lncRNA MALAT1通過調控miR-181a促進氧化應激模型中的心肌細胞損傷

鄭麗華,王思瑤,李 鵬

急性心肌梗死(acute myocardial infraction,AMI)是一種以持續嚴重的心肌缺血所引起的心肌壞死為特征的缺血性心臟病[1-2]。眾所周知,氧化應激在AMI的發生和進展中起著重要作用,其不僅能夠影響心肌細胞內鈣離子濃度,還能導致線粒體膜電位的降低和線粒體呼吸鏈的受損,進而導致細胞損傷甚至凋亡[3]。轉移相關肺腺癌轉錄物1(metastasis associated lung adenocarcinoma transcript 1,MALAT1)是一種長鏈非編碼RNA (long non-coding RNA,lncRNA),最初作為肺癌轉移的預后標志被發現[4]。研究[5-8]表明,MALAT1在多種腫瘤組織中高表達,并且可通過調控包括微小RNA-181a(microRNA-181a,miR-181a)在內的多種miRNAs參與腫瘤細胞增殖、凋亡、遷移、侵襲和擴散等生物學行為。此外,MALAT1可通過調控內皮細胞功能、血管生長和氧化應激反應,參與多種心臟疾病的發展[8-12]。因此,該研究旨在探究MALAT1在AMI患者中的表達,并通過建立心肌細胞的氧化應激模型進一步揭示MALAT1對心肌細胞損傷的具體保護機制,以期闡明MALAT1作為治療AMI生物靶點的潛在價值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1臨床樣本來源 收集2021年5月—2022年10月至新疆醫科大學第五附屬醫院心血管內科進行冠狀動脈造影術以評估胸痛的30例AMI患者和30例健康的體檢者的血清樣本。聯合使用胸前區疼痛、心電圖ST段改變、血清肌鈣蛋白Ⅰ含量以及冠狀動脈造影結果進行AMI診斷。納入標準為:① AMI組患者需符合AMI診斷標準;② 兩組患者臨床資料完整,且對本實驗研究方法及目的知情同意。排除標準:① 合并有嚴重感染、肝炎、肝衰竭、終末期腎病、心肌病、先天性心臟及免疫、代謝系統疾病者;② 合并腫瘤或惡性疾病史者;③ 72 h內接受抗凝或溶栓治療者;④ 未取得患者及其家屬知情同意者。抽取兩組人群肘靜脈血7 ml,1 500 r/min離心10 min后取上層血清,保存于-20 ℃下以備后續使用。本研究經新疆醫科大學第五附屬醫院醫學倫理委員會審批(審批號:XJYK2021-37),所有患者均簽署知情同意書。

1.1.2細胞系和主要試劑 人心肌細胞株AC16購自上海同科生物科技有限公司(貨號TK2074);DMEM培養基,青-鏈霉素混合液,胎牛血清(美國Gibco公司,貨號10704022、10335516、10403725);沉默MALAT表達的siRNA(si-MALAT)和陰性對照序列(si-NC),過表達或抑制miR-181a的miR-181a mimic和miR-181a inhibitor及其陰性對照序列miR-NC,野生型和突變型MALAT1片段(廣州銳博生物技術有限公司,貨號SIGS0010925-1、SIGS0016181-1、SIGS0017642-0、SIGW0026531-1、SIGW0026530-1);細胞計數試劑盒(cell counting kit-8,CCK-8)試劑盒(美國Abcam公司,貨號:ab214730);RNA提取試劑盒、過氧化氫(hydrogen peroxide,H2O2)、反轉錄試劑盒(北京天根生物科技有限公司,貨號:DP209、DP015、DP1129);Lipofectamine 2000試劑(美國Invitrogen公司,貨號:A24019);二喹啉甲酸(bicinchoninic acid assay,BCA)蛋白檢測試劑盒,DAPI試劑,蛋白酶抑制劑和RIPA緩沖液(上海碧云天生物技術有限公司,貨號:C11573、C01824、C11206、C13739);兔抗B細胞淋巴瘤/白血病-2(B-cell lymphoma 2,Bcl-2),抗Bcl-2相關X蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax),抗裂解型半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(cleaved caspase-3)和GAPDH抗體(武漢三鷹生物技術有限公司,貨號:10119-1-AP、24197-1-AP、02197-1-AP、21495-1-AP)。HRP標記的山羊抗兔IgG,SYBR-Green qRT-PCR試劑盒,增強型ECL試劑盒(北京索萊寶科技有限公司,貨號:P805、P316、P720);Triton X-100試劑(北京雅安達生物技術有限公司,貨號:9002-93-1);TUNEL試劑盒(瑞士Roche公司,貨號:900127); pmirGLO質粒,熒光素酶報告系統(美國Promega公司,貨號:E2269、G7901)。

