年齡對兒童髓母細胞瘤預后的影響及其腫瘤微環境分析

董文艷 黃進 吳碩雄

【摘要】目的分析不同年齡段髓母細胞瘤患者生存率，探討腫瘤微環境中免疫細胞浸潤對預后的影響及其與年齡的相關性，并篩選年齡相關免疫調節分子。方法對公共數據庫中的隊列進行研究，使用Kaplan-Meier曲線進行生存分析，根據年齡不同，利用MCPcounter對免疫細胞絕對豐度進行量化，同時篩選年齡相關免疫調節分子，尋找影響低齡髓母細胞瘤預后的危險因素。結果髓母細胞瘤患者的生存率隨年齡的減少而降低，0～3歲的嬰幼兒期髓母細胞瘤患者生存率在隊列所有病例中最低。嬰幼兒期患兒腫瘤微環境中的效應免疫細胞CD8+T細胞、細胞毒性淋巴細胞、中性粒細胞、B淋巴細胞顯著低于其他年齡段患兒，腫瘤相關纖維母細胞、單核細胞、內皮細胞顯著高于其他年齡段患兒。CXCR4的高表達與效應免疫細胞浸潤呈負相關，與腫瘤相關細胞呈正相關，這些免疫細胞與髓母細胞瘤預后密切相關。結論低齡引起髓母細胞瘤不良預后與CXCR4高表達介導的腫瘤微環境重塑密切相關。

【關鍵詞】兒童髓母細胞瘤；腫瘤微環境；CXCR4；免疫治療；GEO

【中圖分類號】R739.41【文獻標志碼】A【文章編號】1672-7770（2024）01-0065-07

Prognosis and tumor microenvironment analysis of pediatric medulloblastoma based on different ages DONG Wenyan， HUANG Jin， WU Shuoxiong. Department of Anesthesiology， Wuxi Childrens Hospital Affiliated to Jiangnan University， Wuxi 214023， China

Corresponding author： WU Shuoxiong

Abstract： ObjectiveTo analyze the prognosis of patients with medulloblastoma at different ages， and to explore the influence of immune cell infiltration on prognosis and the correlation with age， and screen age-related immune regulatory molecules. MethodsIn the study， cohorts from public database were studied through informatic analysis， Kaplan-meier curves were used for survival analysis， and MCPcounter was used to quantify the absolute abundance of immune cells in different ages. Meanwhile， age-related different expression genes were screened， and the effects of different expression genes on immune cell infiltration were analyzed. ResultsThe survival rate of patients aged 0-3 years was the lowest among all patients in the cohort. The number of CD8+T cells， cytotoxic lymphocytes， neutrophils and B lineage in the tumor microenvironment of infants were significantly lower than other age groups， while the number of tumor-associated fibroblasts， monocyte lineage and endothelial cells were significantly higher than other age groups. The expression of CXCR4 was negatively correlated with the infiltration of effector immune cells and positively correlated with tumor-associated cells， which were closely related to the prognosis of medulloblastoma. ConclusionThe poor prognosis of infants medulloblastoma is closely related to the remodeling of tumor microenvironment mediated by CXCR4 expression.

Key words： pediatric medulloblastoma; tumor microenvironment; CXCR4; immunotherapy; GEO

基金項目：無錫市衛生健康委青年科研項目（Q202133）

作者單位：214023 無錫，江南大學附屬兒童醫院麻醉科（董文艷，吳碩雄）；南京醫科大學附屬無錫人民醫院神經外科（黃進）

通信作者：吳碩雄

髓母細胞瘤是一種常見于兒童、惡性程度最高的中樞神經系統腫瘤，在所有兒童胚胎性腫瘤中占比約為65.8%，其中0～14歲兒童的發病率約為0.5例/10萬［1］。雖然在日益先進的醫療條件下，進行最大限度的手術切除和術后系統的放化療使髓母細胞瘤患兒生存率明顯提升，但在多種因素影響下，仍然有患兒出現復發甚至死亡。因此，對髓母細胞瘤預后的干預研究仍尤為重要。

