電化學法制備碳點熒光探針測定氯霉素含量的研究

何芳,張穎,張運良,孫雙姣

摘要：以葡萄糖作為碳源，通過電化學碳化的方法制備碳點（C-dots）并表征其形貌和光學性質。將C-dots作為熒光探針檢測氯霉素的含量。研究表明，所制備的C-dots在紫外光的激發下發射藍色熒光（激發/發射波長分別為345/450 nm），氯霉素對C-dots熒光有猝滅作用，且C-dots熒光猝滅效率與氯霉素濃度呈現良好的線性關系，線性范圍為0.1～5.0 mmol/L，檢測下限為0.016 mmol/L（信噪比S/N=3）。該方法制備的C-dots具有優異的熒光性能及光學穩定性，可靈敏、便捷地檢測氯霉素含量。

關鍵詞：電化學法；碳點；氯霉素檢測；熒光探針；藥物分析

中圖分類號：R917? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼：A

Synthesis of fluorescent carbon dots by electrochemical method for chloramphenicol probe

HE Fang1， 2， ZHANG Ying1， 2， ZHANG Yunliang1， 2， SUN Shuangjiao1，2

（ 1. School of Pharmacy， Shaoyang University， Shaoyang 422000， China; 2. Hunan Engineering Research Center of Development and Utilization of Traditional Chinese Medicine in Southwest Hunan， Shaoyang 422000， China）

Abstract： Using glucose as carbon source， the C-dots were synthesized by electrochemical carbonization method and the morphology and optical properties of C-dots were characterized. The prepared C-dots were used as fluorescence probe to detect the chloramphenicol. The results show that the as-prepared C-dots emit blue fluorescence when excited by ultraviolet light （excitation/emission wavelength was 345/450 nm， respectively）. The chloramphenicol has quenching effect on the fluorescence intensity of C-dots and the quenching effect of chloramphenicol on the fluorescence intensity of C-dots vs the concentration display a good linear relationship， with a detection linear range of 0.1～5.0 mmol/L and a lower limit of detection of 0.016 mmol/L. The as-prepared C-Dots have excellent fluorescence property and optical stability， which can be used for the detection of chloramphenicol content sensitively and specifically.

Key words： electrochemical method; carbon dots; chloramphenicol detection; fluorescence probe; pharmaceutical analysis

碳點（C-dots）是一種由分散的類球狀碳顆粒組成、尺寸極?。?0 nm以下）的新型熒光納米材料，也稱碳量子點。與傳統的金屬量子點相比，C-dots不含重金屬元素，主要含有碳元素以及表面功能基團中可能含有的氫、氧等非金屬元素，故毒性較低，對環境友好，且制備成本低廉[1-2]。因此，C-dots被廣泛研究并應用于藥物分析、食品安全、環境監測、醫學成像、催化劑制備、能源開發等諸多領域[3-6]。

氯霉素（CHL）濫用問題存在于畜牧養殖業、漁業等行業，通過各種渠道進入到人體內，極大地威脅人體的健康[7-8]。因此，氯霉素含量測定具有重要的意義。熒光檢測法簡便且便于控制，還具有成本低、效率高、原料易得等優點，彌補了傳統方法的缺陷，是實現氯霉素含量檢測的重要手段[9]。C-dots由于具有激發光譜寬且連續分布，而發射光譜窄而對稱，顏色可調，光化學穩定性高，熒光壽命長等優越的特性，可作為一種理想的熒光探針用于氯霉素的檢測[10-11]。本研究采用電化學碳化葡萄糖的方法制備紫外光激發下發射藍色熒光的C-dots，這種功能化C-dots可作為熒光探針，其熒光強度隨氯霉素的加入而減弱，誘發C-dots熒光猝滅，實現氯霉素的檢測。旨在開發一種氯霉素熒光傳感器，以實現氯霉素簡便、快速、靈敏分析。

