谷子基因組學研究進展

侯思宇　劉超　馬赟驍　任超　格桑拉毛　趙玥　王晨晨　甄曉溪

摘要：作為古老的馴化作物之一，谷子在中國北方的干旱和半干旱地區廣泛種植。谷子是重要的雜糧作物，其籽粒富含蛋白質、糖類、維生素等營養物質，具有C4 光合、小的二倍體基因組、抗逆、適應性強等特點。自2012 年谷子基因組測序項目完成以來，谷子已經進入了基因組學時代。谷子基因組學的發展可以分為3 個階段：結構基因組、功能基因組、比較基因組。二代測序技術的出現，使得基于測序的基因分型和全基因組關聯分析極大地推動了谷子遺傳學的研究。在健康中國戰略的時代背景下，谷子已成為改善居民膳食結構和推動有機旱作高質量發展的優勢作物。近年來，谷子產業發展呈上升趨勢，但品種選育方面缺乏突破，不能滿足現代有機旱作需求，主要原因在于谷子育種仍然依托傳統育種手段。谷子基因組學的發展為分子育種奠定了基礎，文章綜述了谷子全基因組測序歷史與現狀、遺傳轉化體系的研究進展以及基于谷子全基因組序列發掘基因資源取得的成果。谷子功能基因組學與傳統育種技術的有機結合必將促進高效、精準谷子育種體系的構建，加快突破性谷子品種的培育，滿足產業發展和消費者的需求。

關鍵詞：谷子；基因組；全基因組測序；遺傳轉化；基因挖掘

中圖分類號：S515 文獻標識碼：A 文章編號：1002?2481（2024）01?0001?09

隨著2000 年世界上第一個測序完成的模式植物——擬南芥（Arabidopsis thaliana）全基因組序列的公布[1]，推動了基于基因組學、分子生物學等相關技術開展的植物生長發育、抗逆、抗病、養分利用等大量的模式植物功能基因組學研究[2]，同時也極大地促進了作物科學領域的發展，其中水稻（Oryzasativa）基因組學研究最為深入，2002 年水稻基因組測序完成[3]，利用多組學、全基因組關聯研究揭示了水稻養分利用、生物和非生物響應、生殖發育等重要分子機制，同時高通量表型平臺、精確基因組編輯工具等新技術也廣泛應用于水稻研究[4]。隨著相關技術的逐漸成熟，基因組學研究在多種主糧和雜糧作物中迅速發展。

谷子（Setaria italica）起源于我國，是最早完成基因組測序的雜糧作物[5]。谷子基因組較小，且生育期短，具備模式植物的特點。同時，谷子作為C4植物，可以用于揭示C4 植物高光效、抗逆耐瘠薄的特殊機理[6]。近年來，我國科學家利用EMS 誘變獲得了株高和生育期與擬南芥極為接近的“模式化”谷子——xiaomi[7]，同時，基于110 份谷子種質的高質量泛基因組的完成[8]，為推動谷子成為C4 模式植物、深入開展基因組學研究奠定了堅實的基礎。本文概述了自谷子基因組測序研究工作開展以來，國內外科學家圍繞谷子開展的功能基因組學研究，包括谷子基因組的情況，以及利用谷子基因組開展的遺傳轉化體系的開發，調控特色營養物質積累和抗逆性調控等重要功能基因的發掘工作，這既是對谷子分子水平研究的一次梳理，也是對谷子功能基因組學研究的未來研究方向的一次展望。

1 谷子全基因組測序歷史與現狀

華大基因與河北張家口市農業科學院等單位的科研人員于2012 年利用全基因組鳥槍法結合二代測序技術對中國北方廣泛種植的谷子品系“ 張谷”進行了全基因組測序和組裝，獲得了大小約為423 Mb（Contig N50 為25.4 kb，Scaffold N50 為1.0 Mb）的谷子全基因組序列圖譜[5]。通過基因組注釋和分析發現，重復序列約占整個基因組的46%，大約含有38 801 個蛋白質編碼基因，其中有81% 可以被表達。研究人員通過谷子、水稻和高粱之間的共線性分析鑒定到了關鍵的染色體重組事件，明確了谷子9 條染色體是在3 次染色體重組事件后形成的（在谷子和水稻分化后2 次，谷子的2 號和9 號染色體分別由水稻的7 號和9 號，3 號和10 號染色體融合而成；在谷子和高粱分化后一次：谷子的3 號染色體由水稻的5 號和12 號染色體融合而成），為禾本科的進化提供了見解。此外，研究人員使用Illumina GA II 平臺對谷子光熱敏的雄性不育系“A2”進行了10×深度的重測序，并利用“張谷”和“A2”的F2 群體繪制了高密度的遺傳圖譜，將該圖譜與谷子基因組序列及后代表型等信息相結合定位到了一個谷子抗除草劑相關基因。