1.1.3主要儀器 超凈工作臺(美國Thermo公司,型號:51029704);凝膠電泳儀、qRT-PCR儀(美國Bio-Rad公司,型號:X005-1、IO5);流式細胞儀FACS-Calibur (美國BD公司,型號:FACSC-Ⅱ);分光光度計(上海儀電分析儀器有限公司,型號:752N);熒光顯微鏡(日本Olympus公司,型號:CZ51)

1.2 方法

1.2.1細胞培養和處理 使用含10%胎牛血清和1%青-鏈霉素的DMEM培養基在37 ℃、5%CO2的培養箱中培養AC16細胞。采用H2O2處理AC16細胞建立心肌細胞氧化應激模型。使用不同濃度(0、50、150和200 μmol/L)的H2O2處理AC16細胞12 h以篩選最佳處理濃度。采用篩選出的最佳處理濃度(200 μmol/L)的H2O2處理AC16細胞0、4、8和12 h以篩選最佳處理時間。

1.2.2細胞轉染和分組 取生長狀態良好的AC16細胞分為:正常培養的對照(ctl)組,H2O2處理AC16細胞(H2O2組),H2O2處理轉染si-NC或si-MALAT細胞的H2O2+si-NC組和H2O2+si-MALAT組,H2O2處理si-MALAT和 miR-NC共轉染的H2O2+si-MALAT+miR-NC組,H2O2處理si-MALAT和miR-181a inhibitor共轉染的H2O2+si-MALAT+miR-181a inhibitor組。將si-MALAT或miR-181a inhibitor及其相應的陰性對照序列參考Lipofectamine 2000試劑說明書轉染入細胞中,轉染24 h后,用200 μmol/L的H2O2處理AC16細胞12 h,隨后進行后續檢測。

1.2.3qRT-PCR檢測MALAT和miR-181a的表達水平 按照RNA提取試劑盒說明書方法提取兩組患者血清和上述各組AC16細胞中的總RNA。采用分光光度計在260/280 nm處檢測提取的RNA的濃度與純度。使用反轉錄試劑盒將上述RNA逆轉錄為cDNA,再采用SYBR-Green試劑盒進行qRT-PCR反應。以GAPDH或U6為內參,2-ΔΔCT方法計算待測細胞中MALAT和miR-181a的表達。本研究中使用的引物序列如表1所示。

表1 RT-PCR引物序列

1.2.4熒光素酶基因報告實驗 使用lncBase在線預測數據庫(http://diana.imis.athena-innovation.gr/DianaTools/index.php?r=lncBase/index)預測MALAT1與miR-181a之間可能的結合位點。為探究MALAT1與miR-181a之間的相關性,將野生型和突變型MALAT1片段分別插入pmirGLO質粒的Nhe I和Sal I之間,簡稱MALAT1-WT和MALAT1-MUT,并將其與miR-181a mimic或miR-NC共轉染入AC16細胞。轉染48 h后裂解細胞,用熒光素酶報告分析系統檢測各組AC16細胞中熒光素酶活性。

1.2.5CCK-8法檢測細胞增殖活力 取各組AC16細胞,按2×104/孔接種至96孔板中,置于37 ℃、5%CO2的培養箱孵育24 h后,每孔加入10 μl的CCK-8試劑,繼續孵育4 h后,在分光光度計450 nm處測定每孔吸光度值。

1.2.6TUNEL法檢測細胞凋亡 取各組AC16細胞,采用0.1% Triton X-100透化細胞載玻片,按照TUNEL試劑盒說明書方法加入TUNEL試劑,37 ℃避光孵育30 min后加入DAPI試劑染核,再次避光孵育5 min后,在熒光顯微鏡下進行觀察,并在高倍視野下拍照。TUNEL陽性細胞率=TUNEL染色陽性數/細胞總數×100%。

