miR-652-3p通過靶向Nptn抑制膠質母細胞瘤的增殖和遷移

胥敏 陳正樓 王云江 火旭其 張新化 王宏盛

【摘要】目的探討miR-652-3p對膠質母細胞瘤（GAM）增殖和遷移的影響。方法用miR-652-3p模擬物轉染膠質母細胞系C6和U87，然后分別通過CCK8、細胞流式、EdU、Transwell和劃痕實驗研究miR-652-3p對細胞增殖和遷移的影響。利用實時定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）、蛋白質免疫印跡（Western Blot）和雙熒光素酶報告基因實驗檢測miR-652-3p與Neuroplastin（Nptn） 的互作關系。通過CCK8、細胞流式、EdU、Transwell和劃痕實驗研究Nptn對細胞增殖和遷移的影響。結果miR-652-3p的過表達可以抑制C6和U87細胞的增殖和遷移；雙熒光素酶報告基因實驗結果表明miR-652-3p可以與Nptn結合，Nptn表達水平受到miR-652-3p水平的影響；干擾Nptn的表達可以抑制C6和U87細胞的增殖和遷移。結論miR-652-3p通過靶向Nptn抑制GBM的增殖和遷移。

【關鍵詞】miR-652-3p；Nptn；膠質母細胞瘤；增殖；遷移

【中圖分類號】R739.41【文獻標志碼】A【文章編號】1672-7770（2024）01-0043-07

miR-652-3p suppresses glioblastoma proliferation and migration by targeting Nptn XU Min， CHEN Zhenglou， WANG Yunjiang， et al. Department of Neurosurgery， Yancheng Third Peoples Hospital， The Sixth Affiliated Hospital of Nantong University， Yancheng School of Clinical Medicine of Nanjing Medical University， Yancheng 224002， China

Corresponding author： WANG Hongsheng

Abstract： ObjectiveTo investigate the effect of miR-652-3p on glioblastoma（GBM） cell lines. MethodsGBM C6 and U87 cell lines were transfected with miR-652-3p mimic， and then the effects of miR-652-3p on cell proliferation and migration were detected by CCK8， flow cytometry， EdU， Transwell and wound-healing assays， respectively. The interaction between miR-652-3p and neuroplastin（Nptn） was detected by quantitative real-time polymerase chain reaction（qRT-PCR）， Western blot and dual luciferase reporter gene assays. The effects of Nptn on cell proliferation and migration were investigated by CCK8， cytometry， EdU， Transwell and wound-healing assays. ResultsOverexpression of miR-652-3p inhibits the proliferation and migration of GBM cells. Nptn is a functional target of miR-652-3p. Interfering with the expression of Nptn inhibits the proliferation and migration of GBM cells. ConclusionmiR-652-3p suppresses GBM proliferation and migration by targeting Nptn.

Key words： miR-652-3p； Nptn； glioblastoma； proliferation； migration

基金項目：國家自然科學基金資助項目（31171038）；江蘇醫藥職業學院臨床學院專項科研發展基金課題項目（20219103，20229106）

作者單位：224002 鹽城，鹽城市第三人民醫院神經外科，南通大學第六附屬醫院，南京醫科大學鹽城臨床醫學院

通信作者：王宏盛

膠質母細胞瘤（glioblastoma，GBM） 是成年人中最常見的原發性腦部腫瘤，至今無治愈方法，其2年和5年生存率分別為16%和5%［1］。目前的治療方法主要包括手術切除、放療、化療和腫瘤電場治療（tumor treating fields，TTFields）等［2］，但其治療效果有限。隨著分子生物學的進步，分子靶向治療作為一種新的治療策略，已經在包括GBM在內的許多癌癥中得到了廣泛的探索［3］。值得注意的是，關于非編碼RNA參與調控GMB進展的研究正在興起，為 GBM治療提供新的思路。

微小核糖核酸（microRNAs，miRNAs）是一類高度保守的、內源性表達的小非編碼 RNA［4］。它們通過與相應靶信使RNA（messenger RNA，mRNA）的3′-非翻譯區（3′-untranslated region，3′-UTR） 直接相互作用，通過抑制mRNA翻譯或促進mRNA 降解來調節基因表達［5］。研究表明，miRNA的表達譜與癌癥類型、分期、預后，以及其他臨床變量相關聯，miRNA失調已被證明在癌癥的發生和發展中發揮重要作用［6］。

miR-652被認為子宮內膜癌［7］、非小細胞肺癌［8］、小兒急性淋巴細胞白血?。?］和胰腺癌［10］相關。然而，miR-652在GBM中作用及分子機制仍然很大程度上未知。因此，本研究旨在探討miR-652-3p對GBM增殖和遷移的影響。