美國國家能源部所屬聯合基因組研究所的科研人員采用全基因組鳥槍法結合一代測序技術（Sanger 測序法）對谷子品種豫谷1 號進行了全基因組測序和組裝，并與上述“張谷”基因組序列在同一期刊同時發表相關論文。他們獲得了大小約為400 Mb（Contig N50 為126.3 kb，Scaffold N50 為47.3 Mb）的谷子參考基因組[9]，覆蓋了谷子近80%的基因組，超過95% 的基因區域。為促進基因表達分析，利用不同組織、不同發育時期的豫谷1 號的mRNA 序列生成了超過130 萬個表達序列標簽（EST）文庫和超過5.8 億個RNA-Seq reads。同時，該研究還使用Illumina GA II 平臺對谷子的野生近緣種狗尾草A10 進行了重測序，利用谷子自交系B100 和狗尾草A10 雜交后代構建了重組自交系（RIL）群體，該RIL 群體具有992 個SNP 標記。該研究確定了差異單核苷酸多態性密度、轉座子分布、小RNA 含量、染色體重排和偏分離區域，通過比較5 個已測序的禾本科植物基因組，研究了狗尾草屬的廣泛適應性的遺傳基礎。

美國唐納德丹佛斯植物科學中心研究人員于2020 年使用PacBio 和Illumina HISeq 測序平臺更新了狗尾草A10.1 的參考基因組，完成了端粒到端粒的染色體組裝，獲得了大小為395.1 Mb 的高質量參考基因組（2.0 版本）[10]。2.0 版本的狗尾草參考基因組的組裝質量更高，Contig N50 為11.2 Mb，在9 條染色體上基因組組裝的完整性為99.95%，共注釋得到38 334 個編碼蛋白基因和14 125 個可供選擇的轉錄本。此外，該團隊基于二代測序使用Illumina 2×150PE 文庫從頭組裝了598 份狗尾草高質量基因組，構建了狗尾草泛基因組數據庫，進一步利用高質量基因組、泛基因組鑒定到一個調控狗尾草種子落粒性基因Sh1 并通過CRISPR-Cas9基因編輯技術對其功能進行驗證，同時也證實了該基因在谷子中也是影響落粒性的關鍵位點。同年，山西農業大學雜糧分子育種團隊對名優谷子品種晉谷21 號EMS 誘變獲得的超早熟谷子突變體xiaomi 構建了功能基因組學研究體系。利用PacBio平臺和二代、三代基因測序技術對xiaomi 進行了基因組測序和組裝，獲得了大小為429.94 Mb（Contig N50高達18.8 Mb，Scaffold N50為42.41 Mb）的高質量參考基因組[7]。xiaomi 基因組序列中重復序列約占55.19%，根據從頭預測、同源基因預測以及Iso-seq 和RNA-seq 分析結果，共注釋到33 789 個蛋白質編碼基因。xiaomi 基因組僅包含48 個Gap且組裝的錯誤率約為0.001%，在覆蓋率、ContigN50 等方面的表現均優于張谷、豫谷1 號參考基因組。此外，該研究對迷你谷子xiaomi 不同發育階段的11 個組織進行了轉錄組測序，結合高質量參考基因組，構建了首個谷子全生育期動態基因表達圖譜和谷子多組學數據庫，不僅促進了谷子功能基因組學的研究，還使得xiaomi 成為C4 植物功能研究的理想模型系統。

