Caspr敲除在蛛網膜下腔出血早期腦損傷機制的實驗研究

鄒炎 張冰濤 簡瑤 周曉明 吳琪 陳姝娟 張鑫

【摘要】目的探討黏連蛋白相關蛋白（Caspr）敲除對小鼠蛛網膜下腔出血（SAH）后早期腦損傷（EBI）的影響及其可能的作用機制。方法采用C57BL/6小鼠及Caspr敲除（Caspr+/-）小鼠，共分為4組：SAH模型組、假手術組、Caspr+/-+SAH模型組和Caspr+/-組，采用視交叉前池注血法建立SAH模型。SAH發生24 h后進行神經功能評分和腦水腫檢測。采用Western Blot和ELISA法檢測Caspr、B淋巴細胞瘤-2基因（Bcl-2）、Bax、Caspase-1、白細胞介素1β（IL-1β）和IL-18的表達；采用TUNEL染色法觀察SAH后神經元的凋亡。結果Caspr敲除導致Bcl-2表達下降，Bax、Caspase-1、IL-1β和IL-18表達升高，促進神經元凋亡。結論Caspr敲除通過激活神經細胞凋亡加重SAH后的EBI。

【關鍵詞】Caspr；細胞凋亡；蛛網膜下腔出血；早期腦損傷

【中圖分類號】R651【文獻標志碼】A【文章編號】1672-7770（2024）01-0054-05

Contactin-associated protein knockout activate early brain injury after subarachnoid hemorrhage via apoptosis ZOU Yan， ZHANG Bingtao， JIAN Yao， et al. Department of Neurosurgery， Jinling Hospital， Affiliated Hospital of Medical School， Nanjing University， Nanjing 210002， China

Corresponding author： ZHANG Xin

Abstract： ObjectiveTo explore the effect of contactin-associated protein（Caspr） knockout on early brain injury（EBI） after subarachnoid hemorrhage（SAH） in mice and its possible mechanism of action. MethodsC57BL/7 and Caspr+/- mice were randomly divided into four groups including sham group， SAH model group， Caspr+/- group and Caspr+/-+SAH group. SAH model was established by stereotactic injection of autologous blood into the optic chiasm cistern. Neurological score and brain edema was performed at 24 hours after SAH. The expressions of Caspr， B-cell lymphoma-2（Bcl-2）， Bax， Caspase-1， interleukin-1β（IL-1β） and IL-18 were detected by Western blot and ELISA. Neuronal apoptosis after SAH was observed by TUNEL staining. Result Caspr knockout decreased Bcl-2 expression， increased the expression of Bax， Caspase-1， IL-1β and IL-18， and upregulated neuronal apoptosis. ConclusionCaspr Knockout can aggravate the EBI after SAH via activating neuronal apoptosis.

Key words： Caspr; cell apoptosis; subarachnoid hemorrhage; early brain injury

基金項目：國家自然科學基金面上項目（82071328）；江蘇省自然科學基金面上項目（BK20191231）；東部戰區總醫院院內課題項目（YYBJ2021041）

作者單位：210002 南京，南京大學醫學院附屬金陵醫院神經外科（鄒炎，張冰濤，周曉明，吳琪，陳姝娟，張鑫）；南京中醫藥大學金陵臨床醫學院（簡瑤）

通信作者：張鑫

蛛網膜下腔出血（subarachnoid hemorrhage，SAH）是一種高致殘率、高死亡率的疾病，占腦卒中發病率的3.1%，住院期間致殘、致死率的20.6%，最常見的病因是顱內動脈瘤破裂［1-3］。SAH的病理過程可分為早期腦損傷（early brain injury，EBI）和遲發性腦損傷（delay brain injury，DBI）。EBI是指SAH發生72 h內發生的一系列病理生理變化，越來越多的研究表明，EBI涉及首次出血到腦血管痙攣發生前這一段時間內腦組織的一系列病理生理改變，包括血腦屏障破壞、腦水腫、氧化應激、神經炎癥、細胞凋亡等，其中最終的改變之一是神經細胞內抗凋亡因子表達下降，促凋亡因子表達上升，導致細胞凋亡水平反應性上升，進一步導致神經細胞死亡，最終影響SAH患者的預后［3-4］。因此，進一步探究調控神經細胞凋亡的機制對于減輕SAH后EBI具有重要意義。

