滑膜液中PI3K/AKT/mTOR信號軸介導巨噬細胞極化對膝骨關節炎促炎反應的作用

蔣 總,郭騰遜,姚曉玲,蘭維婭,唐 芳,馬武開,劉 佳

膝骨關節炎(knee osteoarthritis,KOA)是多種因素介導的炎癥性肌肉骨骼系統疾病,研究[1]表明滑膜炎與KOA密切相關,是KOA進展的主要因素,也可預測關節結構損傷。而巨噬細胞極化介導滑膜炎導致的滑膜肥大、增生和炎癥細胞浸潤是軟骨退變的關鍵因素,也是KOA的主要致病因素[2]。抑制巨噬細胞極化減輕滑膜炎可能是延緩KOA進展的關鍵因素。

巨噬細胞極化可分為M1、M2兩種,M1型巨噬細胞極化產生白細胞介素(interleukin,IL)-1、IL-6、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)等促進炎癥反應,而M2極化產生IL-4、IL-10等抑炎因子[3]。M1與M2型巨噬細胞比例失衡,特別是高表達M1型巨噬細胞極化介導的滑膜炎是導致KOA進展的主要因素之一,與KOA的嚴重程度顯著相關[4]。研究[5]報道通過調控PI3K/AKT/mTOR信號通路可抑制KOA的滑膜炎,保護關節軟骨。因此,該研究旨在通過收集KOA患者以及正常人的滑膜液,分析PI3K/AKT/mTOR信號通路與巨噬細胞極化的關系,為臨床防治KOA提供新見解。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1病例資料 本研究KOA的滑膜液樣本來自2022年12月—2023年1月就診于貴州中醫藥大學第二附屬醫院的女性患者[年齡50～70(59.5±7.0)歲]。KOA診斷由風濕病醫生根據KOA(ICD-10編碼:M17.0)的診斷標準進行診斷,選取經放射學檢查后根據Kellgren-Lawrence (KL)分級為Ⅱ級、Ⅲ級且有關節腔滑液的6名患者為KOA組。排除有其他自身免疫疾病相關的關節炎、代謝相關性關節炎、感染性關節炎、腫瘤相關關節炎、或近3個月有膝關節損傷病史的關節炎患者。同時通過年齡、身體質量指數(body mass index,BMI)匹配招募正常女性3人(50～70歲)為對照組。于關節腔內注射滅菌注射用水,充分混勻后抽取膝關節滑膜液,嚴格按照無菌原則在密閉環境中進行。本研究經貴州中醫藥大學第二附屬醫院醫學倫理委員會批準(批號:KYW2022020),所有受試者在參與研究前均簽署了書面知情同意書。

1.1.2主要材料與儀器 一抗胞內磷脂酰肌醇激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)、p-PI3K、蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)、p-AKT3、誘導性一氧化氮合酶(inducible nitric oxide,iONS)、山頭抗兔二抗(武漢愛博泰克生物科技有限公司,貨號:A0265、AP0854、A11016、AP0637、A3774、AS014);雷帕霉素靶蛋白C1(mammalian target of rapamycin C1,mTORC1)(美國CST,貨號:2983T);PE抗人-CD86、CD80、CD163、CD206(北京安諾倫生物科技有限公司,貨號:B357748、B332514、B357816、B358504);IL-1、IL-6、IL-10、TNF-α、轉化生長因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β) ELISA試劑盒(江蘇晶美生物科技有限公司,貨號:F0177-B、F0049-B、F0065-B、F0121-B、F1767-B);TRIzol(美國invitrogen,貨號:ab137872)RPMI-1640培養基(上海源培生物科技股份有限公司,貨號:L210KJ);RIPA裂解液、蛋白磷酸酶抑制劑、RNase and DNase AWAY(上海碧云天生物技術股份有限公司,貨號:P0013B、P1045、R0123);2×T5 Fast qPCR Mix(SYBR Green I)、GoldenstarTMRT6 cDNA Synthesis Kit Ver.2(北京擎科生物科技股份有限公司,貨號:TSE002、TSK302M)。精密恒溫培養箱(上海一恒科學儀器有限公司,型號:BPH-9042);蛋白電泳儀、蛋白濕轉儀、實時熒光定量PCR儀、水平電泳槽、核酸蛋白凝膠成像儀、曝光儀(美國Bio-Rad Laboratories公司,型號:Mini-Sub Cell GT、Mini Trans-Blot?Cell、IQ5、PowerPac Basic、Gel Doc XR+、732BR1158);酶標儀(美國Molecular Devices公司,型號:cMAXPlus)。

