杞參益智方改善Aβ1-42海馬區注射小鼠學習與記憶能力的效用評價與作用機制研究＊

朱梓強，陸韞青，鄭嘉妮，曹 程，陳 楊，仝佳祥，李 璇，郭 盛，2，段金廒＊＊，朱 悅＊＊

（1.南京中醫藥大學藥學院，江蘇省方劑研究重點實驗室/江蘇省方劑高技術研究重點實驗室/中藥資源產業化與方劑創新藥物國家地方聯合工程研究中心/江蘇省中藥資源產業化過程協同創新中心 南京 210023；2.寧夏枸杞創新中心 銀川 750000）

阿爾茲海默癥（Alzheimer’s disease，AD）是一種起病隱匿、呈緩慢漸進的以記憶力損害和認知障礙為主的神經系統退行性疾病，并且多發于老年人群，也是老年期癡呆中最常見的一種類型[1]。該病臨床主要表現為記憶與認知障礙、視覺空間損害，并伴隨有情感淡漠、注意力渙散等精神障礙[2]。據統計，2018 年中國已約有1000 多萬AD 患者，預計2050 年患病人數將超過3000萬[3]，給社會和家庭帶來巨大的負擔與壓力。隨著我國已進入老齡化社會以及老齡人口數量的與日俱增，AD的防治已成為醫學關注的熱點問題。

AD 的神經病理變化主要表現為b 淀粉樣蛋白（Amyloid-β peptide，Ab）在神經元細胞外異常沉積形成的老年斑，同時存在大量的神經元纖維纏結（Neurofibril tangle，NFT）[4]。研究發現AD 發病機制與Aβ 沉積導致的氧化應激和神經炎癥密切相關[5]。Aβ沉積導致體內產生大量氧自由基，攻擊細胞生物大分子，破壞細胞正常功能。同時Aβ 沉積激活小膠質細胞，促使細胞釋放大量促炎物質如白介素1β（Interleukin-1β，IL-1β）、白介素6（Interleukin-6，IL-6）與腫瘤壞死因子α（Tumor necrosis factor α，TNF-α），導致中樞神經炎癥。氧化應激與炎性應激綜合作用導致海馬組織神經元凋亡，影響學習與記憶能力[6]。在氧化應激通路調控中，核因子紅細胞2 相關因子2（Nrf2）是在調控氧化應激過程中起著關鍵作用的轉錄因子[7]。正常情況下，Nrf2 與抗氧化應答元件（Antioxidant response elements，ARE）發生結合，調節下游靶基因血紅素加氧酶1（Heme oxygenase 1，HO-1）的表達，在氧化應激條件下發揮細胞保護作用。氧化應激破壞了氧化還原平衡，抑制Nrf2/HO-1信號激活，抗氧化蛋白HO-1 表達下調，導致細胞凋亡[8]。目前AD 臨床治療一線藥物主要是膽堿酯酶抑制劑如多奈哌齊以及N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受體阻斷劑美金剛（Memantine）等[9]。但是膽堿酯酶抑制劑對于心功能不全患者慎用或禁用。同時AD 重在預防以及干預窗口應提早到輕度認知功能障礙（Mild cognitive impairment，MCI）階段也已經取得共識[10-11]。

中醫理論認為，AD 為老年期神志疾病，病位在腦?；颊叱Ｒ蚋文I虧虛，精虧髓枯，氣虛血少，心脾兩虛，導致髓?？仗?，神志失養，漸成健忘甚至癡呆[12]。杞參益智方在宋代著名官修方書《圣濟總錄》所載經典方劑“二精丸”之枸杞子與黃精的基礎上，加味人參與益智仁組成，具有滋補肝腎、益精填髓、養心安神的功效，且處方組成均為藥食兩用中藥材，安全性高。本研究通過構建Aβ1-42海馬區注射擬AD 小鼠模型，評價杞參益智方改善學習與記憶效用并初步探索作用機制，為AD防治保健產品的開發提供理論科學支持。