髓母細胞瘤在細胞形態上類似胚胎期髓母細胞，具有侵襲性強、易轉移等特征，在本質上屬多基因病變，這些基因及信號通路的交互作用調節細胞癌變的啟動、侵襲轉移、復發、生存與死亡［2-3］。效應免疫細胞是機體識別和清除癌變細胞的核心組成，在抑制腫瘤生長、轉移、復發中發揮重要作用。本研究基于高通量基因表達數據庫（gene expression omnibus，GEO）中髓母細胞瘤的樣本，分析不同年齡段患兒腫瘤微環境中免疫細胞浸潤情況，并進一步篩選影響免疫浸潤的相關分子，旨在通過促進抗腫瘤免疫提高患兒生存率的探索。

1資料與方法

1.1一般資料GEO（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）數據庫是由美國國立生物技術信息中心創建的基因表達數據庫，收錄了世界各國研究機構提交的基因表達數據，包括基因芯片，高通量測序數據。本研究使用數據集GSE85217是一項由加拿大多倫多兒童醫院發起的多中心研究，測序平臺為Affimetrix Human Gene 1.1 ST Array，數據集包含763例年齡段在0～57歲的原發性髓母細胞瘤患者。本研究根據兒童髓母細胞瘤診療規范的劃分選擇0～18歲年齡段患者作為兒童進行后續分析，并定義0～3歲患兒為嬰幼兒期組，4～10歲患兒為學齡期組，10～17歲患兒為青春期組，大于18歲患兒為成年期組。下載數據集臨床資料信息后，剔除年齡性別不詳的病例后，共計有效病例716例。根據分組，對年齡、性別、分子亞型、病理亞型和轉移情況進行匯總和統計。預后采用Kaplan-Meier生存分析，繪圖和統計使用Grsaphpad Prism8。

1.2基因集富集分析和差異表達基因篩選基因集富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA）是一種基于表達矩陣來對基因進行富集的方法，其結果反映某預定義基因集在兩組間的表達變化趨勢。本研究根據程序的要求準備表達矩陣、表型數據、功能基因集（h.all.v7.5.symbols.gmt）文件，利用GSEA_4.1.0軟件對上述文件進行分析。以NES（校正富集分數）值>1和NOM P-value<0.05為標準對富集通路進行篩選分析。

患者基因表達數據預處理在R語言環境中分析，通過Affy package（v1.44.0）處理探針數據，基于穩健的多陣列平均算法對數據進行標準化處理，轉化得到基因表達譜的矩陣數據。本研究中，兩組間差異表達基因篩選使用GEO2R進行分析，以|Log2FoldChange|>1且adj.P<0.05為標準定義為差異表達基因。差異表達基因火山圖使用ggplot package繪制。

1.3免疫細胞浸潤MCPcounter是一個可以利用轉錄組數據量化8個免疫細胞和2個基質細胞絕對豐度的工具。本研究髓母細胞瘤患兒腫瘤微環境中免疫細胞浸潤情況采用MCPcounter進行分析。

1.4統計學分析統計分析使用軟件SPSS 23和Graphpad Prism8，其中三組間臨床資料比較采用χ2檢驗，生存分析采用對數秩檢驗，免疫細胞浸潤分析采用t檢驗，相關性分析采用Pearson相關性分析。以P<0.05為差異具有統計學意義。

2結果

2.1兒童髓母細胞瘤患者臨床資料716例有效病例中，0～17歲的兒童患者共計617例，根據年齡分組，有93例嬰幼兒期患兒，平均年齡為1.71歲，占有效病例的13.0%；學齡期患兒345例，平均年齡6.2歲，占有效病例的48.2%；青春期患兒179例，平均年齡12.49歲，占有效病例的25.0%。資料匯總顯示，男性患兒比例高于女性患兒，前者約為后者的2倍，但三組間性別比例沒有差異。在分型上，三組患兒的分子亞型分布具有統計學差異，其中嬰幼兒期SHH型比例最高，學齡期和青春期患兒Group4型比例最高；由于存在病理類型和轉移情況不明的病例，本研究沒有對兩個指標在三組間是否存在差異進行統計分析（表1）。

2.2低齡是兒童髓母細胞瘤的臨床不良預后因素年齡是影響腫瘤預后的重要因素，本研究隨后對三組患兒及成年期患者的生存進行分析，結果顯示，髓母細胞瘤術后生存率隨年齡的減少而降低，嬰幼兒期患兒長期生存率顯著低于青春期和成年期，學齡期患兒長期生存率則顯著低于成年期（圖1A）。