1.2.7Western blot實驗檢測凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax和cleaved caspase-3的表達 取各組AC16細胞,采用蛋白酶抑制劑和RIPA緩沖液提取細胞內總蛋白。BCA蛋白檢測試劑盒檢測蛋白濃度。利用SDS-PAGE將蛋白樣品進行分離后轉移至聚偏二氟乙烯膜上。5%脫脂奶粉阻斷抗體后加入稀釋后的一抗,具體為:Bcl-2(1∶2 000),Bax(1∶2 000),cleaved caspase 3 (1∶1 000)和GAPDH(1∶5 000),4 ℃孵育過夜后,加入HRP標記的山羊抗兔IgG(1∶10 000)作為二抗,室溫下孵育2 h。最后采用增強型ECL試劑盒在凝膠成像系統中進行顯影,ImageJ軟件分析條帶灰度值。

1.3 統計學處理采用GraphPad Prism 7.0軟件進行統計分析。所有數據均以均數±標準差表示。兩組間比較使用獨立樣本t檢驗,多組間比較采用單因素方差分析,各組間比較采用LSD-t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 MALAT1與miR-181a在兩組受試者中的表達情況及相關性分析AMI組平均年齡(55.10±4.22)歲,男/女=19/11;Normal組的平均年齡(56.24±3.59)歲,男/女=20/10。兩組患者在年齡和性別比例方面的差異均無統計學意義(t=2.46、3.52,P=0.55、0.71)。qRT-PCR檢測結果顯示,與Normal組相比,MALAT1在AMI組患者外周血樣本中的表達水平升高(t=33.57,P=0.019),而miR-181a的表達水平降低(t=22.68,P=0.036)(圖1A、B)。相關分析的結果顯示,在AMI患者外周血樣本中MALAT1表達和miR-181a表達呈負相關(r=-0.605,P<0.01)(圖1C)。上述結果表明,MALAT1和miR-181a可能參與AMI的發病機制。

圖1 兩組受試者中MALAT1與miR-181a表達水平的比較以及AMI患者MALAT1與miR-181a的相關系分析

2.2 H2O2對心肌細胞中MALAT1和miR-181a表達的影響qRT-PCR檢測結果顯示,與0 μmol/L組相比,在不同濃度H2O2處理下,AC16細胞中MALAT1的表達水平明顯升高,且呈濃度和時間依賴性(F=73.09,P<0.05),且當以200 μmol/L H2O2處理AC16細胞時,MALAT1表達水平呈升高趨勢(F=63.29,P<0.05)(圖2A、B)。而AC16細胞中miR-181a的表達水平則隨著H2O2處理濃度與時間的增加呈降低趨勢(F=55.60,P<0.05)(圖2C、D)。

圖2 不同濃度H2O2處理以及200 μmmol/L不同時間H2O2處理下心肌細胞中MALAT1和miR-181a表達

2.3 MALAT1靶向調控miR-181a表達lncBase在線預測數據庫預測顯示,MALAT1與miR-181a之間存在潛在結合位點(圖3A)。雙熒光素酶基因報告實驗結果顯示,與共轉染miR-NC和MALAT1-WT的AC16細胞相比,共轉染miR-181a mimic和MALAT1-WT的細胞中熒光素酶活性降低(LSD-t=3.41,P<0.05);而轉染MALAT1-MUT后,共轉

圖3 MALAT1靶向調控miR-181a表達的分析和各組AC16細胞中MALAT1與miR-181a的比較

染miR-NC或miR-181a mimic的細胞中熒光素酶活性差異均無統計學意義(LSD-t=1.67,P>0.05)(圖3B)。qRT-PCR檢測結果顯示,與ctl組相比,H2O2組、H2O2+si-NC組和H2O2+si-MALAT1組中MALAT1表達均升高(LSD-t=44.59、27.31、30.15,P<0.05),而miR-181a表達均降低(LSD-t=11.26、19.83、10.34,P<0.05);與H2O2組相比,H2O2+si-MALAT1組中MALAT1表達降低(LSD-t=38.60,P<0.05),miR-181a表達升高(LSD-t=71.25,P<0.05),而H2O2+si-NC組中MALAT1與miR-181a表達均無明顯改變(LSD-t=1.29、2.25,P>0.05)(圖3C、D)。上述實驗結果表明,在心肌細胞中MALAT1可靶向調控miR-181a表達。