黏連蛋白相關蛋白（contactin-associated protein，Caspr）家族包括5個成員，Caspr作為家族中最早被發現的細胞黏連蛋白，主要位于神經元郎飛結旁，與位于軸膜端的黏連蛋白1（contactin-1，CNTN1）以及NF155形成復合物，維持髓鞘與軸突間結構［5-9］。研究表明，在阿爾茨海默癥小鼠中，Caspr分布在淀粉樣沉淀周圍，與淀粉樣前體蛋白（amyloid precursor protein，APP）結合同時下調APP表達，同時過表達Caspr可通過抑制內源性凋亡水平升高來減輕Aβ42對于神經元的細胞毒性［10-11］。然而到目前為止，還沒有研究表明Caspr表達改變對于SAH后病理生理過程的作用。本研究旨在探討Caspr敲除對于SAH的影響以及對于細胞凋亡的關系，以期探討Caspr在SAH后EBI中的作用。

1材料與方法

1.1實驗材料及儀器TUNEL染色試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）；mouse IL-1β、mouse IL-18 ELISA試劑盒（武漢愛博泰克生物科技有限公司）；B淋巴細胞瘤-2基因（Bcl-2）、Bax、Caspase-1、白細胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）、IL-18抗體（武漢愛博泰克生物科技有限公司）；Caspr抗體（美國Cell Signaling Technology公司）；二抗（武漢賽維爾生物科技有限公司）；熒光顯微鏡（德國卡爾蔡司股份公司）；酶標儀（美國thermo fisher公司）；Bio-Rad蛋白電泳儀、轉膜儀、凝膠成像儀（美國伯樂公司）。

1.2實驗動物SPF級雄性C57BL/6小鼠，體質量為25～30 g，購自集萃藥康生物科技公司，實驗動物生產許可證號：SCXK（蘇）2020-0004。SPF級雄性Caspr+/-小鼠，體質量為25～30 g，由蘇州大學神經科學研究所提供。將實驗動物飼養于恒溫室內，每12 h光暗交替，實驗前自由進水進食。實驗過程嚴格按照“國家衛生研究所實驗室動物護理和使用指南”標準進行。

1.3模型建立采用Sabri的小鼠視交叉注血方法建立SAH模型［12］，術后24 h，用質量分數1%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）腹腔注射麻醉實驗小鼠，固定后開胸并迅速向左心室置入輸液針，剪開右心耳，用輸液器灌注生理鹽水，待右心房流出液為清亮及肝臟、肺臟顏色發白后停止灌注。后迅速斷頭取腦，剝離腦組織，選取雙側顳葉為標本置于液氮保存。

采用相同方法造模后24 h，將實驗小鼠用質量分數1%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）腹腔注射麻醉，固定后開胸并迅速向左心室置入輸液針，剪開右心耳，用輸液器灌注生理鹽水，待右心房流出液為清亮及肝臟、肺臟顏色發白后停止灌注。用4%多聚甲醛20 mL灌注后斷頭取腦，剝離腦組織，取全腦置于4%多聚甲醛中固定。

1.4死亡率和神經功能缺失評分SAH造模完成后24 h統計各組小鼠死亡率。采用改良的Garcia評分測定神經功能缺損程度，包括六項內容：自發活動（0～3分）、前爪伸展（0～3分）、攀爬（1～3分）、身體感覺（1～3分）、胡須觸碰反應（1～3分），評分越低，神經功能損傷越嚴重［13］。