中國農業科學院作物科學研究所特色農作物優異種質資源發掘與創新利用團隊于2023 年建立了首個谷子圖形結構泛基因組，在此基礎上鑒定了多個關鍵基因，展示了泛基因組無與倫比的優勢[8]。他們從1 844 份不同亞組、區域和生態型的谷子和狗尾草品系中選取了35 個谷子野生種、40 個農家品種和35 個現代育成品種。利用PacBio、Illumina和Bionano 測序技術從頭組裝（de novo assembly）代表谷子和青狗尾草最廣泛的多樣性的110 份核心參考水平基因組。核心種質包含了對谷子育種或研究作出重大貢獻的種質，如選育骨干親本（60 日和矮88）、高食用和蒸煮品質品種（晉谷21 號和黃金苗）、強耐旱性品種（中谷2 號）、廣泛的氣候適應性品種（豫谷18 號），以及易于遺傳轉化用于基因功能分析的材料（Ci846），這些材料涵蓋了株型結構、穗形和產量等性狀多樣性。這些材料包含了1 844 份狗尾草屬中85% 以上的單核苷酸多態性（SNP）變異。谷子泛基因組中包含73 528 個基因家族的全基因組。通過整合112 份谷子和青狗尾草泛基因組中的107 151 個插入、76 915 個缺失和363 個倒位變異，并將其整合到豫谷1 號參考基因組序列中，構建了首個C4 作物的泛基因組。泛基因組為探索谷子群體進化、馴化與改良、功能基因組學和廣泛的適應性等基礎研究，及其農藝學應用方面提供了推動力。利用泛基因組，鑒定了4 582 個與馴化相關、152 個與育種改良相關的結構變異，同時共鑒定出680 個在馴化改良過程中被持續選擇的基因；鑒定出有關落?；騍h1（855 bp 的缺失）和籽粒大小基因SiGW3（366 bp 的缺失）等多個結構變異基因；確定了共1 084 個與表型顯著相關的位點。泛基因組為未來的谷子分子育種提供了新平臺，同時也為其他雜糧作物精準育種選擇奠定了理論基礎。

2 谷子轉化體系的構建

谷子是C4 作物，且基因組小、抗逆性強，具有成為禾本科功能基因組學模式作物的潛力，因此，近年來關于其轉化體系的研究得到了廣泛關注。

谷子遺傳轉化方法包括基因槍法、農桿菌介導法、PEG 介導法、超聲波介導法、花粉管通道法、子房注射法、基因編輯技術等?；诠肺膊萦鷤T導的成功，近些年來農桿菌介導法被應用于谷子的遺傳轉化相關研究。早在20 世紀70 年代日本學者就開始了谷子的組培研究，后續各國學者在此基礎上進行了更為深入的研究。2007 年中國農業大學LIU 等[11]探究了多種影響谷子遺傳轉化效率的因素，并確定了最優的轉化條件，為農桿菌侵染愈傷組織的轉化系統打下了基礎。2020 年山西農業大學YANG 等[7]以迷你谷子突變體xiaomi 開發了高效的農桿菌介導的谷子遺傳轉化方案，由于其生命周期短、植株小，與擬南芥相似，一年可以在培養室中生長5～6 代，更有利于谷子功能基因組學的研究[7]。2020 年PRIYANKA 等[12]優化了谷子簡單有效的再生和轉化方案，同年，SANTOS 等[13]利用成熟干燥的種子作為外植體進行農桿菌轉化，大大提高了轉化率和再生率。大大提高了轉化率和再生率。2021 年楊瀾等[14] 利用基于農桿菌介導的CRISPR/Cas9 系統轉化谷子，胞嘧啶和腺嘌呤堿基編輯系統進行單、多基因敲除和單堿基替換，創造了一種純合抗除草劑種質。除愈傷組織外，2021 年楊瀾等[14]還建立了穩定的谷子體外莖尖遺傳轉化體系。

青狗尾草是谷子的近緣野生種，二者核型基本相同、基因組大小相近，是研究谷子馴化、發掘基因資源的重要材料。2016 年SAHA 等[15]通過蘸穗法將目的基因成功整合到狗尾草基因組中，且在后代中成功表達。隨后，2017 年趙輝等[16]通過高效胚性愈傷誘導技術，大大提高了狗尾草的轉化效率。

