去泛素化酶OTUB2通過誘導DDX54活性增加中性粒細胞外誘捕網的形成以及促進結直腸癌細胞活力和侵襲能力

蔣良君,李 衛

結直腸癌(colorectal cancer,CRC)又稱大腸癌,是一種起源于大腸上皮組織的惡性腫瘤,其發病率逐年上升,明確結腸癌的發病機制對于該疾病的診斷和治療具有重要意義[1]。中性粒細胞胞外誘捕網(neutrophil extracellular traps,NETs)是一種由脫聚染色質和顆粒蛋白組成的細胞外網狀結構,由活化的中性粒細胞在特定的刺激下產生并釋放,NETs在先天性免疫和癌癥轉移中起著重要作用[2]。含OTU結構域的泛素醛結合蛋白2 (OTU deubiquitinase,ubiquitin aldehyde binding 2,OTUB2)是一種去泛素化酶,也被證明是一種致癌因子,研究[3]顯示OTUB2在胃癌組織和細胞中高表達,過表達OTUB2促進胃癌細胞增殖、遷移和侵襲。OTUB2可通過抑制丙酮酸激酶M2型同工酶的泛素化誘導癌細胞糖酵解進而促進CRC進展[4]。此外,研究[5]表明RNA解螺旋酶54(DEAD-box helicase 54,DDX54)在CRC組織中高表達,與腫瘤的生長和不良預后有關。然而關于OTUB2調控DDX54在CRC中的作用和相關的分子機制仍不明確。該研究旨在探討去泛素化酶OTUB2調控DDX54 對NETs的形成和CRC細胞活力、侵襲的影響。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器人CRC細胞系(HCT116、SW480、DLD-1)和人正常結腸上皮細胞(NCM460)(武漢尚恩生物技術有限公司,貨號:SNL-077、SNL-074、SNL-076、SNL-519);OTUB2野生型SW480細胞(OTUB2-WT)以及OTUB2敲除SW480細胞(OTUB2-KO)購自南京金斯瑞生物科技有限公司;DMEM培養基(美國Gibco公司,貨號:12634010);佛波酯(phorbol-12-myristate-13-acetate,PMA)(美國MedChem Express公司,貨號:HY-18739);脫氧核糖核酸酶Ⅰ(DNase Ⅰ)、谷胱甘肽S-轉移酶(glutathione s-transferase,GST)抗體和組氨酸(histidine,His)抗體(美國Sigma公司,貨號:D21962、G6511、GT359);vector、OTUB2過表達質粒、si-OTUB2、si-DDX45及相應的陰性對照(廣州銳博生物科技有限公司);二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)(北京索萊寶科技有限公司,貨號:D8372);胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)、Lipofectamine 3000試劑、TRIzol試劑、蛋白質A/G瓊脂糖珠(美國Thermo Fisher Scientific公司,貨號:A5669701、L3000075、15596018、78609);人外周血中性粒細胞分離試劑盒(北京索萊寶科技有限公司,貨號:P9040);ELISA試劑盒:白細胞介素-8(Interleukin-8,IL-8)(貨號:ab214030)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-alpha,TNF-α)(貨號:ab181421)、一抗:MPO(貨號:ab208670)、Cit-H3(貨號:ab219407)、OTUB2(貨號:ab74371)、抗泛素抗體(ab7780)、DDX54(貨號:ab76947),二抗:HRP標記的山羊抗兔IgG(貨號:ab6721)均購自英國Abcam公司;髓過氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)-DNA復合物ELISA試劑盒(上海仁捷生物科技有限公司,貨號:RJ23716);瓜氨酸組蛋白H3(citrullinated histone H3,Cit-H3)ELISA試劑盒(武漢紐萊生物科技有限公司,貨號:NLH7890);Transwell小室(美國康寧公司,貨號:3412);MTT溶液、結晶紫染色液、RIPA裂解液、BCA蛋白定量試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司,貨號:C0009S、C0121、P0013B、P0009);聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(美國Millipore公司,貨號:HVLP02500);ECL試劑盒(美國Bio-Rad公司,貨號:1705061);HiScript Ⅱ Q RT SuperMix、SYBR Green qPCR Master試劑盒(南京諾唯贊生物科技股份有限公司,貨號:R232-01、Q111-02); 大腸埃希菌BL21(上海澤葉生物科技有限公司,貨號:ZY-12-174Y);HisTrap HP層析柱(上海桂寧實驗器材有限公司,貨號:17-5247-01)、谷胱甘肽-瓊脂糖4B層析柱(上海信裕生物科技有限公司,貨號:XY90421);Illumina測序儀(美國Illumina公司,型號:MiSeq);實時熒光定量PCR儀(瑞士Roche公司,型號:LightCycler 96);酶標儀(德國BioTek公司,型號:Cytation 5);熒光顯微鏡(德國Carl Zeiss公司,型號:Axio Imager 2);紅外成像系統 (美國LI-COR公司,型號:Odyssey);紫外可見分光光度計(美國Thermo Fisher Scientific公司,型號:Nanodrop 2000)。