1.2 方法

1.2.1流式細胞檢測滑膜液中M1、M2型巨噬細胞標志物 將KOA患者和健康對照組新鮮的滑膜液用100目細胞篩過濾后收集細胞懸液,1 000 r/min離心5 min,收集重懸細胞加入RPMI 1640培養基懸浮后,加入15 ml淋巴分離液、重懸后細胞平鋪到分離液液面上方,收集交界面的巨噬細胞,加入5 μl巨噬細胞標記物(CD86、CD80、CD163、CD206),震蕩混勻、室溫下避光孵育20 min、加入1 ml PBS混勻,1 000 r/min離心5 min,同時設置空白對照,加入PBS重懸細胞后上流式細胞儀檢測。通過流式細胞術檢測結果,將所有滑膜液中M1陽性細胞的平均百分比(CD80、CD86)除以M2陽性細胞(CD163、CD206)的平均百分比計算M1/M2比率,以判定KOA滑膜液中巨噬細胞極化的類型。

1.2.2ELISA檢測滑膜液中IL-1、IL-6、IL-10、TNF-α、TGF-β表達 根據ELISA試劑盒說明書,室溫平衡試劑盒,稀釋標準品封板后置于37 ℃溫育30 min,取出封板膜后棄去液體,加滿洗滌液靜置30 s后棄去洗滌液,重復5次,加入酶標試劑,再次37 ℃溫育30 min,加入洗滌液清洗5次,加入顯色劑震蕩混勻,37 ℃避光顯色10 min后加入終止液,酶標儀中以450 nm波長依序測量各孔的吸光度。

1.2.3RT-PCR檢測PI3K、AKT3、mTORC1、iNOS mRNA的表達 PI3K、AKT3、mTORC1是PI3K/AKT/mTOR信號通路發生細胞轉錄、增殖的關鍵因子,iNOS是PI3K/AKT/mTOR信號通路的關鍵下游因子,通過RT-PCR檢測探索PI3K/AKT/mTOR信號通路在滑膜液中的機制。按照TRIzol試劑盒提取滑膜液中總的RNA,分光光度法計算各樣本中RNA的濃度和純度,按照試劑盒說明書進行反轉錄。在PCR儀中進行擴增,條件為95 ℃ 30 s,95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s,共40個循環進行擴增,通過2-△△CT法計算相對表達量,引物序列表見表1。

表1 引物序列表

1.2.4Western blot檢測PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT3、mTORC1、iNOS蛋白表達 將滑膜液裝入1.5 ml離心管中3 000 r/min離心5 min,洗滌2次后收集細胞,加入RIPA裂解液、蛋白磷酸酶酶抑制劑充分裂解細胞后13 000r/min離心20 min,進行電泳、轉膜(轉移時間根據蛋白分子量大小確定,1 kDa/min+30 min),封閉,加入1:1 000的一抗PI3K、p-PI3K、AKT3、p-AKT3、mTORC1、iNOS和GAPDH抗體4 ℃孵育過夜,沖洗3次后用加入1∶2 000 HRP標記的羊抗兔二抗室溫孵育1 h后放入曝光儀中曝光檢測,使用GAPDH作為內參,通過目標蛋白灰度值/內參總灰度值計算相對蛋白表達。