1 材料

1.1 動物

體質量為18-22 g 的健康SPF 級C57BL/6 小鼠，購自斯貝福生物科技有限公司，許可證號：SCXK（京）2018-0003，小鼠在實驗動物中心常規飼養。本實驗獲得NJUCM 動物實驗倫理委員會的批準（倫理批號：202207A045）。

1.2 藥物

枸杞子（Lycium barbarumL.，批號：2106157）、黃精（Polygonatum sibiricumRed.，批號：237200516）、人參（Panax ginsengC.A.Mey.，批號：109200125）、益智仁（Alpinia oxyphyllaMiq.，批號：45200618）采購于亳州市紫銳藥業有限公司，經段金廒教授鑒定為正品藥材。

1.3 試劑

Aβ1-42（20JW09891）（上海諾優生物）；多奈哌齊（GD18339）（薩恩化學技術有限公司）；Marker 三色預染蛋白（180-6003）、SDS-PAGE 凝膠快速制備試劑盒（上海雅酶生物醫藥科技有限公司）；RIPA 裂解液（碧云天生物）；炎癥相關ELISA 試劑盒：小鼠白介素6（IL-6）（AF2163-A）、小鼠腫瘤壞死因子α（TNF-α）（AF2132-A）、小鼠白介素1β（IL-1β）（AF2040-A）（湖南艾方生物）；氧化應激相關試劑盒：小鼠超氧化物歧化酶（SOD）（A001-3-2）、還原性谷胱甘肽（GSH）（A006-2-1）、丙二醛（MDA）（A003-4-1）（南京建成）。Caspase-9（9508S）購自Cell Signaling Technology 公司；Bcl-2（sc-7382）購自Santa Cruz Biotechnology 公司；β-actin（66009-1-Ig）、Nrf-2（16396-1-AP）、HO-1（10701-1-LG） 、Caspase-3 （19677-1-AP） 、Bax（50599-2-Ig）購自Proteintech 公司；HRP Anti-rabbit IgG（BA1054）、HRP Anti-mouse IgG（BA1050）購自博士德公司。

1.4 儀器

小鼠腦立體定位儀；動物行為學影像采集系統（上海吉量）；AXIO Vert A1 倒置顯微鏡（Zeiss 公司）；旋轉蒸發儀（Rotavapor R-210）；多功能酶標儀（Perkin-Elmer）；貝克曼離心機（南京百瑞達生物科技有限公司）；凝膠成像系統（美國BIO-RAD）；干式恒溫金屬?。ㄓ鳶TUART）。

2 方法

2.1 杞參益智方提取物的制備

按照處方比例稱取枸杞子50 g、黃精50 g、人參30 g、益智仁30 g，加入10 倍量水回流提取1.5 h，再加8 倍量水回流提取2 次各1 h，合并提取液，濃縮至1 g·mL-1。

2.2 構建AD動物模型及動物給藥

將小鼠隨機分為5 組，每組8 只，其中5 組分別為假手術組（Sham）、模型組（Model）、杞參益智方低劑量組（QSYZ-L）、杞參益智方高劑量組（QSYZ-H）、多奈哌齊（Donepezil）陽性藥組。將小鼠稱重，異氟烷吸入麻醉，構建Aβ1-42海馬區注射誘導小鼠癡呆模型，實驗方案參考文獻[13]，模型構建成功后小鼠正常飼養1周，之后進行給藥30 天，陽性藥給予多奈哌齊（2 mg·kg-1·d-1），其余組別每日灌胃生理鹽水（0.9% NaCl），杞參益智方提取物給藥劑量根據處方生藥量進行折算。其中低劑量組給藥劑量（1.335 g·kg-1·d-1）按處方人用日常服用劑量折算確定，高劑量組給藥劑量（2.67 g·kg-1·d-1）按處方人用日常服用劑量的2倍折算確定。

