脂聯素對膿毒癥小鼠急性腎損傷的治療作用及機制

葉方雄，郭誠，萬雨涵，李威，袁進，洪茂林，楊定平

1 武漢大學人民醫院腎病內科，武漢 430060；2 鄂州市中醫醫院重癥醫學科；3 襄陽職業技術學院；4 鄂州市中醫醫院腦病科

膿毒癥是一種宿主對感染反應失調所致的臨床綜合征，以嚴重的全身炎癥和多器官功能障礙綜合征（MODS）為特點［1］。發生膿毒癥時，外源性毒素可刺激機體產生并釋放大量細胞因子和炎性介質，激發組織炎癥反應，引起包括腦、心臟、腎臟在內的多種臟器損傷，其中急性腎損傷（AKI）是最常見的并發癥［2-3］。脂聯素（APN）是一種脂肪細胞分泌的多聚性脂肪因子，能提高胰島素敏感性，具有抗炎、改善糖脂代謝、抑制動脈粥樣硬化及抗纖維化特性［4］。APN 濃度的降低與心肌梗死、冠心病、高血壓和其他代謝性心血管功能障礙有關［5］。近年研究表明，APN 在膿毒癥免疫應答及抗炎過程中發揮重要作用，膿毒癥患者APN 水平的下調與其嚴重程度呈負相關［6］。LIU 等［7］發現，APN 能通過激活AMPK/mTOR 通路減少肝細胞凋亡，對膿毒癥大鼠的肝損傷具有保護作用，但APN 對膿毒癥AKI 的影響鮮見報道。2021 年9 月—2022 年12 月，我們通過腹腔注射脂多糖（LPS）建立膿毒癥小鼠模型，觀察APN 在膿毒癥腎損傷小鼠中的治療作用，并探討其可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與試劑 雄性SPF 級C57BL/6 小鼠24 只，6～8 周齡，體質量22～25 g，由武漢大學人民醫院動物實驗中心提供，許可證編號SYXK（鄂）2015-0027。LPS 購自美國Sigma 公司；APN 購自美國PeproTech公司，超氧化物陰離子熒光探針（DHE）購自上海碧云天生物科技有限公司；BCA 蛋白濃度檢測試劑盒購自美國Thermo Fisher 公司；核苷酸結合寡聚域樣受體3（NLRP3）單克隆抗體、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Caspase）-1 單克隆抗體購自英國Abcam 公司；白細胞介素（IL）-1β 多克隆抗體、GADPH 單克隆抗體購自武漢三鷹生物技術有限公司；NLRP3、IL-1β 和腫瘤壞死因子（TNF）-α 引物由武漢塞維爾生物科技有限公司設計提供；全自動生化分析儀購自深圳雷杜生命科技有限公司。

1.2 動物模型及分組處理 采用隨機數字表法將小鼠分為空白對照組（CON 組）、模型組（LPS組）、實驗組（ LPS+APN 組）。按10 mg/kg 腹腔注射LPS 制備膿毒癥模型，CON 組腹腔注射等量0.9%氯化鈉注射液，實驗組在造模前8 h 按0.1 mg/kg 尾靜脈注射APN 進行干預。造模后24 h 處死小鼠，眼球取血2 mL，離心收集上清，－80 ℃冰箱中保存；縱切左側腎臟，置于4%多聚甲醛溶液中固定，右側腎臟用液氮速凍制作冰凍切片待用。

1.3 腎組織病理學評定 固定好的腎組織脫水，包埋于石蠟中，將組織切成3 μm 切片，行HE 染色，參照文獻［8］依據Paller 評分法進行腎小管損傷病理評分：形態正常為0分；腎小管擴張、細胞扁平、刷狀緣損傷為1 分；管腔脫落或壞死為1 分；上皮細胞核固縮、空泡狀或顆粒狀為1 分；刷狀緣脫落、腎小管管型為2分。