1.2 方法

1.2.1臨床樣本收集 收集2021年4月—2022年1月期間在南華大學衡陽醫學院附屬南華醫院接受手術治療的CRC患者的癌組織與癌旁組織(距離癌組織3 cm),共61例。納入標準如下:① 病理活檢診斷為CRC的患者;② 初次被診斷為CRC且之前未患過其他癌癥;③ 術前未接受過手術切除、放化療等任何形式的治療。排除標準:①合并有肝、腎、心臟等嚴重器質性疾病的患者;② 臨床資料不完整的患者。所有患者均簽署書面知情同意書且本研究經過南華大學衡陽醫學院附屬南華醫院醫學倫理委員會備案(批號:NHYY2021a025)。標本放置在-80 ℃條件下保存。

1.2.2中性粒細胞分離和NETs誘導 收集CRC患者的外周血樣本,使用外周血中性粒細胞提取試劑盒分離外周血中性粒細胞,分離的原代中性粒細胞在含10%FBS的RPMI-1640培養基中培養。將中性粒細胞分為對照組(中性粒細胞不做任何處理)、PMA組(中性粒細胞加入10 mmol/L NETs釋放激活劑PMA)、PMA+DNase Ⅰ組(中性粒細胞被PMA處理后加入100 U/ml NETs抑制劑)。首先將外周血中分離的中性粒細胞(密度1×106)接種于24孔板中黏附1 h。PMA組加入100 nmol/L的PMA刺激4 h,PMA+DNase Ⅰ組在加入PMA的同時加入100 U/ml的DNase Ⅰ。各組細胞上清液用于ELISA檢測。收集PMA組中含有NETs的上清液,在4 ℃下以10 000 r/min的轉速離心10 min,再以40 000 r/min的轉速離心20 min以得到純化的NETs,儲存在-80 ℃下以備后續實驗。

1.2.3CRC細胞培養 人CRC細胞系(HCT116、SW480、DLD-1)和人正常結腸上皮細胞(NCM460)在DMEM培養基(添加有10%FBS和1%青-鏈霉素)中培養,并置于37 ℃、5%CO2加濕的培養箱中培養48 h。

1.2.4CRC細胞轉染和分組 將SW480細胞接種于24孔板中,在37 ℃下培養過夜。使用Lipofectamine 3000試劑將OTUB2過表達質粒及其陰性對照vector和siRNA(si-OTUB2、si-DDX54)及對應的陰性對照(si-NC)轉染至SW480細胞。轉染48 h后,使用qRT-PCR法檢測轉染效率并用于后續研究。使用Transwell共培養系統將中性粒細胞和CRC細胞共培養,中性粒細胞接種于Transwell下腔,SW480細胞接種于Transwell上腔,具體細胞分組如下:對照組、NETs組、vector組、OTUB2組、OTUB2+DNase Ⅰ組、si-OTUB2組、NETs+si-OTUB2組、OTUB2+si-NC組和OTUB2+si-DDX54組。對照組SW480細胞不做任何處理,NETs組、NETs+si-OTUB2組(分別使用SW480細胞、轉染了si-OTUB2的SW480細胞與PMA處理的中性粒細胞共培養),vector組、OTUB2組、si-OTUB2組、OTUB2+si-NC組、OTUB2+si-DDX54組(分別與轉染了vector、OTUB2過表達質粒、si-OTUB2、OTUB2過表達質粒和si-NC、OTUB2過表達質粒和si-DDX54的SW480細胞與中性粒細胞共培養),OTUB2+DNase Ⅰ組(轉染了OTUB2過表達質粒的SW480細胞與DNase Ⅰ處理的中性粒細胞共培養)。

