中藥復方開心散調控慢性壓力應激小鼠海馬神經新生抗抑郁作用機制研究＊

鄭嘉妮，黃靈欣，陸韞青，李 璇，陳 楊，仝佳祥，朱梓強，段金廒，李樂軍，朱 悅＊＊

（1.南京中醫藥大學藥學院，江蘇省方劑研究重點實驗室/江蘇省方劑高技術研究重點實驗室/中藥資源產業化與方劑創新藥物國家地方聯合工程研究中心/江蘇省中藥資源產業化過程協同創新中心 南京 210023；2.南京中醫藥大學附屬蘇州市中醫醫院 蘇州 215007）

抑郁癥是以顯著而持久的心境低落，同時伴有思維遲緩、認知功能和意志活動減退等主要臨床特征的心境障礙疾病[1]。受COVID-19 影響，2020 年全球范圍內重度抑郁癥增加了28%[2]，因此抑郁癥已成為危害公眾身心健康的重大疾病。目前臨床常用的抗抑郁藥物多為單胺類神經遞質再攝取抑制劑，但有近40%患者對該類藥物效用不明顯[3]。此外，使用該類藥物易出現惡心、便秘等胃腸道反應以及勃起功能障礙等不良反應，嚴重影響了患者服藥依從性[4]。

研究發現，抑郁癥病理機制極為復雜，涉及神經遞質重攝取障礙、神經營養因子缺乏、壓力應激下丘腦-垂體-腎上腺軸異常激活、神經炎癥損傷等多重環節[5]。上述多重環節綜合作用最終損害海馬區神經元是抑郁癥的重要病理環節。尤其值得重視的是，多種研究認為海馬區齒狀回區域神經元即使在成年后也可新生生長，突破了中樞神經難以新生的傳統認識[6]。臨床研究發現，嚴重抑郁癥患者較正常人海馬體積顯著減少，并伴有顯著的認知缺失[7]。動物實驗表明，現有的單胺類神經遞質再攝取抑制劑類抗抑郁藥物、體育鍛煉和電療等均可通過促進神經干細胞增殖與海馬神經元新生發揮抗抑郁作用，而其藥效也能通過轉基因或藥物干擾阻斷神經新生所拮抗[8]。因此，促進海馬區神經新生成為抑郁癥治療策略與藥物開發的研究熱點之一。

開心散始載于唐代孫思邈《備急千金要方》[9]，由人參、遠志、石菖蒲、茯苓組成。主治心氣不足證，癥見神志不寧，健忘失眠，心悸怔忡等。功可益氣養心、安神定志，是經臨床證實的改善輕、中度抑郁癥的有效方劑，并被納入2018 年國家中醫藥管理局公布的首批古代經典名方目錄?，F代研究發現，該方可以通過促進神經遞質與神經營養因子供給，抑制壓力應激軸激活，減輕神經炎癥等多環節、多靶點改善抑郁動物模型的抑郁樣行為，但是關于其對海馬區神經新生的影響未見報道[10]。因此，本研究擬基于慢性溫和不可預知刺激小鼠抑郁模型[11]與小鼠原代神經干細胞培養體系，評價開心散對模型小鼠海馬神經新生的影響并探索相關信號通路，為開心散臨床應用提供參考。

1 材料

1.1 動物

ICR 小鼠，雄性，體質量22-25 g，購自江蘇集萃藥康生物科技有限公司，動物許可證號SCXK（蘇）2018-0008。動物飼養于南京中醫藥大學實驗動物中心SPF環境中，常規飼養，12 h 光照，溫度22-25℃，濕度40%-70%。ICR 小鼠孕鼠（14 天），購自江蘇集萃藥康公司，許可證號：SCXK（蘇）2018-0008。

