姜黃素聯合富硒酵母對小鼠急性酒精性肝損傷的保護作用

梁嬋華?莫麗?田重陽?唐玉涵

摘 要：目的：探討姜黃素聯合富硒酵母對急性酒精性肝損傷的保護作用。方法：將60只C57B6L/J小鼠隨機分為空白組、模型組、姜黃素組（33.33 mg·kg-1 bw）、富硒酵母組（7.50 mg·kg-1 bw）和聯合組（姜黃素33.33 mg·kg-1 bw+富硒酵母7.50 mg·kg-1 bw），每組12只；干預30 d后，一次性灌胃50%乙醇溶液（12 mL·kg-1 bw）建立急性酒精性肝損傷模型；觀察小鼠體重、攝食、行為變化；檢測小鼠肝臟指數與丙二醛（Malondialdehyde，MDA）、還原型谷胱甘肽（Glutathione，GSH）和甘油三酯（Triglyceride，TG）水平；油紅染色觀察小鼠肝臟組織病理學變化。結果：與空白組比較，模型組小鼠表現出肝臟腫大、肝細胞中脂滴大量堆積病理損傷，肝臟組織MDA和TG水平顯著升高（P＜0.05）；姜黃素聯合富硒酵母能顯著降低小鼠肝臟中MDA和TG表達，提高GSH水平（P＜0.05），減輕小鼠肝臟脂肪沉積。結論：姜黃素聯合富硒酵母能夠改善急性酒精灌胃誘導的肝臟脂質異常堆積，減輕氧化應激水平，對急性酒精性肝損傷具有良好的保護作用。

關鍵詞：姜黃素；富硒酵母；急性酒精性肝損傷

Protective Effect of Curcumin and Selenium-Rich Yeast on Acute Alcoholic Hepatic Injury in Mice

Abstract： Objective： Exploring the protective effect of curcumin combined with selenium-rich yeast on acute alcoholic liver injury. Method： 60 C57B6L/J mice were randomly divided into blank group， model group， curcumin group （33.33 mg·kg-1 bw）， selenium-rich yeast group （7.50 mg·kg-1 bw） and combination group （curcumin?33.33 mg·kg-1 bw+selenium-rich yeast 7.50 mg·kg-1 bw）， 12 mice in each group; 30 days after the intervention， a model of acute alcoholic liver injury was established by one-time gavage 50% ethanol solution （12 mL·kg-1 bw）; the weight， feeding and behavior changes of mice were observed; liver index and the levels of malondialdehyde （MDA）， glutathione （GSH） and triglyceride （TG） were detected， and the histopathological changes of the liver were observed by oil red staining. Result： Compared to control group， the model mice showed liver enlargement， massive accumulation of lipid droplets in liver cells， and significantly increased MDA and TG levels （P＜0.05） in liver tissues， while curcumin combined with selenium-rich yeast could significantly reduce the expression of MDA and TG in the liver， increase the level of GSH （P＜0.05）， and reduce the fat deposition in the liver. Conclusion： Curcumin combined with selenium-rich yeast can improve abnormal accumulation of liver lipids induced by acute alcohol gavage， reduce the level of oxidative stress， and have a good protective effect against acute alcoholic liver injury.

Keywords： curcumin; selenium-rich yeast; acute alcoholic liver injury

酒精性肝?。ˋlcoholic Liver Disease，ALD）是由于長期大量攝入酒精引起的一系列肝臟疾病，包括以甘油三酯積聚為特征的酒精性脂肪肝，以肝細胞損傷、氣球樣變、炎癥為主要病理改變的酒精性慢性肝炎，最終發展為肝硬化和肝細胞癌[1]。隨著居民消費水平的不斷提高，酒精的消費量不斷增加，世界衛生組織報告，全世界每年有300萬人因過度攝入酒精而死亡，有害使用酒精分別占全球男性和女性疾病負擔的7.1%和2.2%[2]。目前，酒精性肝損傷的治療方法主要為營養支持和對癥治療，但長期用藥會帶來不良副作用。因此，需要探尋有效預防和治療酒精誘導肝損傷的方法。