2.4 下調MALAT1對H2O2誘導的心肌細胞損傷的影響CCK-8法檢測結果顯示,與ctl組相比,H2O2組、H2O2+si-NC組和H2O2+si-MALAT1組中AC16細胞的細胞活力均降低(LSD-t=36.71、27.35、7.29,均P<0.05);與H2O2組相比,H2O2+si-MALAT1組細胞活力升高(LSD-t=6.74,P<0.05),而H2O2+si-NC組無明顯改變(LSD-t=0.52,P>0.05)(圖4)。TUNEL染色結果顯示,與ctl組相比,H2O2組、H2O2+si-NC組和H2O2+si-MALAT1組中AC16細胞的TUNEL陽性率均增加(LSD-t=20.12、17.48、44.10,P<0.05);與H2O2組相比,H2O2+si-MALAT1組的TUNEL陽性率降低(LSD-t=13.19,P<0.05),H2O2+si-NC組無明顯改變(LSD-t=2.17,P>0.05)(圖5);Western blot檢測結果顯示,與ctl組相比,H2O2組、H2O2+si-NC組和H2O2+si-MALAT1組AC16細胞中促凋亡蛋白cleaved caspase-3和Bax表達水平均升高(LSD-t=38.64、20.41、41.73、22.10、10.52、14.23,P<0.05),凋亡抑制蛋白Bcl-2的表達水平降低(LSD-t=13.14、13.49、7.59,P<0.05);與H2O2組相比,H2O2+si-MALAT1組中cleaved caspase-3和Bax蛋白表達水平降低(LSD-t=26.05、19.41,P<0.05),而Bcl-2的蛋白表達水平升高(LSD-t=15.22,P<0.05),H2O2+si-NC組中上述蛋白表達均無明顯改變(LSD-t=1.17、0.62、2.58,P>0.05)(圖6)。上述結果提示沉默MALAT1可以部分逆轉H2O2作用下的心肌細胞損傷。

圖4 各組心肌細胞的增殖活力的比較

圖5 各組心肌細胞凋亡的比較 ×400

圖6 各組細胞中凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax和cleaved caspase-3蛋白表達水平的比較

2.5 抑制miR-181a表達對下調MALAT1在H2O2誘導的心肌細胞損傷中的作用與ctl組相比,轉染miR-181a inhibitor的AC16細胞中miR-181a的表達水平降低(LSD-t=16.49,P<0.01),而轉染miR-NC的細胞中miR-181a的表達水平差異無統計學意義(LSD-t=2.10,P>0.05)(圖7A)。與ctl組相比,H2O2組、H2O2+si-MALAT1組、H2O2+si-MALAT1+miR-NC組和H2O2+si-MALAT1+miR-181a inhibitor組中的AC16細胞活力均降低