1.5平衡木實驗每組小鼠隨機取6只，成功造模成功24 h后，在安靜適宜的環境里，小鼠被放置于平衡木中央。實驗結果的評分標準見參考文獻［14］。每只小鼠測試3次，每次1 min，間隔1 min，取三次結果平均值。

1.6腦組織含水量測定每組小鼠隨機取6只，成功造模成功24 h后，將完整小鼠腦組織快速取出，沖洗殘留血跡并吸干水分，稱量腦組織濕重（m濕重）后，用烘箱持續處理72 h，稱量其干重（m干重），按照公式計算腦含水量：腦含水量（%）=（m濕重-m干重）/m濕重×100%［15］。

1.7Western Blot分析每組小鼠隨機選取6只，SAH造模24 h后，取顳葉腦組織加入1 mL裂解液，超聲破碎儀處理3次，每次5 s，4 ℃靜置45 min，12 000 r·min-1離心10 min取上清液。采用BCA法測定各組蛋白濃度，加入5×loading buffer，95 ℃加熱煮沸5 min，使用SDS-PAGE進行凝膠電泳。每孔上樣量20 μg，100 V電泳2 h，300 mA轉膜100 min；質量分數5%脫脂奶粉封閉1 h，一抗4 ℃孵育過夜；1∶5 000稀釋二抗，室溫孵育2 h，采用ECL顯影液檢測。

1.8TUNEL染色每組小鼠隨機選取6只，成功造模24 h后，麻醉，生理鹽水灌流，多聚甲醛灌注，取腦組織制作冰凍切片，層厚12 mm。PBS洗滌3次，滴加TUNEL檢測液，37 ℃避光孵育1 h。PBS清洗3次，加含DAPI封片劑，顯微鏡下觀察。

1.9ELISA檢測每組動物隨機選擇6只，造模成功24 h后，取動脈血，按照ELISA說明書進行操作。

1.10統計學處理Graphpad Prism 9.0軟件進行統計學分析，實驗數據以均值±標準差（x±s）表示。均采用單因素方差分析進行比較，以P＜0.05認為差異有統計學意義。

2結果

2.1Caspr敲除加重SAH后EBI與SAH組術后24 h小鼠死亡率比較，Caspr敲除組的SAH后24 h死亡率明顯增加（圖1A）。而對SAH術后24 h的小鼠進行神經行為學評分，結果表明，SAH組神經行為學評分顯著降低，神經損傷嚴重，而Caspr敲除后顯著降低神經行為學評分，神經功能進一步損傷，提示了Caspr敲除加重了SAH發生后的EBI（圖1B、C）。進一步檢測了腦水腫的變化，發現與SAH模型組相比，Caspr敲除后進一步增加了腦含水量，提示Caspr敲除加重了腦血管屏障的破壞（圖1D）。

2.2Caspr敲除對于SAH后凋亡相關蛋白表達的影響之前的研究表明，細胞凋亡在SAH后EBI的病理生理機制中起到了重要作用，而Bcl-2家族抗凋亡蛋白Bcl-2與促凋亡蛋白Bax之間的平衡被認為是維系細胞存活或者誘導死亡的關鍵。如圖2所示，與對照組相比，SAH組Bcl-2表達下降，Bax表達升高，進一步促進Caspase-1表達升高，Caspr敲除后，Bcl-2表達進一步下降，Bax進一步升高，Caspase-1表達進一步升高，證實SAH發生后細胞凋亡水平增加，而Caspr敲除進一步加重了細胞凋亡。

2.3Caspr敲除上調SAH后IL-1β和IL-18的表達與對照組相比，SAH組IL-1β和IL-18蛋白水平顯著增加，而Caspr敲除組IL-1β和IL-18蛋白水平進一步增加（圖3A-C）。ELISA檢測小鼠動脈血IL-1β和IL-18得到類似結果（圖3D、E）。