姜黃素（Curcumin）是一種從姜黃根莖中提取，具有二酮結構的天然多酚化合物[3]。近年來研究發現，姜黃素具有抗氧化、抗炎、免疫調節、降血糖、保護急性酒精性肝損傷[4]和改善非酒精性脂肪肝病等生物學和藥理學作用[3]。硒（Selenium，Se）是人體必需的微量元素，是谷胱甘肽過氧化物酶或硫氧蛋白還原酶等多種酶的輔因子。與無機硒相比，硒蛋氨酸和硒半胱氨酸等有機硒在人體中生物利用率更高[5]。富硒酵母則是利用酵母將無機硒轉化為利用率更高的有機硒[6]。此外，研究結果表明，富硒酵母具有抗癌[7]、保護慢性肝損傷[8]、改善脂質代謝紊亂[9]和促進骨骼健康[10]等生理作用。但姜黃素與富硒酵母對酒精性肝病的保護作用報道較少。程金來等[11]發現一次性大劑量酒精灌胃會造成小鼠急性酒精性肝損傷，因此，本文根據《保健食品檢驗與評價技術規范》（2022版）建立小鼠模型，通過觀察姜黃素聯合富硒酵母對急性酒精灌胃誘導肝損傷小鼠脂質沉積及氧化應激的影響效果，探討其保護肝臟的作用，為研發安全有效的護肝產品提供科學的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

富硒酵母（批號：20211231026）、姜黃提取物（姜黃素含量95%，批號：J220224），安琪酵母股份有限公司；甘油三酯（Triglyceride，TG）測定試劑盒（貨號：A110-1-1）、丙二醛（Malondialdehyde，MDA）測定試劑盒（貨號：A003-1-2），南京建成生物有限公司；還原型谷胱甘肽（Glutathione，GSH）和氧化型谷胱甘肽（Oxidized Glutathione Disulfide，GSSG）檢測試劑盒（貨號：S0053）、BCA蛋白濃度測定試劑盒（貨號：P0010），碧云天生物技術研究所。

1.2 儀器與設備

電子天平，Sartorious公司；多功能酶標儀，BioTek公司；5810R低溫高速離心機，Eppendorf公司；熒光倒置顯微鏡，OLYMPUS公司；渦旋混合儀，上海滬西分析儀器廠；恒溫水浴鍋，常州澳華儀器有限公司；恒溫培養箱，SANYO 公司；KZ-III研磨儀經濟型，天津賽維爾公司。

1.3 實驗動物

60只SPF級C57BL/6J雄性成年小鼠，體重18～20 g（湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，許可證號為SCXK<湘>2019-0004），于華中科技大學同濟醫學院農藥毒理研究中心飼養（實驗動物設施許可證號：SYXK（鄂）2019-0046）。環境溫度（24±1）℃，相對濕度55%～75%。

1.4 實驗方法

1.4.1 動物實驗分組

所有小鼠經適應性飼養1周后，依照體重隨機分為5組（12只/組）：空白組對照組、模型對照組、姜黃素組（姜黃素33.33 mg·kg-1 bw）、富硒酵母組（富硒酵母7.50 mg·kg-1 bw）、聯合組（姜黃素33.33 mg·kg-1 bw+富硒酵母7.50 mg·kg-1 bw）。

1.4.2 動物實驗飼養

實驗小鼠每日經口灌胃給予姜黃素、富硒酵母和姜黃素與富硒酵母混合溶液，空白組和模型組灌胃蒸餾水，連續灌胃30 d。小鼠均采用標準飼養環境，自由攝食飲水。每天觀察動物攝食、飲水、活動和一般情況，每周稱重2次，按照體重調整受試樣品的灌胃劑量。小鼠急性酒精性肝損傷模型于實驗第30 d進行，除空白對照組外，其余小鼠給予50%分析純乙醇（無水乙醇與蒸餾水為1∶1稀釋）一次性灌胃，灌胃量為12 mL·kg-1 bw，空白對照組給予等量蒸餾水。禁食不禁水16 h后處死動物，取材進行各項生化檢測及病理組織學檢查。