本研究對嬰幼兒期和青春期患兒的測序結果進行基因集富集分析發現，多個信號通路于嬰幼兒期髓母細胞瘤富集，其中PI3K信號通路（NES=1.49，P<0.05）和KRAS信號通路活性（圖1B，NES=1.49，P<0.05）顯著高于青春期患兒，提示PI3K和KRAS信號通路的異?；罨瘏⑴c對髓母細胞瘤術后長期生存的影響。

2.3低齡伴隨兒童髓母細胞瘤不良預后與抗腫瘤免疫低下有關上述結果顯示，低齡是兒童髓母細胞瘤的不良預后因素。低齡影響患兒對放化療的依從性和耐受性，同時也是影響機體免疫功能的重要因素。此外，PI3K異?；罨嗫蓪е旅庖吖δ苁軗p和失調，從而影響疾病的轉歸［4］。因此，本研究不同年齡段髓母細胞瘤患兒免疫浸潤情況顯示，嬰幼兒期患兒CD8+T細胞顯著低于學齡期患兒，細胞毒性淋巴細胞、中性粒細胞、B細胞顯著低于學齡期和青春期患兒，單核系細胞、內皮細胞、纖維母細胞則顯著高于學齡期和青春期患兒（圖2）；提示低齡髓母細胞瘤患兒抗腫瘤免疫力較弱，促血管生成能力強于學齡期和青春期患兒。

2.4CXCR4是介導低齡髓母細胞瘤免疫逃逸的關鍵年齡相關分子上述研究顯示，低齡確診髓母細胞瘤患兒腫瘤微環境中效應免疫細胞顯著低于其他年齡段患兒。為了探究嬰幼兒期患兒免疫低下的原因，本研究隨后對三組患兒的基因表達進行篩選。結果顯示，嬰幼兒期和學齡期患兒相比，有175個基因表達升高，91個基因表達降低；嬰幼兒期和青春期患兒相比，有203個基因表達升高，114個基因表達降低；學齡期與青春期患兒間沒有差異表達基因（圖3A）。上述實驗結果提示，PI3K通路影響髓母細胞瘤的生存預期，同時調節機體免疫應答。因此，本研究將PI3K通路的核心基因與年齡差異表達基因進行合并，結果發現，CXCR4和PRKCB可能是介導低齡髓母細胞瘤不良預后的年齡相關分子（圖3B）。此外，本研究發現與青春期患兒相比，CXCR4的配體CXCL12在嬰幼兒期的表達亦顯著升高（圖3A）。

隨后，本研究分析CXCR4對免疫細胞浸潤的影響，如圖3C所示，CXCR4的高表達與細胞毒性淋巴細胞呈強負相關，與纖維母細胞呈強正相關（|r|>0.5）；與CD8+T細胞、中性粒細胞、B淋巴細胞呈弱負相關，與內皮細胞呈弱正相關（0<|r|<0.3）；與單核系細胞呈中等程度正相關（0.3<|r|<0.5），與自然殺傷細胞沒有相關性。結果顯示，CXCR4對兒童髓母細胞瘤免疫細胞浸潤的影響與低齡髓母細胞瘤患兒腫瘤微環境結果一致?！糉L）〗〖KH-*1D〗

2.5基于CXCR4為靶點的臨床藥物治療探索CXCR4的高表達介導低齡髓母細胞瘤患兒的抗腫瘤免疫低下和不良預后。目前，已有多種CXCR4小分子抑制劑獲批上市或正在進行臨床試驗，這些抑制劑在腫瘤治療中發揮重要作用（表2）。多項研究顯示，多靶點的聯合應用可顯著增強免疫治療的效果［5］。為此，本研究繼續探索CXCR4與其他免疫治療靶點的相關性；選擇GD2、TIM3、PD-L1/PD-1、IDO1和CTLA4為研究對象，如圖4所示，兒童髓母細胞瘤中CXCR4與TIM3的表達呈中等程度正相關（0.3<|r|<0.5），與GD2、PD-L1、IDO1的表達成弱正相關，與PD-1的表達呈弱負相關（0<|r|<0.3），與CTLA4的表達沒有相關性，表明CXCR4抑制劑和TIM3單克隆抗體聯合應用具有更強的協同效應。