1資料與方法

1.1細胞系來源C6細胞系為N-亞硝基甲脲誘導的大鼠膠質瘤克隆，U87細胞是由Ponten J等建立，源于惡性神經膠質瘤，是上皮細胞樣貼壁生長星形膠質母細胞瘤細胞，來自南通大學。

1.2主要材料與試劑DMEM/F12培養基和質量分數為0.25%胰蛋白酶購自Gibco公司。胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）購自Hyclone 公司。Lipofectamine 3000購自Invitrogen公司。CCK8購自Beyotime公司。PI/RNase Staining Buffer購自美BD公司。EdU細胞增殖試劑盒購自廣州銳博生物科技有限公司。RevertAidTM第一鏈cDNA合成試劑盒購自Fermentas公司。Fast Start Universal SYBR Green Master購自Roche公司。Dual-LuciferaseTM Reporter購自Promega公司。小鼠抗Neuroplastin（Nptn）單克隆抗體購自ThermoFisher Scientific公司（1∶500）。小鼠抗β-actin單克隆抗體購自Abcam 公司（1∶1 000）。辣根過氧化物酶綴合的山羊抗小鼠購自Pierce公司（1∶5 000）。增強化學發光試劑盒購自Amersham Bioscience公司。

1.3細胞培養取出凍存C6和U87細胞，經37 ℃水浴融化后，1 200 r/min，離心3 min后棄上清，用適當體積的完全培養基（DMEM/F-12含10% FBS）重懸細胞后放入培養瓶或培養皿，置于（37 ℃，5%CO2）培養箱中培養。miR-652-3p模擬物和陰性對照由廣州銳博生物科技有限公司合成。Ntpn siRNA和陰性對照由Thermo Fisher Scientific公司設計合成。Lipofectamine 3000用于將基因轉染到細胞中。

1.4CCK8實驗將對照和處理組的C6和U87細胞以每孔1×104個細胞的密度接種于24孔板中，每組設置4個時間點，分別為轉染后1 d， 2 d， 3 d， 4 d，每個時間點設置3個復孔。每孔加入50 μL CCK8溶液，充分混勻后于37 ℃培養箱中孵育2 h，用Synergy 2多功能微孔板檢測儀檢測450 nm處的吸光度，統計數據并分析。

1.5流式細胞術細胞分析細胞周期C6和U87細胞以每皿5×105個細胞的密度接種于100 mm的細胞培養皿中，細胞于培養箱中孵育過夜后，進行轉染，并于轉染后24 h后收取細胞。用1×PBS配制的75%的乙醇重懸細胞，置于-20 ℃， 24 h；1 200 r/min離心3 min；棄上清，1×PBS重懸細胞，1 200 r/min離心3 min；棄上清，每1×106個細胞取500 μL PI/RNase Staining Buffer重懸，室溫避光靜置30 min；使用BD FACSCalibur流式細胞儀進行細胞周期分析。

1.6EdU細胞增殖實驗C6和U87細胞以每孔2×104個細胞的密度接種于有無菌細胞爬片的24孔板中。細胞于培養箱中孵育過夜后，進行轉染，并于轉染后24 h行后續EdU細胞增殖實驗。細胞爬片經抗熒光淬滅封片液封片后可立即觀察，或于4 ℃濕盒內保存待用，使用蔡司顯微鏡拍攝圖像，Image J軟件計數細胞。

1.7Transwell轉染24 h后，將C6和U87細胞以1×104個無血清DMEM細胞密度接種在Transwell小室上層，而600 μL的完全培養基放置在下腔中。培養24 h后，用4%甲醛固定，0.1%結晶紫染色，用棉簽去除小室上表面的剩余細胞，將細胞孔板置于顯微鏡下觀察并拍照記錄。

1.8劃痕將C6細胞以密度5×105接種于細胞孔板上，并在孔板上劃線標記，然后置于37 ℃，5%CO2培養箱中過夜培養，轉染后用1 000 μL槍頭垂直于細胞孔板的進行劃線，而后繼續培養，每組設置4個時間點，分別為劃痕后0 h，24 h ， 48 h ， 72 h，將細胞孔板在不同時間段置于顯微鏡下觀察并拍照記錄。