谷子和狗尾草轉化體系的建立為谷子功能基因組學研究和遺傳改良奠定了基礎。

3 基于谷子全基因組序列發掘基因資源

3.1 基于參考基因組，利用轉錄組探究谷子基因表達模式與調控機制

隨著谷子參考基因組的公布發表，谷子重要性狀相關基因表達模式和調控機制的研究成果呈“井噴”式增長。當前轉錄組分析主要聚焦在谷子非生物和生物脅迫、穗發育、初級代謝和次生代謝物等機制解析方面。尤其在轉錄因子家族成員鑒定及表達模式方面已有大量的研究文獻。在谷子基因組中，鑒定出147 個NAC、122 個C2H2 類鋅指蛋白、225 個WD40 蛋白、209 個MYB、171 個AP/ERF、35 個Dof、47 個HD-zip、72 個MADS-box、39 個NF-Y 及37 個CCT，不同非生物脅迫（干旱、鹽、冷等）和激素（水楊酸、脫落酸、茉莉酸甲酯、乙烯等）處理條件下，上述轉錄因子家族成員多樣性的表達模式暗示了潛在的生物學功能分化，從中鑒定到一系列脅迫響應特異的候選基因，如SiNAC128、SiAP2/ERF-069、SiAP2/ERF-103、SiAP2/ERF-120、SiNF-YA1、SiNF-YB8 和Si?MADS51 等[17-26]。谷子在低氮脅迫下，利用轉錄組分析找到75 個差異表達的轉錄因子，其中Si?MYB3 基因能夠調控下游生長素合成相關基因TAR2 表達，進而促進根系發育[27]。結合干旱脅迫的時序動態轉錄組分析，鑒定出13 294 個響應干旱脅迫基因，包括842 個晝夜節律基因，初步解析了干旱脅迫與晝夜節律交叉調控谷子發育的分子機制[28]。谷子籽粒灌漿期動態轉錄組揭示了11 399 個差異表達基因，包括902 個轉錄因子，涉及到淀粉合成、細胞壁活性、激素信號轉導及多胺代謝途徑[29]。此外，涉及到非生物脅迫響應的73 個谷子谷胱甘肽轉移酶及331 個細胞色素P450 單加氧酶基因家族成員，也通過全基因組生物信息學及轉錄組分析，分別鑒定出37 個組織特異性表達和21 個響應非生物脅迫的谷胱甘肽轉移酶基因家族成員，以及6 個細胞色素P450 單加氧酶基因表達水平響應不同的除草劑處理（硝磺草酮、雙氟磺草胺、煙嘧磺隆、氟草定及拿普凈）[30-31]。叢枝菌根真菌定植顯著增強谷子籽粒產量，比較轉錄組分析揭示了超過2 000 個基因受到叢枝菌根真菌的誘導響應，GO 富集分析表明大部分基因富集在氮同化和轉運、細胞壁重組和木質化途徑[32]。低單寧谷子品種可以吸引紅蜘蛛取食，從而保護板栗樹免受蟲害，比較轉錄組揭示了335 個共有的差異表達基因，KEGG[33]富集發現PTAL、CCR 及POX 基因涉及到苯丙烷類合成途徑的單寧生物合成分支途徑，此外，預測了20 個轉錄因子，包括bHLH、WRKY、FAR1、ERF、C2H2 等參與調控單寧生物合成。板栗樹與谷子套種系統有效地提高園林土地利用率及增加其產量和品質，遮蔭條件下不同基因型谷子轉錄組分析鑒定出9 個差異表達基因，功能注釋為HSP70-8、HsfA2、SPDS、SPMS 等基因涉及光系統和熱脅迫響應途徑[34]。谷子紫葉基因型具有較高的脅迫容忍性，比較轉錄組分析，鑒定出9 個差異表達基因與花青素合成相關，可作為分子育種的潛在功能標記[35]。在黃米和白米谷子品種穗發育階段，基于比較轉錄組和類胡蘿卜素靶向代謝組聯合分析，構建了基因共表達網絡，鑒定出54 個類胡蘿卜素代謝途徑相關基因及3 個轉錄因子協同調節類胡蘿卜素代謝流[36]。聯合脂質組和轉錄組分析，鑒定出2 633 個脂質分子，歸屬于13 種甘油磷脂、11 種甘油糖脂、4 種鞘脂類及脂肪酰和甾醇類，同時鑒定出9 個差異表達基因與甘油二脂代謝途徑相關[37]；谷子籽粒不飽和脂肪酸含量遠大于飽和脂肪酸含量，152 個差異表達基因與脂肪酸代謝和植物甾醇合成相關[38]。禾生指梗霉是引起谷子白發病的一類真菌，其病害發生使晉谷21 號造成大量減產，轉錄組分析表明，禾生指梗霉侵染谷子后導致萜類生物合成酶（CPS 和KS）高表達，赤霉素、脫落酸及生長素合成途徑相關基因表達量上調，初步揭示了內源激素調控谷子白發病表型的分子機制[39]。環境CO2 濃度升高可提升谷子高光效、生物量及產量，轉錄組分析鑒定出一系列差異表達基因，涉及到細胞重組、莖段發育、氣孔導度、碳固定、糖酵解和糖異生途徑[40]。龍谷25 屬于低鉀脅迫敏感基因型，轉錄組分析發現了1 982 個差異表達基因響應低鉀脅迫，其中一個響應低鉀脅迫的轉錄因子SiMYB3 功能分析表明，超表達擬南芥可促進根系延長及應對鉀素缺乏能力[41]。在谷子noncoding RNA（Ln?cRNA、siRNAs、microRNA）測序分析方面，也初步明確了其種類、染色體分布特征、表達模式、共表達網絡及谷物類保守進化特征，預測了響應干旱和脫水脅迫、水楊酸處理的noncoding RNA 及其調控的靶基因[42-47]。此外，利用基因組和轉錄組分析，還鑒定出一些重要的基因家族，如SWEET、SET-domain、HAT（Histone acetyltransferase） 、AATs（Amino acid transporters）和CDPKs（Calciumdependentprotein kinases）等，找到與產量、蛋白品質、抗非生物脅迫及甲基化相關的一些候選基因[26，48-52]。