1.2 試劑

氟西?。‵131623）購自阿拉丁試劑公司，5-溴脫氧尿嘧啶核苷（5-Bromodeoxyuridinc，BrdU，ST1056）、5-乙炔基-2’-脫氧尿苷（5-ethynyl-2’-deoxyuridine，EDU，C0071S）試劑盒購自碧云天生物科技有限公司?？贵wβ-catenin Rabbit mAb（8480S）、GSK-3b Rabbit mAb（9315S），Histone H3 Rabbit mAb（9715S）、NeuN Rabbit mAb（24307S）、Anti-rabbit IgG Fab2 Alexa Fluor（M）488（4408S）購自Cell Signaling Test 公司；Wnt3a Mouse antibody（sc-136163）、β-actin Mouse antibody（66009-1-lg）購自Proteintech 公司；Nestin Rabbit antibody（MAB353）購自Millipore 公司；HRP-Linked Anti-Mouse IgG（BA1050），HRP-Linked Anti-Rabbit IgG（BA1054 購自BOSTER 公司。小鼠促腎上腺皮質激素（AF2554-A）、促腎上腺皮質激素釋放因子（AF30178-A）、皮質醇（AF2565-A）ELISA 試劑盒購自湖南艾方生物科技有限公司。小鼠神經生長因子（NGF，JEB-12458）、腦源性神經營養因子（BDNF，JEB-12339）ELISA 試劑盒購自南京金益柏生物科技有限公司。Neurobasal（21103-049）、B27（17504-044）、N2（17502001）培養基購自Gibco 公司；DMEM/F12培養基購自CORNING 公司；胎牛血清、青鏈霉素、Trypsin solution B （03-024-5B） 購 自 Biological Industries 公司；表皮生長因子（EGF）、堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）購自Proteintech公司。

1.3 藥材

人參（Panax ginsengC.A.Mey）、遠志（Polygala tenuifoliaWilld）、石菖蒲（Acorus tatarinowiiSchott.）、茯苓（Poria cocos（Schw.）Wolf）藥材飲片購自蘇州天靈中藥飲片公司，經南京中醫藥大學段金廒教授鑒定為合格藥材。

1.4 儀器

凝膠成像系統（Bio-Rad）；動物行為測試系統（上海吉量軟件公司）。二氧化碳培養箱（Thermo 3100，美國Thermo 公司）；倒置顯微鏡（TE-2000，Nicon 公司）；恒溫混均儀（TS100，杭州瑞誠儀器有限公司）；超微量紫外/可見分光光度計（DENOVIX DS-11，美國）；AXIO Vert.A1熒光倒置顯微鏡（Zeiss公司）。

2 方法

2.1 開心散提取物的制備

按照人參、遠志、石菖蒲、茯苓（3∶2∶2∶3）的配伍比例，稱取100 g 藥材，采用8 倍量的溶劑回流提取2 次，每次2 h，過濾，合并2 次提取液，減壓濃縮，合并2次濾液，減壓濃縮至約1 mL藥液中含有1 g生藥的浸膏，冷凍干燥，得到開心散水提取物凍干粉。使用前，按需復溶。

2.2 慢性不可預知壓力應激抑郁動物模型建立與行為學測試

取健康ICR 小鼠60 只，適應性飼養1 周后隨機分為5 組，每組12 只。依據課題組前期已建立的慢性不可預知壓力應激（Chronic unpredictable mild stress，CUMS）動物模型方法構建模型，實驗流程見圖1。刺激條件包括：①飼養籠傾斜45° 12 h；②禁食24 h；③禁水24 h；④足底電擊3 次；⑤束縛2 h；⑥夾尾1 min；⑦強迫游泳10 min；⑧夜間照明12 h。隨機選取8 種條件中的4 種對小鼠進行刺激，每天1 次，持續8 周，各組小鼠同一天內接受的刺激相同。以糖水偏好實驗（Sucrose preference test，SPT）、懸尾實驗（Tail suspension test，TST）與強迫游泳實驗（Forced swimming test，FST）等行為學測試實驗結果判斷模型構建與給藥效果（見表1）。受試動物首先進行SPT 測試；TST 測試于SPT 測試結束24 h 后進行；FST 測試于TST 測試結束24 h 后進行（見圖1）。模型建立與行為學測試方法詳參相關文獻[12-13]。

圖1 實驗流程

表1 實驗動物給藥劑量

2.3 動物分組給藥與劑量

模型構建成功后，對照組與模型組小鼠按體質量每10 g 灌胃0.1 mL 生理鹽水。其余各組小鼠灌胃相應藥物，每日1 次，持續10 天給藥，開心散提取物劑量按照提取物制備得率折算成生藥量。灌胃第3天給需要灌注取材的小鼠腹腔注射BrdU（100 mg·kg-1·d-1），每天1 次，共7 次。給藥期間，模型組與給藥組動物維持壓力應激造模。