1.9實時定量聚合酶鏈反應（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）細胞培養板中的細胞用Trizol裂解提取，總RNA按照RevertAidTM第一鏈cDNA合成試劑盒說明書將3 μg總RNA逆轉錄成cDNA。按照Fast Start Universal SYBR Green Master說明書，在StepOnePlus實時熒光定量PCR儀中進行RT-PCR，數據用GraphPad Prism 9軟件進行統計分析。實驗所用引物（Sangon公司）如下。Nptn：正向5′-AAGGAGAATG-GTGTGTTTGAGGA-3′， 反向5′-GAGGACTGTGG-AAACGGAGG-3′;Gapdh：正向5′-CCACGGCAA-GTTCAACGGCACAG-3′， 反向5′-GACGCCAGTAGA-CTCCACGACAT-3′。

1.10Western Blot用蛋白提取試劑盒提取細胞總蛋白，測定濃度后進行凝膠電泳，Bio-Rad半干轉印系統轉膜，5％脫脂奶粉將膜室溫封閉2 h，一抗孵育過夜（4 ℃）。二抗室溫孵育2 h，通過增強化學發光試劑盒進行顯像。

1.11雙熒光素酶報告基因實驗合成并克隆了預測的靶基因和突變體的3′-UTR 靶位點。C6和U87細胞種植于96孔板，并使用Lipofectamine 3000將質粒和miR-652-3p模擬物共轉染。48 h后使用Dual-LuciferaseTM Reporter分析螢火蟲和海腎螢光素酶活性。

1.12統計學分析數據以平均值±標準差（x〖DD（-*2〗-〖DD）〗±s）表示，實驗至少重復三次，用GraphPad Prism 9統計軟件分析數據，兩組間比較采用雙尾Students t檢驗，以P<0.05認為差異具有統計學意義。

2結果

2.1上調miR-652-3p抑制GBM細胞系增殖為了探索miR-652-3p在GBM發展中的生物學功能，合成了miR-652-3p模擬物和miR-NC，然后瞬時轉染到C6和 U87細胞中。CCK8實驗顯示，與miR-NC組相比，miR-652-3p組在2 d、3 d、4 d組細胞增殖顯著降低（圖1A）。流式細胞檢測結果顯示，與miR-NC組相比，miR-652-3p組S期細胞明顯減少（圖1B）。此外，miR-652-3p上調顯著降低了 EdU陽性細胞比例（圖 1C）。 因此，這些數據表明 miR-652-3p可以抑制 GBM細胞的增殖。

2.2上調miR-652-3p抑制GBM細胞系遷移為了檢測miR-652-3p對GBM細胞遷移或侵襲能力的作用，在C6和 U87細胞中過表達miR-652-3p后通過Transwell和劃痕實驗檢測細胞的遷移能力。Transwell實驗結果顯示在兩種細胞中上調miR-652-3p后穿膜的細胞數量顯著減少（圖 2A）。劃痕實驗結果顯示miR-652-3p過表達后細胞向劃痕內遷移的速度明顯減慢（圖 2B）。 這些結果表明miR-652-3p可以抑制GBM細胞的遷移或侵襲能力。

2.3Nptn是miR-652-3p的靶基因為揭示miR-652-3p調控GBM生物學行為的機制，本研究通過TargetScan在線工具預測了miR-652-3p可能的靶基因。本研究發現miR-652-3p與Nptn的3′UTR結合區域存在相互結合位點（圖3A），提示后者可能是miR-652-3p的靶基因。本研究利用qRT-PCR和Western Blot檢測了miR-652-3p對Nptn表達的調控作用。結果顯示miR-652-3p過表達后，Nptn的mRNA和蛋白水平均明顯下調（圖3B和C）。利用雙熒光素酶報告基因實驗檢測二者的相互作用，結果表明，Nptn 3′UTR野生型組的熒光素酶強度明顯下降，當3′UTR結合位點發生突變時，Nptn表達水平恢復到正常水平（圖3D）。這些結果表明miR-652-3p能夠與Nptn 3′UTR結合并抑制Nptn表達。

2.4下調Nptn表達抑制GBM細胞系增殖為了確定Nptn在GBM發展中的生物學功能，合成了Nptn小干擾片斷，以si-NC為對照，分別瞬時轉染到C6和U87細胞中。CCK8實驗顯示，與si-NC組相比，si-Nptn組在2 d，3 d和4 d組細胞增殖的數量顯著減少（圖4A）。流式細胞技術實驗結果顯示，與si-NC組相比，si-Nptn組S期細胞明顯減少（圖4B）。此外，EdU結合實驗表明下調Nptn后，EdU陽性細胞比例顯著降低（圖4C）。 因此，這些數據表明Nptn可能在GBM細胞的增殖中起促進作用。