綜上所述，利用基因組和轉錄組分析，針對谷子的生長發育調節、生物脅迫與非生物脅迫及代謝調控相關的基因發掘方面已做了較為重要的創新性工作，但仍存在不同基因型不同處理所獲得的結果不盡相同，其相關共性的規律尚需進一步總結歸納，挖掘的候選基因多數尚未驗證其功能，需要在生信分析的基礎上，展開實質性的基因功能驗證和機理深度解析，為將來谷子分子育種提供可利用、主效和可靠的基因資源。

3.2 基于GWAS、轉錄組定位重要性狀基因

谷子作為起源于我國的重要糧食作物，隨著谷子基因組的公布，基于全基因組關聯分析、QTL 定位等手段，已有很多調控谷子重要性狀的關鍵基因或QTL 被發掘。JIA 等[53]基于全基因組重測序對916 份谷子材料的47 個農藝性狀進行全基因組關聯分析，在5 個環境下共鑒定到512 個顯著關聯的SNP 位點；LI 等[54]基于312 個谷子材料的全基因組關聯分析，挖掘到影響谷子高海拔適應性的關鍵基因SiPRR37；VANDANA 等[55] 和LIU 等[56] 分別對142 個和407 個谷子品種的農藝性狀及穗型性狀進行全基因組關聯分析，挖掘了大量的顯著關聯SNP。大規模mGWAS 研究也被報道?；趶V泛靶向代謝組學與GWAS 的協同分析，挖掘了控制谷子米色及類胡蘿卜素含量的關鍵基因SiPSY[57]。通過谷子泛基因組圖譜，鑒定了多個與谷子馴化及育種改良的染色體結構變異及重要候選基因[8]。

除全基因組關聯分析外，基于遺傳作圖，谷子中也發現了多個重要QTL。DOUST 等[58] 通過QTL 分析在來源于谷子和青狗尾草的雙親群體中檢測到14 個與穗部性狀相關的QTL。在另外2 個QTL 定位研究中，也分別鑒定出12、32 個QTL 與穗部性狀相關，如PWP、GWP、TGW 等[59-60]。這些研究大部分是基于少量的多態性位點，并且很少有QTL 被鑒定。最近一項基于12 個環境的QTL 定位研究，確定了159 個與穗性狀相關的QTL，深化了對谷子穗部和產量形成的遺傳基礎的理解[61]。然而，基于雙親群體的QTL 結果嚴重依賴于群體和環境的遺傳背景，這極大地限制了這些QTL 在谷子育種計劃中的廣泛適應性和穩定性?？偟膩碚f，盡管谷子上已有部分基因或QTL 被發掘，但是與小麥、水稻、玉米等大作物相比，還遠遠不足。進一步充分發掘利用優異種質資源及其富含的基因資源是谷子現代化分子育種研究的基礎。