2.4 小鼠壓力應激因子與神經營養因子測定

行為學測試結束后，處死小鼠，分離得到小鼠海馬、下丘腦、腎上腺等組織。液氮迅速冷凍，粉碎。稱取相應重量組織，加入10 倍體積裂解液（10 mmol·L-1HEPES，pH=7.5，1 mol·L-1NaCl，1 mmol·L-1EDTA，1 mmol·L-1EGTA，0.5% Triton X-100，5 mmol·L-1benzamidine HCl，10 mmol·L-1aprotinin，10 mmol·L-1leupeptin），ELISA 法檢測下丘腦中促腎上腺皮質激素釋放因子（Corticotropin-releasing factor，CRF），腎上腺中促腎上腺皮質激素（Adrenocorticotropic hormone，ACTH），海馬中皮質醇（Cortisol）、神經生長因子（Nerve growth factor，NGF）與腦源性神經營養因子（Brain derived nerve growth factor，BDNF）的含量，試劑盒檢測范圍為7.8-500.0 pg·mL-1。

2.5 免疫熒光法檢測小鼠海馬區細胞增殖情況

受試小鼠完成行為學測試后，處死小鼠解剖獲得全腦，于4%多聚甲醛中固定24 h；分別于20%、25%、30%蔗糖溶液中浸泡梯度脫水。取脫水后腦組織，制備腦組織海馬區石蠟包埋切片，切片常溫保存。所得的腦組織石蠟切片脫蠟之后，浸于檸檬酸鈉緩沖溶液中微波加熱15 min。根據BrdU 試劑盒標準步驟，檢測模型動物海馬區神經新生水平。用光學顯微鏡400倍放大率觀察海馬組織病理變化。

2.6 免疫蛋白印跡法

每組稱取海馬組織，記錄重量，加入10 倍量的RIPA裂解液與蛋白酶抑制劑（50∶1），研磨后置于冰上裂解30 min，離心10 min 取上清。按照BCA 試劑盒的操作步驟測定總蛋白含量，98℃加熱15 min，使蛋白變性。配制10%和7.5%的蛋白凝膠，120 V 電泳，nestin轉膜時間為4 h，Wnt3a、GSK-3β、β-Actin 檢測轉膜時間為1 h，β-catenin 檢測轉膜時間為2 h，5%脫脂牛奶封閉2 h。結束后加入一抗（β-catenin Rabbit mAb、GSK-3b Rabbit mAb、Wnt3a Mouse antibody、Nestin Rabbit antibody，抗體比例均為1:2000；β-Actin Mouse antibody，抗體比例為1:10000），4℃搖床過夜，二抗孵育（Anti-MouseIgG，Anti-RabbitIgG，HRP-linkedAntibody，抗體比例1∶10000），室溫孵育1 h，洗膜后使用凝膠成像系統顯色曝光。

2.7 小鼠原代神經干細胞體系建立與鑒定

異氟烷麻醉孕鼠解剖取出胎鼠并分離腦組織，于消化液（10% Trypsin solution B，90% DMEM/F12）中37℃消化15 min 后置于50 mL 離心管中，加入終止消化液（10% FBS，90% DMEM/F12）終止消化。輕柔解離組織制備細胞懸液，2184 r·min-1離心 5 min，加神經干細胞培養基（49% Neurobasal，49% DMEM/F12，0.5% N2，1% B27，0.02% bFGF，0.02% EGF，0.5% P/S）重懸細胞，以1.5×105-2.5×105個細胞·mL-1的密度接種于75 mL 培養瓶中，置37℃、5% CO2培養箱培養，每隔48 h半量換液，5-7天傳代1次。以此構建小鼠原代神經干細胞（Neural stem cell，NSCs）培養體系。

取傳代后的NSCs加入EdU（10 mol·L-1）培養48 h。接種于多聚賴氨酸預先賦予的細胞爬片。4%多聚甲醛常溫固定30 min，PBS 洗3 次，每次5 min。TritonX-100（0.3%）孵育30 min，PBS洗3次，每次5 min；10%山羊血清孵育封閉1 h 后加入Nestin 單克隆抗體（1∶100），4℃孵育過夜24 h后進行EDU染色，含FITC標記的羊抗小鼠IgG抗體（1∶100）室溫避光孵育1 h，PBS清洗3次后于熒光顯微鏡下觀察并拍攝。