1.4.3 肝臟生化指標檢測

取100 mg肝組織，加入900 μL PBS，振動研磨，充分研磨后，以10 000×g離心10 min，取上清，通過生化試劑盒測定MDA、TG及GSH的含量。

1.4.4 肝臟組織病理學觀察

肝臟油紅O染色觀察小鼠肝臟脂肪沉積，取部分經固定、脫水的肝臟組織于包埋機進行包埋，制備冰凍切片，進行油紅染色，并將染色片置于光學顯微鏡下觀察肝臟組織中脂滴的數量與分布面積。對肝臟組織染色情況進行脂質沉積評分，細則如下。①肝細胞內脂滴數量稀少、散在分布，則計0分；②肝臟組織中含有脂滴的肝細胞數量不超過肝臟組織面積的1/4則計1分；③不超過肝臟組織面積的1/2則計2分；④不超過肝臟組織面積的3/4則計3分；⑤整個肝臟組織幾乎充滿脂滴則計4分。

1.5 統計學方法

采用SPSS 20.0統計軟件進行數據處理，計量資料以均數±標準差表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05時認為差異有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 姜黃素聯合富硒酵母對急性酒精性肝損傷小鼠體重和臟器的影響

由表1可知，各組小鼠的初始體重均無顯著差異（P＞0.05）。實驗期間小鼠進食、飲水、活動正常，小鼠體重均有所增長，但各組小鼠最終體重差異均無統計學意義（P＞0.05）。結果顯示，與空白組相比，模型組小鼠肝臟指數（肝體比）顯著增加（P＜0.05）。與模型組相比，聯合組小鼠肝臟指數降低3.6%，但差異無統計學意義。

2.2 姜黃素聯合富硒酵母對急性酒精性肝損傷小鼠肝臟氧化應激的影響

由圖1可知，一次性大劑量酒精灌胃導致肝臟氧化應激的發生，模型組小鼠肝臟的MDA水平顯著高于空白組（P＜0.05）。與模型組相比，姜黃素組、富硒酵母組、聯合組小鼠肝臟中MDA水平分別顯著降低了26.5%、35.3%和30.9%（P＜0.05）。相比于空白組，模型組小鼠肝臟組織中GSH水平有所上升，但無統計學差異。富硒酵母組、姜黃素組和聯合組小鼠肝臟的GSH水平較模型組均顯著升高（P＜0.05），其中聯合組升高了25.1%。

2.3 姜黃素聯合富硒酵母對急性酒精性肝損傷小鼠肝臟TG水平的影響

由圖2可知，急性酒精性肝損傷模型組小鼠肝臟TG水平較空白組顯著升高（P＜0.05）。與模型組相比，聯合組小鼠肝臟中TG水平顯著降低了30.6%（P＜0.05）。

2.4 姜黃素聯合富硒酵母對急性酒精性肝損傷小鼠肝臟脂質沉積的影響

觀察油紅O染色結果發現，空白組小鼠肝細胞中散在少量、小體積、分布均勻的小脂滴。然而，模型組小鼠可以看到肝細胞內充滿大量彌漫性、大小不一的橘紅色脂滴，且比空白組體積增大，數量增多。相比于模型組，姜黃素組、富硒酵母組及聯合組小鼠肝細胞內脂滴數量減少，體積減小，其中姜黃素與富硒酵母聯合干預對急性酒精誘導小鼠肝臟脂質沉積改善效果最佳，見圖3。每組取5只小鼠進行病理評分，對各組小鼠肝臟組織脂質沉積情況進行評分，結果如表2所示，與空白組相比，模型組小鼠肝臟病理得分增加，脂肪面積占比顯著升高（P＜0.05）。各組小鼠肝臟病理得分較模型組均有所下降，姜黃素組、富硒酵母組和聯合組脂肪面積占比較模型組顯著降低了50.6%、39.7%和52.9%（P＜0.05）。

3 結論與討論

大量飲酒能夠增加超重、肥胖、非酒精性脂肪肝相關肝硬化的肝癌風險，已成為疾病、殘疾和死亡的重要因素[12]。本實驗按照《保健食品檢驗與評價技術規范（2022版）》要求，姜黃素、富硒酵母單一及聯合干預30 d后一次性急性灌胃50%乙醇溶液，觀察到單一藥物和聯合藥物對檢測指標有不同程度的改善效果，其中姜黃素聯合富硒酵母干預對小鼠肝損傷的改善效果最佳。