2.4Caspr敲除促進SAH后神經元凋亡細胞凋亡是SAH后EBI的主要表現，因此本研究采用TUNEL染色的方法檢測Caspr敲除后神經元細胞凋亡水平的改變。與對照組相比，SAH組TUNEL陽性細胞數目增加，而Caspr敲除后TUNEL陽性細胞數目明顯增加（圖4）。上述結果表明，Caspr敲除明顯促進了神經元細胞凋亡的發生。

3討論

EBI目前被認為是導致SAH患者死亡和影響預后的主要原因。EBI的病理機制涉及神經炎癥、細胞自噬、氧化應激等多個方面，而細胞凋亡在EBI中起到了重要作用［16-18］。在SAH后，內源性凋亡途徑與腦損傷和神經功能障礙密切相關。在SAH后的細胞凋亡中，Bcl-2/Bax平衡的失調受到廣泛關注［19］。維持Bcl-2/Bax平衡在SAH急性期具有促進神經元存活的作用，對于改善SAH發生后的死亡和不良預后具有重要的作用。

Caspr作為黏連蛋白相關蛋白家族中最早被發現的細胞黏連蛋白，主要位于神經元郎飛結旁，通過與CNTN1以及NF155形成復合物，維持髓鞘與軸突間結構，進而分割郎飛結區的電壓門控鈉通道（Nav1.6）與近結區的電壓門控鉀通道（Kv1.1/1.2/1.4/1.6），保證神經沖動的跳躍式傳導［20］。最近的研究表明，Caspr在阿爾茨海默癥的病理過程中具有神經保護作用。Caspr過表達可以通過抑制淀粉樣斑塊形成來減緩阿爾茨海默癥的病理進展。同時，在體外實驗中，Caspr過表達可通過抗凋亡作用，減輕Aβ42對于神經元的毒性作用。然而，Caspr在SAH中是否具有類似的保護作用仍有待進一步闡明。本研究為了驗證Caspr對SAH后EBI的作用，首先對神經功能評分和腦水腫進行檢測。結果發現對照組小鼠SAH發生后神經功能評分下降，發生明顯腦水腫，而Caspr敲除小鼠發生SAH后的腦含水量更高，神經行為學評分更低，神經功能與對照組相比受損更加明顯，說明Caspr敲除小鼠SAH后EBI更加明顯。為了進一步探究Caspr敲除后加重SAH后EBI的作用機制，本研究對Bcl-2、Bax、Caspase-1、IL-1β和IL-18表達量進行了測定，結果提示與對照組小鼠相比，Caspr敲除小鼠發生SAH后腦組織中Bcl-2表達降低，Bax、Caspase-1蛋白表達增加；而腦組織和血中的IL-1β和IL-18表達進一步增加；同時采用了Tunel染色的方式，可以觀察到SAH后對照組小鼠神經元發生了凋亡，而Caspr敲除小鼠神經元凋亡更加明顯，提示Caspr敲除后加重SAH導致的神經元凋亡。

綜上所述，Caspr敲除后可促進SAH后的細胞凋亡，進一步加重SAH后的EBI。Caspr可能是SAH后EBI的關鍵靶點，維持或者升高Caspr表達水平可能為改善SAH后的EBI提供一種有效的治療策略。本研究也存在一定的局限性，首先只對神經凋亡和相關炎癥因子表達進行了研究，仍需要進一步研究證實Caspr導致細胞凋亡發生的具體信號通路調控機制。其次，本研究發現Caspr敲除導致腦含水量顯著上升，提示Caspr參與了血腦屏障調控，但是具體機制仍需要進一步研究。同時雖然本研究證實了Caspr敲除促進了SAH后EBI，但是過表達Caspr是否可以減輕SAH后的EBI，甚至進一步改善神經功能，仍需要進一步研究證實。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

［參 考 ?文 ?獻］

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（收稿2023-05-02修回2023-05-27）