1.2.5ELISA檢測IL-8、TNF-α、MPO-DNA復合物水平和Cit-H3濃度 收集健康對照組和CRC患者血清樣本,根據ELISA試劑盒說明中的要求檢測IL-8和TNF-α的濃度;收集與NETs共培養后的SW480細胞,1 000 r/min離心5 min后取上清液。使用ELISA試劑盒檢測上清液中MPO-DNA復合物相對表達量和Cit-H3濃度。

1.2.6Western blot檢測蛋白表達 RIPA裂解液提取各組SW480細胞總蛋白,BCA法測定蛋白濃度,行SDS-PAGE凝膠電泳并轉膜后,使用5% BSA將轉移后的膜封閉2 h,并與一抗:抗MPO(1∶1 000)、抗Cit-H3(1∶1 000)、抗OTUB2(1∶1 000)和抗DDX54(1∶2 000)在 4 ℃ 下孵育過夜,然后與HRP標記的二抗(1∶2 000)在室溫下孵育1 h。TBST 溶液洗膜 3次,ECL顯色,ImageJ軟件對蛋白條帶進行定量。

1.2.7MTT檢測細胞活力 將各組對數生長期的SW480細胞接種于96孔板(2×103)中孵育過夜,之后按照MTT試劑盒說明書要求對各組細胞活力進行檢測。細胞活力(%)=(待測樣品吸光度值﹣背景吸光度值)/(對照樣品吸光度值﹣背景吸光度值)×100%。

1.2.8Transwell檢測細胞侵襲 已轉染的SW480細胞胰酶消化后,重懸于無血清的培養基中,調整細胞密度為1×105個/ml。Transwell小室(孔徑8 μm)的上室預包埋有基質膠,然后向上室中加入各組細胞,下室中加入600 μl含10%FBS的培養基。孵育24 h后,取出Transwell膜,用棉簽擦去未侵入的細胞,4%多聚甲醛固定,結晶紫染色后顯微鏡下觀察染色結果。

1.2.9qRT-PCR檢測mRNA表達 使用TRIzol試劑分別提取各組SW480細胞和CRC患者癌組織和癌旁組織中的RNA,Nanodrop 2000分光光度計測量總RNA的濃度和純度。跟據HiScript Ⅱ Q RT Super Mix的說明將總RNA逆轉錄為cDNA,然后通過SYBR Green qPCR Master試劑盒在Light Cycler 96實時熒光定量PCR儀上進行PCR擴增。GAPDH作為內參,具體引物序列見表1。

表1 引物序列表

1.2.10生物信息學分析 UALCAN數據庫(http://ualcan.path.uab.edu)用于分析OTUB2和DDX54在CRC中的表達。StarBase數據庫(https://starbase.sysu.edu.cn)用于預測OTUB2的結合蛋白。采用韋恩圖在線工具(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)取RNA測序得到的敲減OTUB2后SW480細胞中的差異表達基因以及OTUB2的結合蛋白的交集。Timer數據庫(https://cistrome.shinyapps.io/timer/)預測OTUB2表達和中性粒細胞的相關性。

1.2.11RNA測序 在人CRC細胞SW480細胞中轉染si-OTUB2,從細胞中分離RNA,DNase Ⅰ處理總RNA,紫外分光光度計檢測RNA的質量;將純化后的RNA進行rRNA去除、片段化并且合成cDNA、修復cDNA末端、連接接頭后構建測序樣本文庫;通過RNA測序測定敲減OTUB2后SW480細胞中的所有差異表達基因。依據cBot用戶指南指示的流程,在Illumina測序儀的cBot上生成Cluster和測序引物雜交,準備測序試劑并將含cluster的flow cell上機并對數據進行實時分析。差異因子篩選條件為P<0.05且差異倍數≥1。