1材料與方法

1.1儀器及試劑

電化學工作站（CHI660E，上海辰華儀器有限公司）；熒光分光光度計（F97Pro，上海棱光技術有限公司）；透射電子顯微鏡（JEM-2100，日本日立公司）；鉑電極（213型，上海越磁電子科技有限公司）。

氯霉素（純度大于98%）、多巴胺、尿酸、抗壞血酸購置于合肥博美生物科技有限責任公司；葡萄糖、檸檬酸納、磷酸二氫納、磷酸氫二鈉等購置于天津市永大化學試劑有限公司，試劑均為分析純。所用的化學品均未經進一步純化。實驗用水均為去離子水。

1.2實驗方法

1.2.1C-dots的制備

采用電化學的方法，以葡萄糖為碳源制備具有熒光性質的C-dots。參考文獻[12-14]，具體合成方法如下：配制葡萄糖（3 mol/L）與檸檬酸鈉（1 mol/L）的混合物水溶液，攪拌溶解至溶液透明。采用飽和甘汞電極為參比電極，2個鉑片電極分別作為工作電極和對電極的三電極系統電化學碳化葡萄糖制備C-dots。2個鉑片電極之間的距離約為1 cm，利用電化學恒電位技術，在工作電極上施加5 V電位，碳化約1 h，直到透明溶液變黃再變成棕色。所得產品溶液通過透析膜對超純水透析約6 h純化，50 ℃下干燥后得到C-dots粉末，將其分散在0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液（PBS）中，制得C-dots溶液。

1.2.2C-dots光學性質的表征

采用熒光分光光度計測定了制備C-dots的最大激發光譜和最大熒光發射光譜，并考察其熒光光學性質。改變激發波長，分別測量C-dots在不同波長紫外光的激發下的熒光發射光譜，考察其熒光發射峰的變化。將所制備的C-dots中加入到不同pH的0.1 mol/L的PBS中制備濃度相同的C-dots溶液，測定其在最大激發波長下（345 nm）的熒光發射光譜，考察其在不同pH溶液中的熒光穩定性。在C-dots溶液中加入不同濃度的NaCl，考察溶液離子濃度對C-dots熒光性質的影響。將所制備的C-dots溶液在不同時間的紫外光照射后，測量其熒光發射光譜，考察紫外光照射對C-dots熒光性質的影響。

1.2.3氯霉素的檢測

室溫下， 測量PBS溶液中C-dots在最大激發波長（345 nm）下的熒光發射光譜。加入不同濃度的氯霉素，制備含不同濃度氯霉素的C-dots溶液，測量其最大激發波長下（345 nm）的熒光發射光譜。以氯霉素的濃度為橫坐標，以加入不同濃度氯霉素后C-dots的熒光強度猝滅效率為縱坐標，繪制氯霉素標準曲線，實現氯霉素檢測。

2結果

2.1C-dots的制備及表征

采用透射電子顯微鏡（TEM）對所制備的C-dots進行了表征，見圖1（a）。結果表明，所制備的C-dots具有良好的分散性，C-dots的尺寸主要在5.0～7.5 nm范圍內分布。采用熒光分光光度計研究了C-dots的光學性能，見圖1（b）。C-dots溶液具有較寬的吸收光譜，其最大激發波長為345 nm（曲線1），最大發射波長為450 nm（曲線2），在紫外光的激發下，所制備的C-dots發射熒光。另外，為了得到熒光性質穩定、熒光強度高的C-dots，對原料溶液中葡萄糖和檸檬酸鈉的濃度比、電化學碳化時間、電化學碳化電位等因素進行了優化。結果表明，葡萄糖/檸檬酸鈉的濃度之比為3∶1，碳化時間為1 h，碳化電位為5 V時制備C-dots的最佳。因此，實驗均采用該條件下制備的C-dots。

C-dots在300～460 nm的不同波長的紫外光激發下呈現出與激發波長相關的熒光發射特性，隨著激發波長增加，最大熒光發射波長增加，熒光發射峰發生紅移，其相對應的熒光發射峰范圍在413～524 nm之間，見圖2。該行為可能與C-dots不同的尺寸分布有關[12， 15-16]。