2.8 統計學分析

采用SPSS 19.0軟件進行統計學分析，組內進行正態分布統計分析后，采用單因素方差分析法（One-way ANOVA）分析。組間比較采用T-test 分析，結果以均數±標準差（±s）表示，P<0.05 表示有顯著差異，以P<0.01表示有極顯著差異。

3 結果

3.1 開心散提取物抗抑郁效用評價

建立CUMS模型小鼠，造模成功后，給以開心散提取物與氟西汀10天后，進行行為學測試。與對照組相比，CUMS 模型組小鼠糖水偏嗜率（Sucrose preference test，SPT）顯著降低（P<0.01），懸尾實驗（Tail suspension test，TST）和強迫游泳（Forced swimming test，FST）不動時間顯著增加（P<0.01）。與模型組相比，氟西汀給藥組SPT 顯著提升，TST 和FST 不動時間顯著減少（P<0.01），提示模型構建成功。與模型組相比，開心散提取物的低、高劑量組均能提升模型小鼠的SPT，降低TST 和FST 測試不動時間（P<0.01），改善模型小鼠抑郁樣行為，其中開心散高劑量組作用趨勢更加明顯（見圖2）。

圖2 開心散對抑郁模型小鼠行為學的影響（n=10）

3.2 開心散提取物對抑郁模型小鼠海馬區細胞增殖的影響

通過BrdU法考察小鼠海馬區細胞新生水平，結果如圖3 所示。與對照組相比，模型組新生細胞數顯著減少（P<0.01）。與模型組相比，開心散提取物給藥后能夠顯著逆轉模型小鼠海馬新生細胞減少的趨勢（P<0.01），提示開心散具有促進海馬細胞新生的作用，以高劑量作用趨勢更強。

圖3 開心散對抑郁模型小鼠海馬區神經細胞新生的影響（n=6）

3.3 開心散提取物對抑郁模型小鼠海馬組織巢蛋白表達的影響

采用Western blot 法檢測受試小鼠海馬組織中神經干細胞標志物巢蛋白（nestin）的表達水平，結果如圖4 所示，與對照組相比，模型組小鼠海馬組織中nestin 含量顯著下降（P<0.01），說明CUMS 模型小鼠海馬區神經干細胞新生減少。與模型組相比，開心散低、高劑量組均可提高小鼠海馬組織中nestin 蛋白表達（P<0.05），開心散高劑量效用趨勢更強。

圖4 開心散對抑郁模型小鼠海馬區nestin蛋白表達的影響（n=8）

3.4 開心散提取物對抑郁模型小鼠壓力因子表達的影響

解剖受試動物，分離得到小鼠海馬、下丘腦、腎上腺等組織，ELISA 試劑盒檢測海馬Cortisol、下丘腦CRF、腎上腺ACTH 的含量，結果如圖5 所示。與對照組相比，模型組小鼠Cortisol、CRF、ACTH 含量顯著上升（P<0.01）。與模型組相比，開心散低、高劑量組均可降低小鼠Cortisol、CRF、ACTH 含量（P<0.05），以開心散高劑量效用趨勢更強。

圖5 開心散對抑郁模型小鼠壓力因子表達的影響（n=8）

3.5 開心散提取物對抑郁模型小鼠海馬組織營養因子表達的影響

解剖受試動物，分離得到小鼠海馬組織，制備組織勻漿液。試劑盒檢測小鼠海馬組織BDNF、NGF 的含量，結果如圖6 所示，與對照組相比，模型組小鼠BDNF、NGF 含量顯著下降（P<0.01），與模型組相比，開心散低、高劑量組均可升高小鼠BDNF、NGF 含量（P<0.05），以開心散高劑量效用趨勢更強。

圖6 開心散對抑郁模型小鼠海馬營養因子表達影響（n=8）

3.6 開心散提取物對抑郁模型小鼠海馬組織Wnt、β-catenin、GSK-3β蛋白表達的影響

采用Western blot 法檢測受試小鼠海馬中Wnt、β-catenin、GSK-3β 的相對表達水平，結果見圖7。與對照組相比，模型動物海馬中Wnt、β-catenin 的表達水平較對照組顯著下調（P<0.05）。與模型組相比，開心散提取物低、高劑量均可上調模型動物海馬中Wnt、β-catenin 的表達水平（P<0.05）；并且模型動物海馬中GSK-3b 的表達水平較對照組顯著上調（P<0.05）。與模型組相比，開心散提取物低、高劑量均可下調模型動物海馬中GSK-3β 的表達水平（P<0.05），以開心散高劑量效用趨勢更強。