2.3 行為學檢測

通過Y 迷宮和Morris 水迷宮實驗進行行為學評價，具體實驗方法按照課題組已發表的內容[13]。

2.4 海馬區腦片HE染色

解剖受試動物獲取全腦組織，參照課題組已發表實驗方法進行實驗[14]。

2.5 TUNEL染色法檢測海馬區細胞凋亡

將“2.4”項下所制得的石蠟切片脫蠟，根據TUNEL 試劑盒檢測步驟進行檢測，并用倒置顯微鏡進行拍照，檢測模型動物海馬區的凋亡水平。

2.6 氧化因子水平檢測

稱取相關海馬組織，按照試劑盒說明書檢測小鼠海馬組織中MDA、SOD、GSH的含量。

2.7 炎性因子水平檢測

稱取海馬組織，加PBS離心取上清，照ELISA試劑盒檢測說明書檢測IL-6、IL-1β、TNF-α的含量。

2.8 Nrf2、HO-1及凋亡蛋白表達檢測

稱取相關海馬組織，加入RIPA 裂解液提取蛋白并測定蛋白濃度，98℃使蛋白變性，時間15 min。按照課題組已發表實驗方法進行實驗[14]。

2.9 統計學方法

采用SPSS 19.0統計學軟件進行統計分析，數據結果以均值±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），以P<0.05 為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 杞參益智方對Aβ1-42海馬區注射小鼠學習與記憶行為的影響

采用水迷宮實驗考察杞參益智方對Aβ1-42海馬區注射誘導癡呆模型小鼠學習與記憶行為的改善作用，結果如圖1 所示。與假手術組小鼠相比，模型組小鼠穿越平臺次數顯著減少（P<0.05）、上臺前路程、潛伏期顯著增加（P<0.05），表明Aβ1-42海馬區注射導致小鼠學習與記憶能力損傷。杞參益智方水提物低劑量組和高劑量組均顯著減少模型小鼠潛伏期和上臺前路程（P<0.05），穿越平臺次數也顯著增加（P<0.05），且高劑量組作用趨勢更為顯著。Y 迷宮實驗結果如圖2所示，與假手術組小鼠相比，模型小鼠的新臂探索時間和次數顯著減少（P<0.05）。杞參益智方低劑量組和高劑量組均能顯著增加模型小鼠新臂探索時間和次數（P<0.05），低劑量組上調作用趨勢略強于高劑量組。表明杞參益智方具有改善癡呆模型小鼠記憶能力與學習的效用。

圖1 杞參益智方對癡呆模型小鼠水迷宮行為學的影響（n=7）

圖2 杞參益智方對癡呆模型小鼠Y迷宮行為學的影響（n=7）

3.2 杞參益智方對Aβ1-42海馬區注射小鼠海馬組織的影響

行為學測試結束后，處死受試動物并解剖獲取腦組織。海馬組織HE 染色結果如圖3 所示。假手術組小鼠海馬區齒狀回形態完整，未觀察到明顯結構異常，神經細胞排列緊密，細胞核清晰，無明顯的組織空泡化病變。模型組小鼠海馬區細胞排列較為松散，細胞間間隙增大，空泡化明顯、細胞數量明顯減少。杞參益智方可顯著逆轉上述趨勢，改善模型小鼠海馬損傷狀態，其中高劑量組改善趨勢更為明顯。

圖3 杞參益智方對癡呆模型小鼠海馬區腦片HE染色的影響（n=3）

3.3 杞參益智方對Aβ1-42海馬區注射小鼠海馬區細胞凋亡的影響

結果如圖4 所示，模型組小鼠較假手術組小鼠海馬區細胞凋亡數量顯著增多。杞參益智方低、高劑量組給藥后相較于模型組小鼠海馬區細胞凋亡數量顯著降低，提示杞參益智方可以抑制海馬區細胞凋亡。杞參益智方低劑量組與高劑量組作用趨勢相似，未見顯著差異。