2.2C-dots的光學穩定性

分別測定了C-dots在不同pH環境、離子濃度的PBS溶液中熒光強度，研究了C-dots的熒光穩定性。結果表明，C-dots在酸性及中性環境的PBS溶液中（pH為3.0～7.0）有較強的熒光，且穩定性好；但在堿性環境的PBS溶液中（pH>7.0），其熒光強度明顯減弱，見圖3（a）。其次，離子濃度對C-dots熒光穩定性幾乎沒有影響，即使PBS溶液中NaCl濃度高達1.0 mol/L，C-dots在450 nm處的熒光強度也沒有明顯的變化，見圖3（b），說明合成的C-dots在高離子濃度溶液中仍能夠穩定存在[12]。

另外，考察了紫外光照射對C-dots熒光性質的影響。在經過連續紫外光線（345 nm）照射1 h后，C-dots熒光強度仍保持在83%（圖4），表明所制備的C-dots在紫外光線照射下的熒光性質較穩定[12]。

2.3氯霉素的檢測及標準曲線繪制

2.3.1氯霉素對C-dots熒光強度的影響

首先測定了C-dots溶液的熒光強度，然后加入一定濃度的氯霉素溶液后，C-dots的熒光強度明顯減弱，增大加入的氯霉素濃度，熒光強度減弱幅度更明顯（圖5）。說明氯霉素的加入引起了C-dots熒光猝滅，且氯霉素濃度越大，猝滅效應越明顯，從而可以實現氯霉素檢測。這種熒光強度下降現象可歸因于氯霉素與功能化C-dots相互作用后引發能量共振轉移而誘發C-dots熒光猝滅[17-18]。

2.3.2檢測條件優化

為了提高氯霉素對C-dots的熒光猝滅效率，達到更好的檢測效果，優化了檢測溶液的pH、猝滅反應時間等實驗條件。實驗結果表明，當pH為7.0時，C-dots的熒光猝滅效率最高，見圖6（a）。因此，使用pH=7.0的PBS溶液為檢測溶液?？疾炝朔磻獣r間對C-dots熒光猝滅效率的影響，見圖6（b），在加入氯霉素后30 s內，熒光迅速猝滅，并在此后保持相對穩定。這說明C-dots在氯霉素存在下熒光猝滅動力學很快，為了保證熒光猝滅響應充分，故反應時間取2 min。

2.3.3氯霉素標準曲線

在優化檢測條件下，對加入不同濃度氯霉素（從上到下依次為0、0.1、0.3、0.5、1、2、3、4和5 mmol/L）的C-dots溶液的熒光強度進行了測定（檢測溶液為pH 7.0，0.1 M的PBS緩沖液）。見圖7（a），隨著氯霉素濃度增加，C-dots在紫外光激發下（345 nm）的最大發射峰（450 nm）處的熒光強度峰值逐漸降低。圖7（b）為C-dots熒光猝滅效率（I0—I）/I0相對于不同濃度氯霉素（0.1～5 mmol/L）的工作曲線，結果表明，C-dots熒光猝滅效率與氯霉素濃度呈現良好的線性關系，線性范圍為0.1～5.0 mmol/L，檢測限為0.016 mmol/L（信噪比為S/N=3）。

2.3.4抗干擾實驗

在相同條件下，在pH為7.0的0.1 mol/L PBS溶液中，考察了當其他抗生素或其他藥物分子存在時C-dots的熒光強度變化，包括硫酸卡那霉素（KANA）、頭孢他啶（TAZ）、頭孢曲松鈉（CTR）、頭孢呋辛鈉（CFX）、抗壞血酸（AA）、多巴胺（DA）、尿酸（UA），見圖8。氯霉素能大幅度降低C-dots的熒光強度，頭孢類抗生素也能降低熒光強度，但效果并不如氯霉素明顯，而硫酸卡那霉素與其他藥物分子則只能引起非常小的熒光減弱。這意味著C-dots可應用于選擇性地檢測氯霉素，其突出的選擇性與特異性可能與氯霉素對C-dots表面的羧基具有更強的親和力有關[19]。

