汀低劑量組小鼠糖水偏嗜率顯著提高且效用與氟西汀中劑量組相似（P<0.01）；開心散聯合氟西汀中劑量組小鼠糖水偏嗜率顯著提高且效用與氟西汀高劑量組相似（P<0.01）。上述結果表明，開心散與氟西汀聯用顯著改善模型小鼠抑郁樣行為，可提升單用氟西汀抗抑郁起效時間，同時可降低氟西汀抗抑郁用量（見圖1）。

圖1 開心散聯合氟西汀對CUMS小鼠行為學的影響（n=7）

3.2 開心散聯合氟西汀對小鼠血清中壓力應激軸相關因子調控的影響

采用ELISA 法測定小鼠血清中“下丘腦-垂體-海馬”壓力應激軸（Hypothalamus-Pituitary gland-Adrenal gland，HPA）軸調控因子CRF、ACTH 和Cortisol的表達。與空白組相比，模型組小鼠血清中CRF、ACTH 和Cortisol 的表達顯著上升（P<0.01）。與模型組相比，開心散顯著下調模型小鼠血清中CRF、ACTH和Cortisol 的表達（P<0.01）；氟西汀低劑量組除下調ACTH 表達外（P<0.05），CRF 與Cortisol 表達未見顯著性差異；氟西汀中、高劑量組則顯著下調3種壓力因子表達（P<0.01）。聯合用藥組中，開心散聯合氟西汀低劑量組顯著下調3種壓力因子表達且效用接近氟西汀中劑量組（P<0.01）；開心散聯合氟西汀中劑量組顯著下調3 種壓力因子表達且效用接近氟西汀高劑量組（P<0.01），提示其抗抑郁作用可能與抑制壓力應激HPA軸激活相關（見圖2）。

3.3 開心散聯合氟西汀對小鼠下丘腦和海馬組織中壓力應激軸相關因子調控的影響

采用ELISA 法測定小鼠下丘腦中HPA 軸調控因子CRF和海馬中Cortisol的表達。與空白組相比，模型組小鼠CRF 和和Cortisol 的表達顯著上升（P<0.01）。與模型組相比，開心散顯著下調模型小鼠下丘腦中CRF 和海馬中Cortisol 的表達（P<0.01）；氟西汀低劑量組對上述指標表達未見顯著性差異，而中劑量與低劑量組可顯著下調上述指標（P<0.01）。聯合用藥組中，開心散聯合氟西汀低劑量組可顯著下調兩種壓力因子的表達且效用接近氟西汀中劑量組（P<0.01），開心散聯合氟西汀中劑量組具有相似的作用趨勢且效用接近氟西汀高劑量組（P<0.01），提示其抗抑郁作用可能與抑制壓力應激HPA軸激活相關（見圖3）。

圖3 開心散聯合氟西汀對CUMS小鼠下丘腦和海馬壓力因子的影響（n=7）

3.4 開心散聯合氟西汀對CUMS 小鼠海馬組織結構的影響

分離并獲取受試動物全腦固定后切片HE 染色后于顯微鏡下觀察開心散與氟西汀聯合用藥對CUMS小鼠海馬組織結構的影響。與空白組相比，模型組小鼠海馬齒狀回區域細胞排列松散、細胞核固縮、細胞空泡化現象明顯，出現明顯損傷現象。與模型組相比，氟西汀低劑量組未明顯改善上述損傷現象。聯合用藥組顯著改善了上述損傷現象，且開心散聯合氟西汀低劑量組效用接近氟西汀中劑量組，開心散聯合氟西汀中劑量組效用接近氟西汀高劑量組，提示聯合用藥具有改善小鼠海馬損傷的作用（見圖4）。

圖4 開心散聯合氟西汀對CUMS小鼠海馬切片HE染色的影響（n=6）

取切片進行Nissl 染色，鏡下觀察可以發現，與空白組相比，模型組小鼠的海馬齒狀回區域細胞排列紊亂，尼氏體顯著減少（P<0.05），說明神經元的活力降低。與模型組相比，開心散組與氟西汀低劑量組對尼式體的影響未見顯著性；聯合用藥組顯著提高尼式體的數量（P<0.05），且開心散聯合氟西汀低劑量組效用優于氟西汀中劑量組，開心散聯合氟西汀中劑量組效用優于氟西汀高劑量組，提示聯合用藥可改善海馬神經元損傷（見圖5）。

圖5 開心散聯合氟西汀對CUMS小鼠海馬區腦片Nissl染色的影響（n=6）

3.5 開心散聯合氟西汀對CUMS 小鼠海馬區細胞凋亡的影響

分離并獲取受試動物全腦固定后切片TUNEL 染色后于顯微鏡下觀察開心散與氟西汀聯合用藥對CUMS 小鼠海馬區細胞凋亡的影響。與空白組相比，模型組海馬區凋亡顯著增多（P<0.01）。與模型組相比，開心散顯著減少模型動物海馬區細胞凋亡（P<0.01）；氟西汀低劑量組具有減少海馬區細胞凋亡趨勢但未見顯著性差異，而其中劑量組與高劑量組具有顯著性差異（P<0.01）。聯合用藥組可顯著減少模型動物海馬區細胞凋亡（P<0.01），開心散聯合氟西汀低劑量組效用接近氟西汀中劑量組，聯合氟西汀中劑量組效用則接近氟西汀高劑量組，提示聯合用藥可抑制慢性壓力應激導致的海馬區細胞凋亡（見圖6）。