圖4 杞參益智方對癡呆模型小鼠海馬區細胞凋亡的影響（n=3）

3.4 杞參益智方對Aβ1-42海馬區注射小鼠海馬組織氧化應激因子水平的影響

結果如圖5 所示，模型組小鼠較假手術組小鼠MDA 表達顯著升高、SOD 和GSH 水平顯著降低（P<0.05），表明模型小鼠腦內氧化應激加劇。杞參益智方低劑量組和高劑量組均能夠顯著升高SOD 和GSH 水平，顯著降低MDA的表達（P<0.05）。杞參益智方低劑量組改善SOD 和MDA 作用趨勢較高劑量組更為顯著，高劑量組上調GSH 作用趨勢更為顯著。上述結果表明杞參益智方能夠降低氧化產物的生成，提高抗氧化關鍵因子的表達，減緩氧化應激。

圖5 杞參益智方對癡呆模型小鼠海馬氧化因子表達的影響（n=5）

3.5 杞參益智方對Aβ1-42海馬區注射小鼠海馬炎性因子水平的影響

檢測受試動物海馬組織中炎性因子表達，如圖6所示。模型組小鼠較假手術組小鼠海馬中IL-6、TNF-α和IL-1β 水平顯著上升，杞參益智方能夠顯著逆轉上述趨勢，且杞參益智方高劑量組下調作用趨勢更為顯著，表明杞參益智方能夠減緩海馬炎性損傷。

圖6 杞參益智方對癡呆模型小鼠海馬組織炎性因子表達的影響（n=5）

3.6 杞參益智方對Aβ1-42海馬區注射小鼠海馬組織Nrf2、HO-1蛋白表達的影響

解剖受試動物，檢測癡呆模型小鼠海馬組織中Nrf2、HO-1 蛋白表達，結果如圖7 所示。與假手術組相比，模型組小鼠海馬中抗氧化蛋白Nrf2 和HO-1 的表達顯著下調（P<0.05）。與模型組小鼠相比，杞參益智方高劑量組能夠顯著增加模型動物海馬抗氧化蛋白的表達（P<0.05），發揮抗氧化作用。

圖7 杞參益智方對癡呆模型小鼠海馬組織Nrf2和HO-1蛋白表達水平的影響（n=5）

3.7 杞參益智方對Aβ1-42海馬區注射小鼠海馬組織凋亡蛋白表達的影響

結果如圖8 所示，模型組較假手術組小鼠海馬抗凋亡蛋白Bcl-2 蛋白表達水平顯著降低（P<0.05），凋亡蛋白Caspase-3、Caspase-9 和Bax 蛋白表達顯著升高（P<0.05）。杞參益智方低劑量和高劑量均能夠顯著抑制凋亡蛋白Caspase-3、Caspase-9 和Bax 的表達，升高Bcl-2 蛋白表達水平（P<0.05），表明杞參益智方能夠顯著抑制海馬細胞凋亡。

4 討論

AD 發病機制復雜，所提出的致病因素包括Aβ 淀粉樣蛋白沉積[15]、氧化應激[16]、中樞神經炎性損傷[17]、Tau 蛋白異常磷酸化[18]以及“腦-腸”軸失調加劇中樞炎性損傷[19]等。其中Aβ淀粉樣蛋白沉積在AD發病機制中占據極為重要的地位[20]。首先，Aβ 淀粉樣蛋白沉積，激活小膠質細胞釋放大量炎癥因子[21-22]，加劇Aβ寡聚物和原纖維聚集形成具有神經毒性的淀粉樣蛋白沉積，引發突觸損傷、小膠質細胞過度活化、中樞神經炎癥以及Tau 蛋白磷酸化等神經系統改變[23-24]。大腦相比于人體其他組織的耗氧量更高，而Aβ 沉積介導了中樞神經蛋白質氧化、糖氧化和脂質過氧化等氧化應激全過程，導致AD 患者及MCI 患者腦內氧化應激水平加劇[25-26]。AD 病理狀態下，ROS 急劇增加，抗氧化酶SOD 和GSH 活性顯著降低，氧化產物MDA 急劇增加，導致細胞線粒體能量轉化停止與通透性增加，加劇神經變性[27-28]。海馬是腦內學習與記憶功能調控的關鍵腦區，本研究基于AD 的上述病理機制，采用Aβ 蛋白海馬區注射構建了擬AD 小鼠模型。實驗研究表明，杞參益智方能夠上調動物海馬組織中SOD和GSH 活性，降低MDA 的表達。Nrf2 是細胞抗氧化防御系統的關鍵蛋白，對神經元氧化損傷的保護起著至關重要的作用。正常情況下，Nrf2 能夠增強抗氧化酶的表達，調節下游靶基因HO-1的表達，發揮抗氧化作用，而氧化應激下氧化還原平衡被破壞，Nrf2/HO-1信號通路被抑制，抗氧化因子和抗氧化酶表達下降，氧化劑表達升高，加劇炎癥反應，導致細胞凋亡[29]。本研究發現杞參益智方能夠上調Nrf2 與HO-1 表達，顯著改善模型小鼠海馬區氧化應激，表現出顯著的抗氧化效用。同時，杞參益智方還可抑制炎性因子的表達，減緩炎性應激。在氧化應激與炎性應激緩解的基礎上最終改善了模型動物海馬區細胞凋亡，增強了模型動物學習與記憶能力，體現了中藥復方多成分、多靶點、多通路的治療優勢。