1.4 腎功能檢測 取小鼠血清，采用全自動生化分析儀檢測肌酐（Scr）和尿素氮（BUN）濃度，評估小鼠腎功能。

1.5 活性氧（ROS）檢測 采用超氧化物陰離子熒光探針（DHE）。用DSMO 溶解DHE 配制成染色探針工作液，清洗液清洗冰凍切片3 min，滴加染色探針工作液，37 ℃培養箱避光孵育40 min，裝載熒光探針完畢，移除染色液，并用PBS 洗滌切片3 次，加蓋玻片封片，以535 nm 作為激發波長，在熒光顯微鏡下觀察ROS的熒光強度，使用Image-Pro Plus 軟件對平均熒光強度進行量化分析。

1.6 NLRP3、IL-1β、TNF-α mRNA 表達檢測 采用RT-qPCR 法。TRIzol 試劑提取腎臟組織中的RNA，紫外分光光度計確定各組小鼠總RNA 濃度后逆轉錄為cDNA。用Mx3000P qPCR 系統在96 孔光學反應板上對NLRP3、IL-1β、TNF-α 和GAPDH 的mRNA表達進行定量分析。NLRP3 正向引物：5'-TAAGAACTGTCATAGGGTCAAAACG-3'，反向引物：5'-GTCTGGAAGAACAGGCAACATG-3'；IL-1β 正向引物：5'-AGGCTCCGAGATGAACAACAAA-3'，反向向引物：5' -GTGCCGTCTTTCATTACACAGGA-3'；TNF-α 正向引物：5'-CTCTTCTGTCTACTGAACTTCGGG-3'，反向引物：5'-GGTGGTTTGTGAGTGTGAGGGT-3'；GAPDH 正向引物：5'-CCTCGTCCCGTAGACAAAATG-3'，反向引物：5'-GTAACAGTCCGCCTAGAAGCAC-3'。qPCR 反應條件：95 ℃初始變性3 min、95 ℃變性30 s、60 ℃退火40 s、72 ℃延伸30 s，重復40個循環，最后75 ℃延伸8 min。以GAPDH作為內參基因，使用2-ΔΔCt法分析數據并計算基因的相對表達量。實驗重復3次，取平均值。

1.7 NLRP3、Caspase-1、IL-1β蛋白表達檢測 采用Western blotting 法。從腎組織勻漿中提取總蛋白，BCA 法測量蛋白質濃度。在上樣緩沖液中95 ℃加熱變性10 min，將蛋白質上樣至SDS-聚丙烯酰胺凝膠，電泳轉膜到PVDF 膜上。5%的脫脂奶粉封閉1 h，4 ℃下與NLRP3、Caspase-1、IL-1β、GAPDH 一抗孵育過夜。TBST 洗滌3 次，用辣根過氧化物酶標記的二抗孵育1 h，在化學發光儀中顯影觀察，采集圖像并用Image Lab軟件分析條帶灰度值，以目的蛋白灰度值/內參灰度值表示目的蛋白的相對表達量。

1.8 統計學方法 采用GraphPad Prism 8 統計軟件。符合正態分布的計量資料以±s表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較用LSD 檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠腎損傷比較 CON 組小鼠腎小球形態結構正常，毛細血管光滑通暢，腎小管上皮細胞完整；與CON 組相比，LPS 組小鼠腎臟可見腎小管擴張，上皮細胞核溶解壞死，刷狀緣損傷，腎小管出現細胞管型；與LPS 組相比，LPS+APN 組小鼠腎臟損傷明顯減輕。見圖1。與CON 組比較，LPS 組小鼠腎臟損傷評分、Scr 及BUN 水平升高（P＜0.05）；與LPS 組比較，LPS+APN 組腎臟損傷評分、Scr 及BUN水平下降（P＜0.05）。見表1。