圖6 開心散聯合氟西汀對CUMS小鼠海馬區凋亡的影響（n=6）

3.6 開心散聯合氟西汀對CUMS 小鼠海馬凋亡蛋白表達的影響

分離并獲取受試動物海馬，采用Western blotting法考察小鼠海馬中凋亡蛋白Caspase-9 和Caspase-3的表達。與空白組相比，模型組小鼠海馬中Caspase-9 和Caspase-3 的表達顯著上升（P<0.01）。與模型組相比，開心散顯著下調模型小鼠海馬中Caspase-9 和Caspase-3 的表達（P<0.01）；氟西汀低劑量組下調Caspase-9表達（P<0.05）而下調Caspase-3未見顯著性差異，其中劑量組與高劑量組均可顯著下調兩者的表達（P<0.01）。聯合用藥組中，開心散聯合氟西汀低劑量組顯著下調兩種凋亡蛋白的表達且效用接近氟西汀中劑量組（P<0.01），其聯合氟西汀中劑量組下調的效用接近氟西汀高劑量組（P<0.01），提示開心散與氟西汀聯合用藥可抑制凋亡相關信號通路的激活（見圖7）。

圖7 開心散聯合氟西汀對CUMS模型小鼠海馬凋亡蛋白的影響（n=3）

4 討論

抑郁癥的發病原因錯綜復雜，除最經典的單胺類假說外還有神經炎癥、神經營養、神經傳導、腸道菌群等諸多誘導因素，這些因素共同作用導致抑郁癥的發生發展。其中抑郁患者的神經-內分泌功能的紊亂，尤其是慢性壓力應激導致的HPA 軸激活與海馬組織凋亡進而導致抑郁情緒的發生是公認的抑郁癥病理機制[18-20]。機體處于應激狀態時，下丘腦釋放促腎上腺皮質激素釋放激素（CRH），CRH 刺激垂體分泌ACTH，ACTH 又刺激腎上腺皮質釋放糖皮質激素（GC）隨體循環入腦。正常人GC水平升高能夠通過海馬的糖皮質激素受體（Glucocorticoid receptor，GR）對下丘腦與垂體進行負反饋調節，抑制CRH 分泌并抑制HPA 軸過度激活。若HPA 軸持續過度激活則會導致腦內GC 大量堆積，使海馬組織細胞凋亡、體積變小，最終導致HPA 軸的負反饋調控機制喪失而產生海馬組織損傷。而Ramezani 等[21]使用LONI 概率腦圖譜對多個抑郁癥患者的腦部影像學數據進行分析，結果發現健康人群和抑郁人群在海馬體和左右海馬旁回處存在較大的差異。這與本研究中抑郁小鼠的海馬區存在結構的變化、神經元中尼氏體的減少和神經元的凋亡等發現相符。

氟西汀是典型的5-HT 再攝取抑制劑，其副作用和不良反應主要有神經與精神系統副作用、消化系統副作用以及性功能障礙，發生率在10%-23%[22]，主要由氟西汀自身抑制5-HT 再攝取的藥理特性導致。由于5-HT 的再攝取被氟西汀抑制,突觸間隙內5-HT 增多，過度激動5-HT3和5-HT4受體則導致厭食、口干、腸胃脹氣、惡心嘔吐、便秘、腹瀉等消化系統的副作用[23-24]；過度激動5-HT2受體則產生勃起困難、性欲減退或消失、性快感缺失、性高潮延遲或缺失、射精困難等性功能障礙[25]。中藥復方治療抑郁與西藥治療相比具有多靶點、多環節起效的特點，副作用相對較小，因此將中藥復方與氟西汀聯用以減少氟西汀用量成為臨床喜用的抗抑郁用藥方式。其中中藥開心散作為臨床驗證有效的治療輕度與中度抑郁癥的抗抑郁經典名方，并且實驗研究發現其可以通過增加神經遞質與神經營養因子表達，抑制HPA 軸過度激活，調控“腦-腸軸”干預神經元炎性損傷等多種途徑發揮抗抑郁作用[26-27]。在本研究中也發現開心散與氟西汀聯合用藥可以有效抑制慢性壓力應激導致的小鼠HPA 軸激活與干預海馬凋亡損傷，同時開心散可提升氟西汀抗抑郁起效時間并減少氟西汀的用量，發揮增效作用。

開心散方中藥味人參可大補元氣、健脾益肺、生津止渴、安神益智，其中人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1均具有強大的神經保護作用[28-29]；茯苓可利水滲濕、健脾和胃、養心安神，其所含三萜類成分茯苓酸具有緩解神經炎癥、抗氧化應激[30]的作用；遠志鎮靜催眠、交通心腎，石菖蒲化濕開竅，其中遠志口山酮Ⅲ和細辛醚類成分均可顯著提高壓力應激模型下細胞的存活率，是通過HPA 軸進行調控的重要成分[26,31]；同時孫宇飛[32]通過藥代動力學等手段研究發現遠志和石菖蒲可以通過中藥配伍后的協同作用促進人參與茯苓兩味藥的治療效果。在未來的研究中，將深入研究開心散中效用成分與氟西汀聯用后增效的作用機制，為中西結合抗抑郁提供更多的科學依據。