圖7 抑制miR-181a表達對各組心肌細胞增殖活力的影響

圖8 抑制miR-181a表達對各組心肌細胞凋亡的影響 ×400

(LSD-t=19.11、8.64、7.94、20.73,P<0.05),而TUNEL陽性率均升高(LSD-t=19.30、9.12、8.26、17.18,P<0.05);與H2O2組相比,H2O2+si-MALAT1組和H2O2+si-MALAT1+miR-NC組中細胞活力升高(LSD-t=8.64、8.43,P<0.05),TUNEL陽性率降低(LSD-t=7.72、8.10,P<0.05),H2O2+si-MALAT1+miR-181a inhibitor組差異無統計學意義(LSD-t=2.27、1.28,P>0.05);與H2O2+si-MALAT1組相比,H2O2+si-MALAT1+miR-181a inhibitor組細胞活力降低(LSD-t=9.84,P<0.05),TUNEL陽性率升高(LSD-t=10.36,P<0.05),H2O2+si-MALAT1+miR-NC組差異無統計學意義(LSD-t=1.15、0.29,均P>0.05)(圖7B、8);與ctl組相比,H2O2組、H2O2+si-MALAT1組、H2O2+si-MALAT1+miR-NC組和H2O2+si-MALAT1+miR-181a inhibitor組細胞中cleaved caspase-3和Bax蛋白表達水平均升高(LSD-t=13.04、8.51、9.60、12.46、12.25、7.14、7.19、12.90,均P<0.05),Bcl-2的表達水平降低(LSD-t=12.16、7.24、8.72、13.29,均P<0.05);與H2O2組相比,H2O2+si-MALAT1組,H2O2+si-MALAT1+miR-NC組中cleaved caspase-3和Bax表達水平降低(LSD-t=8.23、9.28、8.09、8.94,均P<0.05),Bcl-2的表達水平升高(LSD-t=10.71、11.05,P<0.05),而H2O2+si-MALAT1+miR-181a inhibitor組中上述蛋白表達均無明顯改變;與H2O2+si-MALAT1組相比,H2O2+si-MALAT1+miR-181a inhibitor組細胞cleaved caspase-3和Bax蛋白表達水平升高(LSD-t=47.56、62.05,P<0.05),Bcl-2的表達水平降低(LSD-t=15.21,P<0.05),H2O2+si-MALAT1+miR-NC組無明顯改變(圖9)。上述結果提示沉默MALAT1可通過促進細胞中miR-181a表達從而降低H2O2對心肌細胞的損傷作用。

3 討論

本研究通過體內外實驗探討MALAT1在AMI中的作用及相關分子機制,結果表明,與正常對照人群相比,MALAT1在AMI患者中的表達上調。miR-181a在癌癥的發生中具有重要作用[13]。研究[14]表明,miR-181a可通過激活蛋白激酶B,促進其下游蛋白內皮型一氧化氮合酶的磷酸化,從而抑制心肌細胞凋亡,緩解缺血再灌注誘導的心肌細胞損傷。這表明miR-181a可能參與心肌梗死的發生。在本研究中結果顯示,與正常對照人群相比,AMI患者中miR-181a的表達降低,且在AMI患者中,MALAT1與miR-181a表達水平呈負相關。在胃癌中的研究[7]顯示 MALAT1可負向調控miR-181a-5p表達參與腫瘤的發生與進展。這提示,在AMI的發病中MALAT1也可能通過調控miR-181a參與心肌細胞的損傷。研究[1]表明,氧化應激是AMI后心肌損傷的重要原因。當發生心肌缺血時,細胞內產生大量的自由基,從而使心肌細胞產生氧化應激,導致細胞受損。因此,本研究利用H2O2建立心肌細胞氧化應激模型進行探究,結果顯示,MALAT1在H2O2刺激下的AC16細胞中高表達,而miR-181a表達下調。這進一步提示MALAT1和miR-181a可能參與心肌細胞損傷。本研究生物信息學軟件預測也顯示miR-181a與MALAT1的3＇UTR區存在結合位點,雙熒光素酶基因報告實驗進一步驗證了它們之間的相互作用關系。此外,qRT-PCR實驗結果也表明MALAT1可負向調控miR-181a的表達。這證明MALAT1可與miR-181a相互作用來參與心肌細胞損傷。

心肌細胞凋亡是AMI的重要病理特征,故降低心肌細胞的凋亡水平是治療心肌細胞損傷的重點[15]。本研究結果表明,下調MALAT1表達可抑制心肌細胞的凋亡,并降低促凋亡蛋白cleaved caspase-3和Bax的表達水平,而促進凋亡抑制蛋白Bcl-2的表達。功能挽救實驗結果表明,抑制miR-181a表達可抵消下調MALAT1對心肌細胞的保護作用,促進凋亡蛋白cleaved caspase-3和Bax的表達,抑制Bcl-2的表達。這一結果顯示,MALAT1對心肌細胞凋亡的影響是由miR-181a介導的。進一步證明MALAT1與miR-181a相互作用共同參與心肌細胞損傷。

綜上所述,本研究表明,MALAT1/miR-181a軸在調節心肌細胞損傷中具有重要作用。MALAT1基因敲除可能通過促進miR-181a表達而減輕心肌細胞損傷,提示MALAT1可能是AMI后心肌細胞損傷的潛在靶點。然而,本研究患者規模有限,大多數機制研究是在H2O2誘導的細胞中建立的。后期仍需在大規模的患者樣本中來證實MALAT1/miR-181a軸的作用,且需在動物模型中驗證其作為AMI的治療靶點的潛力。