表1 各組小鼠Paller評分、Scr、BUN比較（± s）

表1 各組小鼠Paller評分、Scr、BUN比較（± s）

注：與CON組比較，*P＜0.05；與LPS組比較，#P＜0.05。

組別CON組LPS組LPS+APN組BUN（mg/dL）19.22 ± 2.87 55.34 ± 9.25*41.97 ± 6.04*#n8 8 8 Paller評分（分）0.63 ± 0.52 7.62 ± 1.19*4.38 ± 0.92*#Scr（μmol/L）21.73 ± 5.43 116.70 ± 14.16*79.88 ± 10.63*#

圖1 各組小鼠腎臟病理學比較（HE染色，×400）

2.2 各組小鼠腎組織活性氧比較 CON 組、LPS組、LPS+APN 組ROS 相對熒光強度分別為1.00 ±0.00、26.67 ± 3.38、16.32 ± 2.51。LPS 組小鼠腎組織切片紅色熒光明顯強于對照組，LPS+APN組紅色熒光較對照組強，而比LPS 組弱（P＜0.05）。

2.3 各組小鼠腎組織NLRP3、IL-1β、TNF-α mRNA表達比較 與對照組比較，LPS 組NLRP3、IL-1β、TNF-α 的mRNA 表達明顯升高（P均＜0.05）；與LPS組比較，LPS+APN 組NLRP3、IL-1β、TNF-α 的mRNA表達明顯降低（P均＜0.05）。見表2。

表2 各組腎組織NLRP3、IL-1β和TNF-α mRNA相對表達量比較（± s）

表2 各組腎組織NLRP3、IL-1β和TNF-α mRNA相對表達量比較（± s）

注：與CON組比較，*P＜0.05；與LPS組比較，#P＜0.05。

組別CON組LPS組LPS+APN組TNF-α mRNA 1.01 ± 0.16 2.52 ± 0.49*1.52 ± 0.33*#n8 8 8 NLRP3 mRNA 1.04 ± 0.31 3.93 ± 0.74*1.86 ± 0.47*#IL-1β mRNA 1.01 ± 0.15 2.74 ± 0.50*1.43 ± 0.16*#

2.4 各組小鼠NLRP3、Caspase-1、IL-1β 蛋白表達比較 與對照組比較，LPS 誘導的膿毒癥小鼠腎組織NLRP3、Caspase-1 和IL-1β 蛋白表達明顯升高（P均＜0.05）；與模型組比較，APN 干預組小鼠腎臟NLRP3、Caspase-1和IL-1β蛋白表達明顯下降（P均＜0.05）。見表3。

表3 各組腎組織NLRP3、Caspase-1、IL-1β蛋白相對表達量比較（± s）

表3 各組腎組織NLRP3、Caspase-1、IL-1β蛋白相對表達量比較（± s）

注：與CON組比較，*P＜0.05；與LPS組比較，#P＜0.05。

組別CON組LPS組LPS+APN組IL-1β 0.49 ± 0.04 1.42 ± 0.16*0.92 ± 0.12*#n8 8 8 NLRP3 0.26 ± 0.06 1.15 ± 0.14*0.52 ± 0.07*#Caspase-1 0.12 ± 0.01 0.72 ± 0.11*0.45 ± 0.04*#

3 討論

膿毒癥是危重病患者死亡的主要原因之一，據統計，危重患者中AKI 的發病率高達60%，不低于40%的膿毒癥會出現包括AKI在內的多器官功能衰竭，膿毒癥相關急性腎損傷（SA-AKI）患者進展為慢性腎病的風險顯著增加［2，9］。近年來，隨著拯救膿毒癥運動的推廣和集束化治療的應用，膿毒癥病死率較前有所下降［10］。SA-AKI 的病理機制尚未完全清楚，目前普遍認為各種病原菌感染后導致全身性炎癥反應綜合征，大量炎癥因子和介質如TNF-α、IL-1等相互作用引起的“瀑布炎癥反應”是SA-AKI 發生的重要原因［11］。因此，抑制炎癥因子釋放及防止炎性介質的產生成為治療SA-AKI的關鍵。