1.3 統計學處理數據以均數±標準差表示,符合正態分布且方差齊的兩組間比較使用t檢驗,否則用Mann-WhitneyU進行統計分析。所有統計資料使用SPSS 25.0進行統計分析,使用GraphPad Prism 9作圖軟件作圖,P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 人口學特征納入KOA的患者中KL分級Ⅱ級和Ⅲ級各3例,平均年齡為59.5歲,病程平均30.3個月,平均BMI為23.9。對照組中年齡平均為56.3歲,平均BMI為20.7。KOA患者與正常受試者在BMI、年齡上差異無統計學意義。見表2。

表2 研究人群的基本特征

2.2 不同滑膜液的鏡下特點KOA組滑膜液外觀呈淡黃色,稍渾濁,可見部分淋巴細胞(圖1A)。對照組為清亮、透明,未見明顯細胞浸潤(圖1B)。提示KOA患者滑膜液存在炎癥性改變。

圖1 兩組滑膜液的光學顯微鏡下圖

2.3 M1型巨噬細胞極化在KOA滑膜液中占主導作用通過流式細胞術檢測巨噬細胞M1(CD80、CD86)和M2(CD163、CD206)在KOA患者與對照組的滑膜液巨噬細胞的狀態發現,KOA滑膜液中CD80與CD86細胞陽性率增加(均Z=-2.353、-2.353,均P<0.001),而對照組中CD163與CD206細胞陽性率高于KOA組(圖2A)(均Z=-2.353、-2.353,均P<0.01)。與對照相比,KOA滑膜液樣品細胞中的M1/M2比值更高(t=35.756,P<0.001)(圖3)。提示在KOA中M1型巨噬細胞極化占有主導作用。

圖2 不同組別滑膜液中巨噬細胞標志物比較

圖3 兩組M1/M2比值的比較

2.4 不同組別滑膜液中細胞因子IL-1、IL-6、TNF-α、IL-10和TGF-β的濃度比較在ELISA選定的細胞因子面板中,KOA滑膜液中M1型巨噬細胞促炎因子IL-1、IL-6、TNF-α的表達明顯高于對照組細胞(t=-35.728、-17.679,Z=-2.353,均P<0.001)。與之相反,M2型巨噬細胞抑炎因子TGF-β和IL-10在KOA 滑膜液中低于對照組(t=214.452,Z=-2.353,均P<0.001)。見圖4。這說明M1巨噬細胞極化在KOA滑膜液的炎癥作用中起主要作用。

圖4 各組滑膜液中細胞因子濃度的比較

2.5 KOA滑膜液中PI3K/AKT/mTOR信號通路關鍵因子PI3K、AKT3、mTORC1 mRNA表達情況通過RT-PCR進行檢測發現PI3K、AKT3、mTORC1在KOA滑膜液中表達高于對照組(Z=-2.353、-2.353,t=4.869,均P<0.01),說明PI3K/AKT/mTOR信號通路在KOA滑膜液中被激活。PI3K/AKT/mTOR信號通路下游靶點因子iNOS在KOA滑膜液中表達也升高(t=7.360,P<0.01)。見圖5。說明PI3K/AKT/mTOR信號通路激活介導下游炎癥因子釋放可能是KOA滑膜液炎癥反應產生的主要原因。

圖5 PI3K/AKT/mTOR通路關鍵因子mRNA相對表達的比較

2.6 KOA滑膜液中PI3K、AKT3、mTOR和iNOS蛋白表達上調Western blot 檢測結果顯示,與對照組相比,KOA組滑膜液中PI3K/AKT/mTOR通路關鍵蛋白PI3K、p-PI3K、AKT3、p-AKT3、mTORC1均上調(Z=-2.364、-2.438,t=-6.177,Z=-2.438,t=-7.965,均P<0.01),通路下游iNOS蛋白表達也上調(t=-7.647,P<0.01)(圖6)。

圖6 兩組滑膜液中蛋白相對表達及條帶圖

3 討論

滑膜在維持關節軟骨內穩態方面起著重要作用,是關節功能正常的重要保障。隨著研究的深入,發現[6]滑膜炎伴隨KOA的整個過程,滑膜炎有可能是導致KOA發生的重要原因,滑膜炎產生的炎癥反應可以直接作用于關節軟骨,導致關節軟骨結構發生改變,加速關節退變的過程[6]。