3討論

髓母細胞瘤是兒童最常見神經系統惡性腫瘤，在世界衛生組織神經系統腫瘤分級中被定義為惡性程度最高的Ⅳ級，總體中位生存期約為66個月，其中0～14歲患兒5年存活率約63.9%［1］。在年齡和性別分布上，髓母細胞瘤中位發病年齡在5～7歲，男性發病率（約60%）大于女性［6］。本研究參考的研究隊列中，男性患兒占比約65.5%，男女比例約為2∶1，以4～10歲患兒發病率最高，約占所有病例的48.2%，與文獻報道一致。髓母細胞瘤根據分子表型的不同被分為WNT、SHH、group 3和group 4四個亞型，其中WNT型預后較好，兒童5年生存率為95%，而group 3型在所有分子亞型中預后最差并極易轉移［7］。本研究的分析提示，不同年齡段髓母細胞瘤的分子亞型存在顯著差異，嬰幼兒期以SHH型為主，占比63.4%，而學齡期和青春期以group 4型為主，占50%以上。

影響髓母細胞瘤的預后因素有很多，包括年齡、殘余病灶大小、Chang氏分期、病理類型和分子亞型等。年齡是影響髓母細胞瘤預后的重要因素，對于小于3歲的患兒，需同時滿足殘余灶<1.5 cm2，Chang氏分期M0，病理類型為促結締組織增生型或廣泛小結節型才被歸為標危組，否則均為高危組［8］。Kohler等對神經系統腫瘤的統計亦顯示，0～1歲嬰兒髓母細胞瘤患者5年生存率約為33%，顯著低于1～4歲幼兒患者（47%）和5～14歲兒童患者（67%），提示確診年齡與預后密切相關［9］。 本研究根據年齡分組對患兒生存率進行分析，發現嬰幼兒期患兒在4個年齡段中預后最差，顯著低于成年期患者和青春期患兒。腫瘤在本質上屬多基因病變，分子生物學和遺傳學的快速發展使人們開始關注髓母細胞瘤相關的基因和信號通路改變，包括與患者預后的關系。研究顯示，NOTCH信號通路的轉錄因子ATOH1可促進SHH型髓母細胞瘤的軟腦膜播散和轉移［10］。而在group 3和group 4型髓母細胞瘤中，WIP1的過表達促進腫瘤細胞的侵襲［11］。此外，腫瘤微環境中的基質細胞及其分泌的因子也是髓母細胞瘤轉移的因素之一［12-13］。因此，本研究隨后分析低齡相關的不良預后是否與基因水平的變化相關。結果顯示，相比于青春期，PI3K和KRAS兩個信號通路的核心分子在嬰幼兒期患兒中顯著富集。KRAS信號通路在腫瘤細胞生長以及血管生成等過程中起著重要調控作用，KRAS可以通過轉錄因子Gli的激活促進胰腺癌的發生，亦可通過KRAS/YY1/ZNF322/Shh轉錄軸增強新生血管的形成［14-15］。PI3K信號通路在多種腫瘤發生中發揮關鍵作用，目前共有5種針對PI3K的小分子抑制劑被批準臨床使用，這些抑制劑通過阻斷PI3K信號通路的活化可抑制髓母細胞瘤的增殖、耐藥及遷移［16］。

PI3K信號通路不僅影響腫瘤細胞，而且參與免疫細胞的成熟、活化和遷移。研究顯示，PI3K的異?；罨档虲D8+T細胞的浸潤，上調抑制性細胞因子如IL-10、TGFβ等的表達，增強調節性T細胞、2型巨噬細胞等抑制性免疫細胞的浸潤和纖維母細胞介導的腫瘤進程［17-18］。鑒于PI3K在低齡髓母細胞瘤患兒中的影響及其與免疫微環境的相互作用，本研究對兒童髓母細胞瘤免疫浸潤進行研究。結果發現，嬰幼兒抗腫瘤免疫顯著降低，表現在CD8+T細胞、細胞毒性淋巴細胞、中性粒細胞、B細胞都顯著降低；而CD8+T細胞、細胞毒性淋巴細胞等介導的免疫應答是清除腫瘤細胞的首要因素，其功能障礙和衰竭均有利于腫瘤免疫逃逸［19］。此外，研究結果提示嬰幼兒期患兒單核系細胞、內皮細胞、纖維母細胞較學齡期和青春期患兒顯著升高。單核細胞可發育成巨噬細胞，并極化為促炎的1型巨噬細胞或抗炎的2型巨噬細胞，但2型巨噬細胞和腫瘤相關纖維母細胞通過自身及其分泌的抑制性細胞因子形成免疫屏障，進一步抵抗細胞毒性淋巴細胞的抗腫瘤效應［20］。