1.2.12免疫共沉淀(co-immunoprecipitation,Co-IP)反應和Western blot實驗 Co-IP實驗用于驗證OTUB2和DDX54的相互作用。收集SW480細胞,將細胞使用裂解緩沖液裂解、胰蛋白酶消化后加入OTUB2(1∶1 000)、DDX54抗體(1∶2 000)和山羊抗兔IgG(1∶2 000)抗體在4 ℃下孵育4 h,之后加入蛋白質A/G瓊脂糖珠捕捉抗原抗體復合物,收集沉淀后的蛋白行Western blot檢測。Co-IP檢測OTUB2對DDX54的泛素化修飾時,首先對OTUB2-WT和OTUB2-KO細胞進行裂解,之后向上清中加入抗泛素抗體(HA-Ubi)(1∶1 000)、HA-Ub-DDX54,將抗體與蛋白質A/G瓊脂糖珠結合,使用緩沖液洗滌后行Western blot檢測。

1.2.13蛋白質純化與谷胱甘肽S-轉移酶親和純化(glutathione s-transferase pull down,GST pull down) 采用GST pull down實驗驗證OTUB2和DDX54的互作用。重組 His 標記的 OTUB2和DDX54在大腸埃希菌BL21中表達,并使用HisTrap HP層析柱進行純化。GST標記的OTUB2和DDX54也在大腸埃希菌BL21中表達,并使用谷胱甘肽-瓊脂糖4B層析柱進行純化。對于體外GST pull-down測定,GST標記蛋白與帶有His標簽的蛋白在PBS中4 ℃下孵育2 h。接下來,將谷胱甘肽-瓊脂糖樹脂添加到緩沖液中,并將混合物在4 ℃下孵育3 h。將珠子用PBS緩沖液洗滌3次,并用30 μl 2×SDS上樣緩沖液煮沸,然后進行SDS-PAGE分析。

1.2.14His-tag pull-down His-tag pull-down實驗驗證OTUB2對DDX54的泛素化修飾情況。轉染OTUB2過表達質粒的SW480細胞室溫下在8 ml His-tag pull down裂解緩沖液中裂解2 h。將細胞裂解物與50 μl Ni NTA珠在室溫下孵育6 h。用 His-tag pull-down 洗滌緩沖液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ依次洗滌珠子。珠子在30 μl His-tag pull-down 洗脫緩沖液中洗脫,并用 30 μl 2×SDS上樣緩沖液煮沸。對樣品進行蛋白質印跡分析。

1.3 統計學處理使用 GraphPad Prism 8.0軟件進行統計分析。實驗結果統計以平均值±標準差表示,兩組間比較采用t檢驗,多組之間比較采用單因素方差分析,多組間數據的兩兩比較采用SNK-q檢驗,P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CRC患者外周血中NETs的形成增加并促進CRC細胞活力和侵襲當中性粒細胞釋放NETs時,它們會釋放一系列的細胞因子,包括TNF-α和IL-8。與健康對照組相比,CRC組患者外周血中NETs相關因子TNF-α和IL-8的水平上調(t=9.79、10.15,均P<0.001)(圖1A)。與對照組相比,PMA組中性粒細胞MPO和Cit-H3蛋白表達上調(q=19.09、22.49,均P<0.001);與PMA組相比,使用PMA+DNase Ⅰ處理后,MPO和Cit-H3蛋白表達降低(q=11.34、16.25,均P<0.001),表明PMA成功誘導NETs形成,而DNase Ⅰ抑制了NETs水平(圖3B)。將分離的NETs用于處理SW480細胞并檢測細胞活力與侵襲,與對照組相比,NETs處理組細胞活力和侵襲增加(t=7.69、6.72,均P<0.01)(圖3C、D)。

圖1 NETs分離及其對CRC細胞活力和侵襲的影響

2.2 OTUB2在CRC組織和細胞中高表達并與中性粒細胞呈正相關UALCAN數據庫分析顯示OTUB2在CRC組織中的表達高于癌旁組織(圖2A);與癌旁組織相比,CRC患者癌組織中OTUB2的mRNA表達上調(t=8.51,P=0.001)(圖2B),并且OTUB2 mRNA和蛋白在CRC細胞中的表達均高于NCM460細胞(q=8.11、12.89、10.70、7.59、16.48、9.99,均P<0.01)(圖2C、D)。TIMER數據庫預測結果顯示,在CRC中OTUB2的表達與中性粒細胞的相對浸潤水平呈正相關(r=0.16,P=0.001)(圖2E)。