APN 是一種具有內源活性的多肽，由4 個結構域組成并參與代謝和炎癥過程。APN 通過加速抗炎因子的分泌，減少炎性介質的產生和釋放，從而發揮抗炎作用，避免機體發生過度的免疫反應［12-13］。有研究表明，在盲腸結扎穿刺法建立的大鼠膿毒癥模型中，APN 能顯著降低血清TNF-α 等炎癥因子表達［7］。本研究結果顯示，LPS 小鼠腎組織病理評分高，腎小管上皮細胞損傷嚴重，腎功能指標Scr、BUN水平升高，炎性因子IL-1β 及TNF-α 的轉錄和分泌增加。相較于模型組，存在APN 干預的小鼠病理評分低，腎小管上皮細胞及毛細血管損傷減輕，Scr、BUN 下降，炎性因子的轉錄和分泌減少。說明APN對SA-AKI具有保護作用。

細胞焦亡是一種與炎癥相關的程序性細胞死亡，由Caspase 介導，分為依賴Caspase-1 介導的經典途徑和依賴Caspase-4/5/11 介導的非經典途徑［14］。NLRP3 炎癥小體由NLRP3、接頭蛋白ASC 和效應蛋白Caspase-1組成，是一種大分子蛋白復合體。最新研究發現，無論是經典途徑還是非經典途徑，NLRP3炎癥小體在細胞焦亡過程中均發揮重要調控作用［15］。膿毒癥發生時，細胞缺氧導致線粒體功能紊亂，產生釋放大量ROS，激活NLRP3，進而觸發細胞焦亡?；罨腘LRP3 招募ASC 和Caspase-1，形成NLRP3 炎癥小體復合物，ASC 通過切割無活性的Caspase-1 前體成為成熟的Caspase-1。成熟的Caspase-1 隨后催化IL-1β 和IL-18 前體剪切成熟，分泌到細胞外，啟動相應的信號級聯反應，并最終導致IL-1β、IL-18、TNF-α 等大量炎性介質釋放［16］。本研究中，相較于對照，LPS 小鼠腎組織活性氧含量升高，炎癥小體相關蛋白NLRP3、Caspase-1 表達增多，炎性因子IL-1β 的mRNA 及蛋白表達增加，與既往文獻報道一致。

在膿毒癥中，APN 與疾病的嚴重程度及預后相關，而外源性的APN 在抗氧化過程中發揮重要作用。張占琴等［17］研究表明，APN 能調節凋亡相關蛋白Caspase-3、Bax 及抗凋亡蛋白Bcl-2 表達，通過抑制線粒體損傷誘導的氧化應激保護小鼠的神經及認知功能，減輕膿毒癥小鼠腦損傷。亦有研究證實APN 通過調節AMPK、Akt和NF-κB 信號通路限制單核細胞微粒誘導的內皮細胞活化，而NF-κB 通路的活化，在NLRP3 經典信號通路的激活以及炎性因子IL-1β、TNF-α 的釋放過程中發揮關鍵作用［18］。本實驗結果顯示，在LPS 誘導的膿毒癥急性腎損傷小鼠的腎組織中，活性氧含量增加，炎性因子TNF-α分泌明顯增多；APN 干預后，膿毒癥小鼠腎組織活性氧的含量及TNF-α 表達明顯減少。說明APN 對膿毒癥急性損傷的保護作用與活性氧的調節及炎性介質的減少有關。

綜上所述，APN 可通過調控炎癥反應及細胞焦亡相關通路對SA-AKI起保護作用，其機制可能與降低腎組織氧化應激水平，抑制NLRP3 炎性小體的產生，減少TNF-α、IL-1β 等炎性因子的釋放有關。本研究為SA-AKI的治療提供了新思路，但仍存在以下不足：一是APN 調控氧化應激的分子機制尚不清楚；二是膿毒癥的發生由多種原因導致，本研究以LPS 誘導的膿毒癥為模型，存在一定局限性，這些在后期研究中有待進一步完善。