2.5下調Nptn表達抑制GBM細胞系遷移為了明確Nptn在GBM細胞遷移或侵襲中的作用，我們在GBM細胞系C6和U87中轉染si-Nptn下調Nptn水平，利用Transwell和劃痕實驗檢測細胞的遷移能力。Transwell實驗結果顯示，下調Nptn后穿膜的C6和 U87細胞數量明顯減少（圖5A）。劃痕實驗結果顯示Nptn表達下調后細胞向劃痕內生長的能力也顯著減弱（圖5B）。這些結果表明干擾Nptn可以抑制GBM細胞的遷移或侵襲能力，提示其對GBM的細胞遷移或侵襲正向相關。

3討論

2002年已經證實miR-15和miR-16簇在慢性淋巴細胞白血病中低表達或缺失，首次表明miRNA在癌癥進展中的作用［11］。在過去的一段時間里，miRNA與幾乎所有已知的癌癥過程有關。根據靶基因，一些miRNA經常對蛋白質編碼癌基因產生負面影響，而另一些miRNA可以抑制已知的腫瘤抑制基因［12］。miRNA已成為基礎和轉化生物醫學研究的一個有趣領域，因為它們對基因表達的調控以及在身體組織和體液中的強大存在，使得它們可作為疾病的生物標志物［13］。目前，對于癌癥中miRNA的失調，還沒有確定的理論或機制?？紤]到生理系統的復雜性，可能有多種機制發揮作用，包括那些涉及miRNA生物發生成分、轉錄因子調控和miRNA鏈內突變的機制［14］。

先前的研究報道了miR-652在多種癌癥中的異常表達。Sun等［7］發現miR-652通過直接靶向RORA，激活Wnt/β-catenin信號通路，影響子宮內膜癌的進展。Yang等［15］發現骨肉瘤細胞的增殖、侵襲和遷移能力以及p-PI3K、p-Akt、基質金屬蛋白酶2（matrix metalloproteinase 2，MMP2）和MMP9的蛋白表達水平隨著miR-652表達的增強而顯著降低，而其靶基因HOXA9的過表達則逆轉了這種情況。miR-652低表達的GBM患者的總生存期短于miR-652高表達的患者。本研究分析了miR-652-3p對GBM生物學行為的影響。體外功能測定表明，上調細胞內的miR-652-3p水平可以明顯抑制GBM細胞增殖和遷移能力，表明miR-652-3p是GBM患者的潛在治療標志物。但是miR-652-3p影響GBM生物學行為的下游信號分子尚不清楚。

本研究利用TargetScan分析發現，miR-652-3p與Nptn的3′UTR區存在相互結合序列。進一步檢測發現miR-652-3p可以下調Nptn的表達。雙熒光素酶報告基因實驗表達miR-652-3p確實可以與Nptn的3′UTR區結合。說明Nptn是miR-652-3p的下游靶基因，這一結果屬首次報道。但是，Nptn在GBM的生物學行為中是否發揮作用尚不知曉。Nptn屬于細胞粘附分子家族的突觸糖蛋白神經原激酶中的一類［16］。研究表明，Nptn是長期增強和聯想記憶形成所必需的，對認知能力至關重要［17］。亦有研究發現Nptn在有遠處轉移的乳腺癌中高表達，且與腫瘤生長和血管生成顯著有關［18］。另外，Nptn在循環腫瘤細胞中也高度表達［19］。在Kovacheva等［20］的研究中發現ITGB3 敲低后，Nptn表達在MDA-MB-231乳腺癌細胞中持續下調。以上研究表明，Nptn在腫瘤的發生發展中起著重要作用，但是關于Nptn在GBM中的作用尚不清楚。

本研究利用RNA干擾技術下調GBM細胞中的Nptn水平，結果發現Nptn水平下調后GBM細胞增殖和遷移均受到顯著抑制，這一發現提示Nptn可能作為促癌基因存在，但還需要更多的實驗進一步證實。

綜上，本研究的結果表達miR-652-3p可能通過靶向Nptn抑制膠質母細胞瘤的增殖和遷移。但是，本研究仍然存在一些局限性。第一，miR-652-3p上游表達的機制需要進一步探索。第二，miR-652-3p有眾多的預測目標，是否有其他靶基因也參與miR-652-3p的作用很大程度上仍然未知。最后，Nptn在GBM進展中具體調控機制需要進一步研究。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

［參 考 ?文 ?獻］

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（收稿2023-01-03修回2023-04-05）