圖2 OTUB2在CRC組織和細胞中的mRNA和蛋白表達以及OTUB2與中性粒細胞的相關性分析

2.3 過表達OTUB2增加NETs的形成并促進CRC細胞活力和侵襲qRT-PCR檢測結果顯示,過表達OTUB2后OTUB2的mRNA水平高于vector組(t=9.47,P<0.001)(圖3A)。ELISA檢測結果顯示,與vector組相比,OTUB2組MPO-DNA復合物相對表達量和Cit-H3的濃度上調(q=19.29、12.92,均P<0.001)、細胞活力和侵襲能力提高(q=11.11、18.32,均P<0.001);與OTUB2組相比,OTUB2+DNase Ⅰ組MPO-DNA復合物相對表達量和Cit-H3的濃度降低(q=13.33、8.88,均P<0.001)、細胞活力和侵襲能力被抑制(q=7.90、11.20,均P<0.01)(圖3B-D)。提示過表達OTUB2能夠促進NETs的形成并促進CRC細胞的活力和侵襲。

圖3 共培養系統中NETs形成以及各組CRC細胞活力和侵襲的檢測結果

2.4 敲低OTUB2逆轉NETs誘導的CRC細胞活力和侵襲qRT-PCR檢測結果顯示相對于對照組,si-OTUB2組細胞的OTUB2 mRNA表達降低、細胞活力和侵襲能力也降低(t=4.04,q=7.28、8.56,均P<0.01)(圖4A),NETs組細胞活力和侵襲增加(q=14.51、11.61,均P<0.001)。而與NETs組相比,敲低OTUB2后NETs+si-OTUB2組細胞活力和侵襲被抑制(q=11.25、12.38,均P<0.01)(圖4B、C)。提示敲減OTUB2能夠抑制NETs誘導的CRC細胞的活力和侵襲能力。

圖4 各組細胞活力和侵襲檢測結果

2.5 OTUB2直接調控DDX54的表達為了研究OTUB2在CRC中作用的機制,本研究在CRC細胞中敲低OTUB2并做RNA測序(圖5A)。將測序差異顯著的前100個基因和StarBase中預測的OTUB2的結合蛋白取交集,發現共3個交集分子:DDX54(差異倍數=-1.37013298)、IGF2BP1(差異倍數=1.7614246)、ABHD2(差異倍數=0.9325771)(圖5B)。UALCAN數據庫預測顯示DDX54在CRC癌組織中高表達(P=1.624-12)(圖5C),qRT-PCR檢測結果顯示DDX54在本研究納入的CRC患者癌組

圖5 OTUB2和DDX54的結合驗證

織中表達上調(t=7.72,P<0.001)(圖5D)。與NCM460細胞相比,DDX54 mRNA和蛋白在CRC細胞系中均高表達(q=7.13、13.27、10.70、7.48、16.79、13.59,均P<0.01)(圖5E、F)。co-IP實驗結果顯示,在DDX54抗體免疫沉淀的蛋白質中可檢測到OTUB2蛋白,在OTUB2抗體免疫沉淀的蛋白質中可檢測到DDX54蛋白,表明二者發生了共沉淀(圖5G)。GST-pull-down實驗進一步表明,在GST-DDX54融合蛋白中可檢測到OTUB2蛋白,在GST-OTUB2融合蛋白中可檢測到DDX54蛋白。(圖5H)。提示 OTUB2能夠與DDX54結合,OTUB2可能是DDX54的去泛素化酶。

2.6 OTUB2抑制DDX54的泛素化對OTUB2和DDX54的泛素化修飾情況進行His pull-down實驗檢測,結果顯示,相對于加入了DDX54和His-Ubi抗體的SW480細胞,加入了DDX54、His-Ubi以及OTUB2抗體后SW480細胞中DDX54的泛素化水平被抑制(圖6A)。Co-IP實驗檢測結果顯示,在SW480細胞中敲除OTUB2后,DDX54的泛素化增加,而進一步加入OTUB2抗體后,DDX54的泛素化被抑制(圖6B)。這些結果表明OTUB2抑制DDX54的泛素化。