巨噬細胞極化介導的滑膜炎導致滑膜增厚并伴有肥大和增生、血管密度增加、炎癥細胞浸潤(淋巴細胞和巨噬細胞)是KOA的共同特征[8]。早在2015年,Daghestani[9]使用顯像劑99mTc-EC20證明KOA患者體內滑膜巨噬細胞極化存在,且其數量與KOA的嚴重程度和影像學的改變密切相關,通過動物實驗也證明巨噬細胞極化可以促進骨關節炎的進展[10],表明巨噬細胞極化與KOA發病密切相關。李兵 等[11]通過關節內注射單碘乙酸溶液誘導OA大鼠模型發現,OA大鼠模型組M1/M2比值明顯升高,通過雙氯芬酸鈉干預促進M2巨噬細胞極化下調M1/M2有利于減輕OA大鼠的疼痛和軟骨退化。本研究發現M1型巨噬細胞極化在KOA中占有主要地位,M1/M2比值升高,M1型巨噬細胞極化標記物CD80、CD86陽性率增加,提示M1型巨噬細胞極化介導的滑膜炎很可能是導致KOA軟骨退變的主要因素。

PI3K/AKT/mTOR信號軸在細胞增殖與凋亡、轉錄和遷移過程中發揮關鍵作用,同時也是巨噬細胞極化的關鍵因子,活化后可抑制巨噬細胞向M1極化。P13K可被細胞因子、生長因子、激素等細胞外的各種信號激活[12],并與細胞內含有PH結構域的AKT和丙酮酸脫氫酶激酶1(phosphoinositide dependent kinase-1,PDK1)結合,促使PDK1磷酸化AKT蛋白從而導致AKT活化,磷酸化的AKT可激活mTOR,活化的mTORC1激活NF-κB誘導IL-1、IL-6、TNF-α、iNOS過表達,使滑膜產生炎癥并誘導M1型巨噬細胞極化,進一步使軟骨細胞損傷,導致關節軟骨退變及局部炎癥級聯反應從而導致KOA的發生[13]。其次,活化的mTORC1可促使部分炎癥因子如IL-1、IL-6、TNF-α、基質金屬蛋白酶作用于巨噬細胞促進M1型巨噬細胞極化,M1型巨噬細胞極化反過來可上調IL-1、IL-6、TNF-α的表達導致關節軟骨炎癥反應、軟骨破壞降解。最后,IL-1、IL-6、TNF-α等的表達會使PI3K/AKT/mTOR通路負向調控mTORC1產生大量的炎癥造成軟骨退變,軟骨中高表達的IL-1、IL-6反過來又會促進M1型巨噬細胞極化[14],使“PI3K/AKT/mTOR通路激活→M1型巨噬細胞極化→炎癥反應→PI3K/AKT/mTOR通路激活”始終處于一個循環反應中,最終導致KOA患者關節軟骨退變。本研究顯示KOA患者滑膜液中PI3K、AKT3和mTORC1表達升高且促炎因子IL-1、IL-6、TNF-α升高,提示PI3K/AKT/mTOR信號通路可能與KOA的滑膜液產生相關,并且可能與滑膜炎、巨噬細胞極化密切相關,這與之前的報道相一致[15]。提示PI3K/AKT/mTOR信號通路可能調控巨噬細胞極化參與OA的發病。

綜上所述,本研究表明,在KOA滑膜液中,M1型巨噬細胞極化占據主要地位,M1巨噬細胞極化介導的炎癥反應可能是滑膜炎產生的主要原因,同時PI3K/AKT/mTOR信號通路活化可能介導了M1型巨噬細胞極化參與KOA炎癥反應。今后的研究中,可以進一步探索是否可以通過阻斷PI3K/AKT/mTOR信號通路,抑制M1型巨噬細胞極化,從而減輕滑膜炎,達到治療KOA的目的。