免疫細胞發揮功能受包括免疫檢查點在內的多種分子調控，免疫檢查點是維持免疫穩態的重要分子，但腫瘤細胞通過異常表達的共抑制分子及其相關配體，抑制免疫細胞的激活，從而逃避免疫攻擊［21］。通過以上結果得知，低齡髓母細胞瘤伴隨臨床不良預后，同時低齡患兒抗腫瘤免疫顯著降低。為尋求低齡患兒抗腫瘤免疫低下的原因，本研究分析各組患兒髓母細胞瘤基因表達情況，并篩選與PI3K信號通路相關的差異表達基因；結果顯示，CXCR4和PRKCB是PI3K信號通路相關的年齡差異表達基因。同時，本研究發現，CXCR4的表達與效應免疫細胞CD8+T細胞、細胞毒性淋巴細胞、中性粒細胞、B淋巴細胞呈負相關，而與纖維母細胞、內皮細胞和單核系細胞呈正相關，結果與低齡髓母細胞瘤免疫浸潤表型一致。CXCR4是趨化因子CXCL12的特異性受體，兩者結合促進腫瘤的生長和遷移［22］。此外，CXCL12/CXCR4促進腫瘤血管生成和誘導抑制性免疫反應。研究顯示，CXCL12/CXCR4阻礙CD8+T細胞的分化，促使巨噬細胞向2型極化，并通過其他作用幫助腫瘤逃避免疫監視［23］。

CXCR4高表達的促癌作用，讓人們意識到其作為腫瘤免疫治療靶點的可能，目前，有多項CXCR4小分子抑制劑和單克隆抗體被批準上市或正在進行臨床試驗［24］。多項研究表明，多免疫靶點的抑制可顯著增強抗腫瘤功效［25］。因此，本研究從免疫靶點間的相關性著手，探討可能的雙靶點協同作用；結果顯示，CXCR4與TIM3在表達水平正相關，與PD-1/PD-L1等靶點相關性較弱或沒有相關性，提示CXCR4抑制劑和TIM3單抗的聯合使用可協同逆轉髓母細胞瘤的抑制性免疫表型。

本研究基于兒童髓母細胞瘤的生物信息學分析表明，低齡是臨床預后的不良因素之一，這可能與CXCR4介導的效應免疫細胞浸潤降低有關；同時，本研究給出聯合雙靶點免疫治療的可行方案，以期提高兒童髓母細胞瘤的長期生存率。

利益沖突：?所有作者均聲明不存在利益沖突。

［參 考 ?文 ?獻］

［1］Ostrom QT，Cioffi G，Waite K，et al.CBTRUS statistical report：primary brain and other central nervous system tumors diagnosed in the United States in 2014—2018［J］.Neuro Oncol，2021，23（12 Suppl 2）：iii1-iii105.

［2］Archer TC，Mahoney EL，Pomeroy SL.Medulloblastoma：molecular classification-based personal therapeutics［J］.Neurotherapeutics，2017，14（2）：265-273.

［3］莊小津，黃燕炳.兒童髓母細胞瘤的分子遺傳學及臨床研究進展［J］.臨床與實驗病理學雜志，2022，38（2）：204-207.

［4］Nunes-Santos CJ，Uzel G，Rosenzweig SD.PI3K pathway defects leading to immunodeficiency and immune dysregulation［J］.J Allergy Clin Immunol，2019，143（5）：1676-1687.

［5］Zeng Y，Li BH，Liang YY，et al.Dual blockade of CXCL12-CXCR4 and PD-1-PD-L1 pathways prolongs survival of ovarian tumor-bearing mice by prevention of immunosuppression in the tumor microenvironment［J］.FASEB J，2019，33（5）：6596-6608.

［6］Quinlan A，Rizzolo D.Understanding medulloblastoma［J］.JAAPA，2017，30（10）：30-36.