圖6 OTUB2影響DDX54的泛素化的檢測結果

2.7 敲低DDX54減弱過表達OTUB2誘導的NETs的形成、CRC細胞活力和侵襲圖7A檢測結果顯示,相對于vector組,OTUB2組的OTUB2 mRNA表達增強(t=10.46,P<0.001)。ELISA檢測結果顯示,與OTUB2+si-NC組相比,敲低DDX54后共培養系統中MPO-DNA復合物相對表達量和Cit-H3的濃度降低(q=12.23、8.00,均P<0.001)(圖7B),細胞活力和侵襲被抑制(q=7.22、10.29,均P=<0.01)(圖7C、D)。提示敲低DDX54能夠抑制OTUB2誘導的NETs形成和降低CRC細胞的活力和侵襲能力。

圖7 敲低DDX54減弱過表達OTUB2誘導的NETs的形成和CRC細胞增殖和侵襲

3 討論

本研究結果顯示,去泛素化酶OTUB2在CRC中表達增強,OTUB2能夠增加NETs的形成并促進CRC細胞的惡性生物學行為,該作用的實現可能與增強DDX54的活性有關。這些發現為進一步研究OTUB2和DDX54之間的相互作用以及它們在CRC治療中的潛在價值提供了重要依據。

中性粒細胞是數量最多的免疫細胞,與腫瘤細胞協同促進腫瘤的惡性進展[6]。研究[7]表明,高水平的腫瘤浸潤性中性粒細胞與CRC的較差預后有關。NETs是中性粒細胞獨特的產物,可以保護腫瘤細胞免受宿主免疫系統的攻擊從而促進腫瘤的侵襲和轉移[8]。此外,還有研究[9]表明靶向抑制腫瘤中NETs的形成或活性是癌癥治療的潛力策略。本研究通過生物信息學在線預測網站顯示,OTUB2在CRC中與中性粒細胞呈正相關,體外實驗顯示,過表達OTUB2促進NETs的形成以及CRC細胞的增殖和侵襲,而敲低OTUB2減弱NETs介導的CRC細胞增殖和侵襲。

泛素-蛋白酶體系統是蛋白質翻譯后修飾的主要機制,泛素酶E1、E2、E3通過催化靶蛋白的的泛素化使其降解,而泛素特異性蛋白酶(deubiquitinating enzyme,DUB)通過去除靶蛋白中的泛素鏈抑制其泛素化從而增強靶基因的穩定性[10]。OTUB2是卵巢腫瘤結構域(ovarian tumor domain,OTU)家族成員之一。研究[11]表明,OTUB2一方面通過促進DNA損傷修復誘導腫瘤免疫逃逸促進腫瘤進展;另一方面通過調控多種信號通路促進腫瘤轉移,如OTUB2可以介導Hippo通路的下游分子YAP/TAZ去泛素化。OTUB2去泛素化酶活性在腫瘤中的致癌作用已被廣泛報道,且研究[4]顯示,敲低OTUB2可以抑制CRC細胞增殖、遷移并促進細胞凋亡,抑制小鼠腫瘤生長。本研究通過生物信息學分析和高通量測序發現DDX54是OTUB2的潛在靶點,qRT-PCR結果表明DDX54在CRC組織和細胞中高表達,co-IP和GST-pull-down實驗顯示OTUB2可以直接與DDX54結合,His-tag pull down和免疫沉淀分析表明OTUB2通過去泛素化增強DDX54的活性。據報道[12],無論DNA是否存在損傷DDX54均可促進細胞存活,且DDX54 在9種實體瘤中表達上調,可以作為一種新的腫瘤標記物。此外,研究[5,13]表明DDX54在包括CRC在內的多種癌癥中表達上調,促進腫瘤的增殖、遷移和侵襲。在本研究中,敲低DDX54能夠抑制過表達OTUB2介導的促癌作用。

綜上所述,本研究通過實驗證明NETs在CRC患者中高表達,并促進促進CRC細胞活力和侵襲;OTUB2通過抑制DDX54的泛素化從而調節NETs的生成和CRC細胞的活力和侵襲。上述研究結果揭示了OTUB2在CRC發生和發展中的關鍵作用,使其成為CRC的潛在的診斷和治療靶點。