圖7 開心散提取物對抑郁模型小鼠海馬組織中Wnt/β-catenin通路蛋白表達的影響（n=8）

3.7 小鼠神經干細胞的鑒定

小鼠NSCs細胞于顯微鏡明場（Bright field）觀察時由多個神經球聚集形成細胞團，細胞團體積大小各不相同，周圍有新增殖的體積相對較小的神經球，無明顯的片狀物，雜質細胞少（圖8）。免疫熒光顯示，NSCs呈nestin 染色陽性（圖8）和EdU 染色陽性（圖8），說明本實驗方法培養出的細胞為NSCs且具有增殖能力。

圖8 小鼠NSCs的鑒定（比例尺=50 μm，n=6）

3.8 開心散提取物對小鼠NSCs中細胞增殖的影響

為了考察開心散提取物對NSCs增殖的影響，將提取物凍干粉按照低、中、高3個濃度（1、3、10 μg·mL-1）加至NSCs 中作用24 h 后，固定細胞，以免疫熒光實驗法檢測EDU 表達。結果如圖9 所示，與對照組相比，開心散提取物不同劑量均能夠明顯提高NSCs 中EDU 表達（P<0.01），提示開心散能夠促進NSCs增殖。

圖9 開心散對小鼠NSCs增殖水平的影響（n=6）

除免疫熒光法，通過Western blot 法檢測NSCs 標志物nestin 表達以考察開心散提取物對NSCs 增殖的影響。結果如圖10 所示，與對照組相比，給藥開心散提取物不同劑量均能夠明顯提高nestin蛋白的表達（P<0.01），也間接佐證了開心散提取物促進NSCs增殖。

圖10 開心散對小鼠NSCs中nestin蛋白表達的影響（n=6）

3.9 開心散提取物對小鼠NSCs 中Wnt/β-catenin 信號通路調控的影響

將NSCs 與開心散提取物共同作用24 h 后，通過Western blot 法檢測Wnt、β-catenin、GSK-3β 的表達。結果如圖11 所示，與對照組相比，開心散提取物不同劑量均能夠明顯提高Wnt、β-catenin 蛋白的表達（P<0.05）、降低GSK-3β 蛋白表達（P<0.05）。結果提示開心散提取物對Wnt/β-catenin信號通路具有調控作用。

圖11 開心散提取物對小鼠NSCs中Wnt/β-catenin通路蛋白表達的影響（n=6）

依據上述實驗結果，進一步考察開心散提取物對小鼠NSCs中β-catenin入核情況的影響。結果如圖12顯示，與對照組相比，NSCs 加入不同劑量的開心散提取物后，胞漿內β-catenin 的表達水平降低，胞核內β-catenin 的表達水平提高（與對照組相比，P<0.05），提示開心散提取物可以促進β-catenin 入核，對Wnt/β-catenin通路具有調控作用。

圖12 開心散提取物對小鼠NSCs中β-catenin蛋白入核表達的影響（n=6）

4 討論

傳統觀點認為，成年哺乳動物腦內神經元不具備新生能力。自從Altman和Das采用BrdU 摻入法，發現了成年大鼠海馬齒狀回中存在神經干細胞并具有神經新生現象后，海馬區神經新生成為神經科學關注的焦點[14-17]。抑郁癥的發生也認為與海馬神經新生密切相關[18-20]，持續壓力應激導致的皮質酮水平上升會導致CUMS 抑郁模型小鼠海馬齒狀回細胞增殖減少，海馬神經新生減少，促進焦慮和抑郁的病程發展[21]。多種抑郁治療手段能夠促進神經新生并改善模型動物抑郁樣行為[22]。因此，海馬神經新生被視為抗抑郁藥物的重要作用機制。本研究發現開心散水提物能夠顯著抑制持續壓力應激導致的CUMS小鼠壓力應激軸激活并降低海馬區cortisol 表達，促進海馬區NGF 與BDNF 表達，并顯著促進海馬區BrdU 和nestin 的表達，上調小鼠原代神經干細胞中EdU 和nestin 的表達，表明神經新生調控可能是開心散提取物抗抑郁作用的重要環節。