中藥復方在防治AD 有豐富的經驗?，F代研究發現人參養榮湯能夠改善癡呆模型小鼠學習與記憶能力，調節乙酰膽堿酯酶活力，減輕海馬的損傷[30]。復方地黃能夠增強癡呆大鼠學習記憶能力，促進大鼠海馬神經營養因子的表達[31]。復方田七益智顆粒能夠改善癡呆模型動物膽堿能神經元損傷，從而改善其學習與記憶能力[32]。與這些復方相比，杞參益智方具有顯著的改善海馬區氧化應激與炎性應激的作用，并可顯著抑制海馬區細胞凋亡。杞參益智方在中醫“助氣固精，保鎮丹田”的經典方劑“二精丸”基礎上加味而成?！岸琛敝悬S精與枸杞子均為中醫添精填髓、滋補肝腎之要藥，與中醫理論中AD“腎精虧虛、髓海失養”的基本病機高度吻合。但腎精需得元氣資助，方能化生氣血濡養臟腑。人參大補元氣，不僅使氣血生化有源，還可推動氣血上榮于腦。黃精與枸杞子較為滋膩，年老之人本就脾腎功能漸衰，久服有礙脾之嫌，故輔以益智仁溫腎以助腎陽，暖脾以滋脾運，又取其芳香之氣，補而不滯。四藥相合，使腎精得充，氣血可化，神志可復。并且該方四味藥均為藥食同源的藥材，安全性好，是有利于防治AD的長期用藥。

杞參益智方中四味藥及其活性成分均有改善癡呆模型動物學習與記憶能力的現代報道。枸杞多糖可以改善APP/PS1小鼠的認知功能，減少淀粉樣病變，促進海馬神經發生，并改善小鼠受損的突觸的可塑性[33]。黃精中活性成分薯蕷皂苷元能夠顯著改善癡呆大鼠的空間學習記憶能力，對Aβ 引起的認知功能障礙具有顯著的保護作用，同時薯蕷皂苷元調節了模型大鼠氧化應激水平、降低了神經炎癥和乙酰膽堿酯酶水平，保護神經元免受損傷[34]。人參皂苷Re 能夠改善Klotho 基因缺陷小鼠認知障礙，調節模型小鼠體內氧化應激水平，降低活性氧的表達，通過上調Nrf2/GPX-1/ERK/CREB 信號通路，改善模型小鼠神經損傷[35]。益智仁不同極性提取物能夠調節癡呆動物膽堿能系統，改善其學習與記憶能力[36]。因此杞參益智方改善擬AD 模型小鼠學習與記憶能力可能是方中各成分共同作用的結果。

本研究通過構建Aβ1-42海馬區注射誘導AD 小鼠模型，評價了杞參益智方改善模型動物學習與記憶能力的效用并進行了初步的作用機制探討。后續將繼續探索杞參益智方改善AD 模型動物學習與記憶能力的功效物質基礎，并對其作用機制與效用機制進行深入研究，以期為杞參益智方防治AD 產品的開發提供更多的現代科學依據。