3討論

C-dots的制備方法根據碳源的不同，分為“自上而下”合成法和“自下而上”合成法。

1）“自上而下”合成法是指將大尺寸的碳源通過物理或者化學的方法剝離出尺寸很小的C-dots，如通過電弧放電、激光消融、電化學刻蝕等手段將碳納米管、碳纖維、石墨棒、碳灰和活性炭等富碳物質進行分解并最終形成C-dots[20-21]?！白陨隙隆钡姆椒ㄒ话阈枰囟ǖ姆磻獥l件，過程繁雜且操作復雜，較難實現C-dots的可控制備。

2）“自下而上”合成法利用有機小分子等尺寸很小的碳材料合成出C-dots。如采用檸檬酸、聚乙二醇、尿素、離子液體等有機小分子或低聚物，常見的合成方法有化學氧化法、燃燒法、水熱/溶劑熱法、微波合成法、模板法、電化學法等[22]。 “自下而上”方法制備C-dots，反應條件溫和，易于純化分離，制備C-dots產率高，具有明顯的優勢。電化學法通過控制有機小分子碳化的電極電位和電流密度，可實現C-dots的“自下而上”可控制備，具有成本低、操作簡便、反應條件溫和，C-dots產率高，對環境破壞較小等優點[12，23]。WANG等[13]在室溫（25 ℃）下，以甘氨酸為碳源，在NH4OH水溶液中，對2個Pt電極之間施加10 V碳化2 h，使甘氨酸發生電化學反應，形成具紫外光激發下發出淡黃色熒光的C-dots。目前，采用電化學碳化方法分別以多種有機小分子為碳源成功制備C-dots[12-14]，但采用常見且價格低廉的葡萄糖為碳源制備具有功能化熒光的C-dots鮮見報道。

氯霉素作為一種抑菌性廣譜抗生素，對革蘭氏陰性菌及革蘭氏陽性菌均有抗菌作用，常用于治療傷寒，副傷寒和厭氧菌感染，也可用于敏感微生物所致的各種感染性疾病的治療。因其對骨髓造血機能具有嚴重的抑制作用，現已對其臨床應用做出嚴格控制并將其被列入食品動物中禁止使用的藥品及其他化合物清單[24]。因此，建立一種快速、準確、簡便的氯霉素含量測定方法具有非常重要的意義。高效液相色譜法、電泳法、高效液相色譜-質譜聯用、酶聯免疫法是傳統的氯霉素檢測方法，這些方法耗費時間長、儀器昂貴、專業要求高，并需要復雜的樣品前處理過程，對于氯霉素檢測實際應用效率低，不適用于氯霉素快速現場檢測[25-26]。

4結論

1）通過電化學碳化葡萄糖的方法成功制備C-dots，這種制備方法操作簡便、原料易得、成本低、效率高。所制備的C-dots在紫外光的激發下發射藍色熒光，且具有良好的熒光性能以及光學穩定性。

2）基于氯霉素對C-dots熒光（激發/發射波長分別為345/450 nm）的猝滅作用（C-dots無需進一步化學修飾），所制備的C-dots可作為一種免標記的熒光探針用于氯霉素檢測，氯霉素熒光傳感器的檢測線性范圍為0.1～5.0 mmol/L，檢測限為0.016 mmol/L，該檢測方法快速、靈敏、選擇性好。

3）采用“自下而上”的電化學法，以葡萄糖為碳源制備C-dots研制熒光傳感器，并初步應用于氯霉素含量的檢測，為C-dots用于熒光傳感檢測藥物分子提供理論依據，為實現氯霉素檢測提供參考。

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