肝臟是乙醇毒性的主要靶器官，乙醇能在肝細胞中反應代謝產生活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）和具有肝毒性的乙醛，乙醛能與DNA和蛋白質反應，從而形成誘導肝細胞損傷的加合物[13]。酒精性肝病的發病機制涉及脂肪堆積、炎癥、氧化應激和肝星狀細胞刺激的纖維化等病理進程。氧化應激是有害物質刺激機體時，抗氧化系統清除氧化物能力遠遠低于ROS產生程度，導致氧化系統與抗氧化防御系統平衡紊亂[14]。當ROS過量時，內源性ROS清除劑能夠中和部分自由基，但抗氧化劑被耗盡后，細胞膜與ROS結合，促進MDA等脂質過氧化物產生，導致細胞脂質、蛋白質和DNA等大分子損傷[15]。因此，MDA水平與氧化應激程度密切相關，MDA水平越高，則表明機體氧化損傷程度越嚴重。葉敏貞等[16]研究表明，小鼠急性酒精灌胃后，肝臟組織中MDA水平顯著升高，同時抗氧化劑水平顯著降低，提示機體處于氧化系統與抗氧化系統失衡的氧化應激狀態，從而促進小鼠急性肝損傷的發生發展。還原型谷胱甘肽是一種非酶抗氧化劑，其主要活性基團巰基可以與ROS自由基結合，從而降低氧化水平和炎癥損傷[17]。然而，研究發現有害物質刺激動物在短時間內肝臟、腎臟、睪丸等組織會出現GSH應激性升高[18-19]。楊柳等[20]研究結果也表明小鼠急性酒精灌胃48 h后肝臟中GSH水平回升，可能是機體自我修復的作用。因此，本研究中模型組小鼠肝臟GSH水平升高，可能與GSH水平應激性升高有關。乙醇氧化生成物在輔因子NAD+作用下產生NADH，從而降低NAD+與NADH的比率（NAD+/NADH）。NAD+/NADH比率降低能夠通過減少脂肪酸氧化和增強脂肪酸合成促進肝臟中脂肪堆積[21]。本研究結果顯示，小鼠一次性攝入大劑量酒精16 h后，模型組小鼠肝臟氧化還原狀態失衡，脂肪異常聚集。與模型組相比，聯合組小鼠肝臟MDA和TG水平下降，GSH表達升高，脂滴數量明顯減少，表明姜黃素與富硒酵母聯合干預能夠減輕肝臟氧化損傷，改善脂肪堆積病理形態。

姜黃是一種藥食同源植物，其主要活性物質姜黃素具有多種生理作用，但姜黃素含量少且生物利用度低[22]。近年來，天然產物和必需微量元素聯合作為藥物和保健食品開發受到越來越多的關注。KUMARI等[23]研究發現姜黃素負載硒納米顆粒能夠促進HTC116細胞周期停滯和凋亡，此外，降低了EAC荷瘤小鼠的腫瘤負荷并延長其存活時間。AL-DOSSARI等[24]研究報道姜黃素和硒聯合干預7 d可以通過抑制炎癥和氧化應激反應預防脂多糖或雙氯芬酸誘導的肝臟損傷。也有研究發現姜黃素與硒聯合給藥能夠增強機體抗氧化活性、減輕氧化應激水平，從而抑制CCl4誘導小鼠肝細胞癌的發生發展[25]。因此，本研究采用姜黃素天然產物與富硒酵母聯合干預，觀察到其聯合作用能夠預防保護急性酒精性肝損傷。

綜上所述，姜黃素聯合富硒酵母具有預防保護急性酒精性肝損傷的應用前景。本研究發現姜黃素聯合富硒酵母能有效抑制肝臟腫大，降低肝臟MDA和TG水平，減少肝細胞脂滴沉積，同時上調GSH水平，提示姜黃素與富硒酵母聯合可能通過減輕氧化應激水平和緩解脂質堆積，從而保護酒精誘導的急性肝損傷，其中作用的具體機制需要更深入研究。

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