3.3 基于參考基因組對基因家族的鑒定

谷子參考基因組測序的完成對于谷子功能基因組的研究尤其是谷子基因家族的鑒定提供了便利，近年來涉及到抗逆脅迫、生長發育、以及營養吸收相關的基因家族相繼被報道，為谷子功能基因的深入研究提供了思路與參考。

3.3.1 調控植物生長發育過程的基因家族的分離與鑒定

MADS-box 基因家族部分成員參與谷子穗分生組織發育[62]；SPL 基因參與組織分化以及種子發育[63]；bHLH 轉錄因子（187 個家族成員）參與谷子根、莖、葉、花以及果實的發育調控[64-65]；AAT基因家族成員在谷子籽粒品質形成過程中具有重要作用[49]；GRAS 基因家族成員調控谷子株高，并影響谷子的穗質量[66]；GRF 基因家族傾向于在發芽的種子、芽、花蕾和嫩葉等活躍生長和發育的組織中高表達，暗示其可能參與谷子生長發育的調控[67-70]；LBD 家族成員在谷子根系中特異表達[71]，CCT 轉錄因子（39 個成員）中有15 個SiCCT 基因與谷子抽穗期具有重要關系[72]。以上工作為谷子基因功能的深入研究提供了資源與參考。

3.3.2 參與谷子逆境脅迫的基因家族的分離與鑒定

參與谷子干旱、鹽堿以及低氮、低磷脅迫等非生物脅迫的基因家族相繼被報道。其中包括通過氧化各種脂質參與植物的生理活動的谷子脂氧合酶（LOXs）基因（12 個成員），調控脂肪酸和蠟質的合成與積累的酮脂酰輔酶A 合酶（β-ketoacyl-CoAsynthase，KCS，33 個成員）[73]，LBD 轉錄因子（33 個家族成員）[71]，糖轉運蛋白（Sugar transporter pro?teins，STPs）家族成員[74]，SPL（18 個家族成員）基因家族[75]，植物氨基酸轉運載體（Amino acid trans?porter，AAT）[49]，組蛋白乙酰轉移酶（HAT）基因[52]。另外，WRKY 轉錄因子[76]、MYB[20]、CCCH 類鋅指蛋白（27 個成員）[77] 以及GRF[78] 家族成員也參與谷子多種非生物脅迫響應；ANK 家族基因成員參與低溫、干旱、鹽等脅迫響應[79]；谷子APX家族成員受干旱脅迫和高氮誘導后，表達顯著上調[80]。

3.3.3 調控營養元素轉運吸收功能的基因家族的鑒定

參與谷子硒、葉酸等微量元素吸收以及氮、磷、鉀等營養元素吸收轉運的基因家族近年來也被報道，其中谷子SULTR 基因家族成員SiSUL?TRC3 可以提高植株轉運SeO42-的能力[81]。FPGS基因家族的SiFPGS1-3、SiFPGS1-4、SiFPGS-2基因表達與谷子葉酸含量呈正相關[82]。Shaker K+通道基因家族參與植物鉀的攝取和分布[83]。ZIP 家族中的基因編碼轉錄本可以儲存和運輸二價金屬微量營養素，特別是鐵（Fe）和鋅（Zn）。NAC、bZIP和bHLH 是SiZIP 基因中存在的主要Fe 和Zn 響應轉錄因子[84]。PHT1 家族轉運蛋白基因在低磷脅迫下，可促進植株對磷的吸收[85]。MYB-CC 基因已經被證明可調控植物中磷酸鹽吸收[86]。NRT 基因家族由NRT1/PTR，NRT2 和NRT3 亞家族組成，其在硝酸鹽從土壤到植物的吸收和運輸中起關鍵作用[87- 88]。

4 展望

2012 年全基因組測序的完成為谷子功能基因組學揭開了序幕，2023 年泛基因組的發布吹響了谷子分子育種的集結號。在豐富種質資源的基礎上，谷子基因資源的發掘將走上快車道，越來越多的重要性狀相關基因及其功能將會被發現并用于分子育種，分子育種與傳統育種的緊密結合將極大地提升谷子育種效率，推動突破性品種的培育。

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