［7］何曉蓉，周晉星，王陸華，等.髓母細胞瘤的分子分型及預后進展［J］.臨床與實驗病理學雜志，2018，34（2）：191-194.

［8］中華人民共和國國家衛生健康委員會.兒童髓母細胞瘤診療規范（2021年版）［J］.全科醫學臨床與教育，2021，19（7）：581-584.

［9］Kohler BA，Ward E，McCarthy BJ，et al.Annual report to the nation on the status of cancer，1975—2007，featuring tumors of the brain and other nervous system［J］.J Natl Cancer Inst，2011，103（9）：714-736.

［10］Grausam KB，Dooyema SDR，Bihannic L，et al.ATOH1 promotes leptomeningeal dissemination and metastasis of sonic hedgehog subgroup medulloblastomas［J］.Cancer Res，2017，77（14）：3766-3777.

［11］Li M，Deng YH，Zhang WM.Molecular determinants of medulloblastoma metastasis and leptomeningeal dissemination［J］.Mol Cancer Res，2021，19（5）：743-752.

［12］Garzia L，Kijima N，Morrissy AS，et al.A hematogenous route for medulloblastoma leptomeningeal metastases［J］.Cell，2018，172（5）：1050-1062.e14.

［13］Low SYY，Bte Syed Sulaiman N，Tan EEK，et al.Cerebrospinal fluid cytokines in metastatic group 3 and 4 medulloblastoma［J］.BMC Cancer，2020，20（1）：554.

［14］〖JP5〗Rajurkar M，De Jesus-Monge WE，Driscoll DR，et al.The activity of Gli transcription factors is essential for Kras-induced pancreatic tumorigenesis［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2012，109（17）：E1038-E1047.

［15］Lin CC，Kuo IY，Wu LT，et al.Dysregulated Kras/YY1/ZNF322A/Shh transcriptional axis enhances neo-angiogenesis to promote lung cancer progression［J］.Theranostics，2020，10（22）：10001-10015.

［16］Lukoseviciute M，Maier H，Poulou-Sidiropoulou E，et al.Targeting PI3K，FGFR，CDK4/6 signaling pathways together with cytostatics and radiotherapy in two medulloblastoma cell lines［J］.Front Oncol，2021，11（9）：748657.

［17］Sun P，Meng LH.Emerging roles of class I PI3K inhibitors in modulating tumor microenvironment and immunity［J］.Acta Pharmacol Sin，2020，41（11）：1395-1402.

［18］Lim EL，Okkenhaug K.Phosphoinositide 3-kinase δ is a regulatory T-cell target in cancer immunotherapy［J］.Immunology，2019，157（3）：210-218.

［19］Farhood B，Najafi M，Mortezaee K.CD8（+） cytotoxic T lymphocytes in cancer immunotherapy：a review［J］.J Cell Physiol，2019，234（6）：8509-8521.

［20］Costa A，Kieffer Y，Scholer-Dahirel A，et al.Fibroblast heterogeneity and immunosuppressive environment in human breast cancer［J］.Cancer Cell，2018，33（3）：463-479.e10.

［21］Topalian SL，Taube JM，Anders RA，et al.Mechanism-driven biomarkers to guide immune checkpoint blockade in cancer therapy［J］.Nat Rev Cancer，2016，16（5）：275-287.

［22］Bianchi ME，Mezzapelle R.The chemokine receptor CXCR4 in cell proliferation and tissue regeneration［J］.Front Immunol，2020，11（8）：2109.

［23］Mezzapelle R，Leo M，Caprioglio F，et al.CXCR4/CXCL12 activities in the tumor microenvironment and implications for tumor immunotherapy［J］.Cancers（Basel），2022，14（9）：2314.

［24］Miao M，De Clercq E，Li GD.Clinical significance of chemokine receptor antagonists［J］.Expert Opin Drug Metab Toxicol，2020，16（1）：11-30.

［25］DAlterio C，Buoncervello M，Ieranò C，et al.Targeting CXCR4 potentiates anti-PD-1 efficacy modifying the tumor microenvironment and inhibiting neoplastic PD-1［J］.J Exp Clin Cancer Res，2019，38（1）：432.

（收稿2022-09-04修回2022-10-21）