Wnt/β-catenin 信號通路是神經元新生與NSCs 增殖的經典通路[23]。Wnt 蛋白與細胞膜上的Frizzled 結合，抑制GSK-3β 活性，使其不能磷酸化β-catenin；并導致Axin 不穩定，APC、GSK-3β 和Axin 降解復合物無法形成，抑制β-catenin 磷酸化而使其在細胞質內聚集。β-catenin 聚集達到一定量時，可向細胞核內移位并與細胞核內TCF/LEF 轉錄復合物結合，作為轉錄激活因子可引起靶基因表達并促進NSCs 增殖[24]。本研究也發現，開心散能夠促進β-catenin入核。亦有報道顯示，開心散具有改善多種AD 模型小鼠的學習與記憶能力[25]，Wnt/β-catenin 信號通路也是其促進海馬區神經新生重要的調控通路[26]。因此，Wnt/β-catenin 信號通路是開心散調控海馬神經新生的重要信號通路。

開心散是經臨床證實的輕、中度抑郁癥有效治療方劑[27]。方中人參大補心氣，鼓動氣血上榮于腦，腦得陽氣溫煦與陰血滋養。遠志開心氣寧心安神，兼豁痰利竅以泄濁。石菖蒲開竅化濕，茯苓淡滲利水，使痰濕得化，不復上僭。四藥同用，共奏補心安神，開心益智之功。同時根據辨證論治的需要，心氣不足較重則重用人參與遠志，痰濕阻竅較重則重用石菖蒲與茯苓，從而形成了不同配比的開心散類方。課題組基于抑郁癥動物模型研究發現，開心散可通過增加單胺類神經遞質供給[28-29]、抑制壓力應激HPA 軸激活，調控“腦-腸”軸改善中樞神經炎癥等多環節[30-31]、多靶點發揮抗抑郁效用。其中，神經營養因子調控是開心散發揮抗抑郁作用的重要作用環節。研究發現，開心散可促進神經營養因子NGF與BDNF合成并抑制降解從而提升抑郁模型動物海馬中相關營養因子表達。開心散不同配伍比例中，以人參、遠志、石菖蒲、茯苓藥材配比為3∶2∶2∶3 比例的配伍組合促進NGF 與BDNF 表達效用最為顯著?；诩毎Ｐ?，還發現開心散能夠促進星形膠質細胞分泌神經營養因子[32]，并協同低濃度NGF 促進大鼠腎上腺髓質嗜鉻瘤PC12 細胞分化與神經絲纖維蛋白表達[12,33]，其中人參皂苷可能為其主要功效成分[32]。這些研究結果均證實了神經營養因子調控是開心散抗抑郁的重要作用環節，也與其他相關研究報道一致[34]。

基于神經營養因子供給是開心散調控神經新生改善抑郁的重要環節，在本研究中以CUMS 抑郁模型小鼠為研究對象，并結合NSCs 模型，繼續探究開心散是否能促進海馬區神經新生與促進原代神經干細胞增殖。研究結果表明，開心散確實具有上述效用，同時也發現Wnt/β-catenin 信號通路是其調控的重要信號通路。已有研究表明，人參皂苷Rg1具有神經營養、促進神經新生的作用[35]。遠志寡糖酯類化合物可以調節內分泌、細胞保護、增加神經營養因子BDNF 表達[36-37]。石菖蒲可通過提高海馬區神經營養因子逆轉抑郁行為[38]，β-細辛醚也能夠通過調控海馬神經突觸可塑性相關因子的表達，改善小鼠學習記憶能力障礙[39]。茯苓水提液對東莨菪堿、30%乙醇所致記憶再現障礙兩種模型小鼠的學習記憶能力均有改善作用[40]。以上結果也提示，這些成分可能是開心散促進海馬區神經新生抗抑郁的功效物質基礎。

本研究基于小鼠CUMS 抑郁模型，發現了開心散具有抑制壓力應激HPA 軸激活，增進神經營養因子供給，從而促進海馬神經新生與增進神經干細胞增殖改善小鼠抑郁樣行為的效用，同時發現Wnt/β-catenin 通路可能是其調控神經新生的重要調控通路。課題組將深入挖掘開心散調控神經新生抗抑郁的功效物質基礎，助力于這一經典名方抗抑郁的臨床應用與二次開發。