抗腫瘤新靶點USP7 及其抑制劑的研究進展

宋潔梅，溫小安，孫宏斌

(中國藥科大學 新藥研究中心，江蘇 南京210009)

泛素是由76 個氨基酸組成的蛋白質，分子量約為8 kDa，在真核生物中廣泛存在并且高度保守。泛素分子在一系列酶的催化下對靶蛋白進行特異性修飾的過程即為泛素化。泛素化被認為是蛋白質翻譯后修飾的一個重要途徑，在細胞凋亡、細胞周期調控、DNA 損傷修復及膜轉運等細胞過程中扮演著重要角色［1］。泛素化過程包括3 個步驟:首先，泛素以ATP 依賴的方式被泛素激活酶(E1)活化;隨后，活化的泛素通過硫酯鍵與泛素結合酶(E2)連接;最后，泛素連接酶(E3)將泛素的碳末端甘氨酸殘基共價結合至靶蛋白的賴氨酸殘基上。泛素化有單泛素化、多泛素化及多聚泛素化3 種類型，不同的類型介導的生物學功能也不同。靶蛋白僅與一個泛素分子共價結合稱為單泛素化，這種類型的泛素化與胞吞、胞內分選、組蛋白調控及DNA 修復等有關。靶蛋白上的多個賴氨酸殘基各自與一個泛素分子共價結合則被稱為多泛素化，該修飾亦與胞吞作用有關。而多聚泛素化則是指靶蛋白與一條由多個泛素連接而成的泛素鏈相結合。在多聚泛素化的泛素鏈中，各泛素分子之間可通過賴氨酸K6、K11、K29、K48及K63 等相連。其中K48、K63 相連最為常見，也是目前研究較深入的連接。K48 連接介導蛋白酶體途徑的蛋白質降解，而K63 連接則與DNA修復、胞吞、蛋白激酶活化等有關［2－3］。

泛素化過程可被去泛素化酶(deubiquitinases，DUBs)逆轉，即去泛素化。DUBs 能夠特異性地切斷在泛素C 末端與靶蛋白間形成的異肽鍵，使泛素脫離靶蛋白，這種去泛素化可改變靶蛋白的命運，如免于被降解、重新定位或者活化等。迄今，已發現的人類DUBs 近100 種，它們大致可分為5 類:泛素特異性蛋白酶(ubiquitin specific proteases，USP)、泛素C 末端水解酶(ubiquitin C-terminal hydrolases，UCH)、卵巢癌蛋白酶(ovarian tumor proteases，OTU)、馬查多-約瑟夫病蛋白域蛋白酶(Machado-Joseph disease protein domain proteases，MJDs)及JAMM 金屬蛋白酶(JAB1/MPN/Mov34 metalloenzyme)。前4 類屬于半胱氨酸蛋白酶，第5 類為含鋅離子的金屬蛋白酶［4］。DUBs 的生物學功能包括:調控細胞周期進程及染色體分離，阻止蛋白質降解，參與基因表達、DNA 修復、細胞凋亡等。

泛素、泛素激活酶(E1)、泛素結合酶(E2)、泛素連接酶(E3)、去泛素化酶(DUBs)及蛋白酶體共同構成了泛素-蛋白酶體系統(ubiquitin-proteasome system，UPS)。研究表明UPS 的失調與人類許多疾病(腫瘤、神經退行性疾病、病毒感染等)存在密切聯系。近年來，以UPS 作為疾病治療新靶點的潛力已引起人們越來越多的關注。在UPS 導向的藥物研發方面，誕生了首個蛋白酶體抑制劑——硼替佐米(萬珂)，該藥已于2003 年被美國FDA 批準上市，用于治療多發性骨髓瘤，2006 年又獲批用于套細胞淋巴瘤的治療。硼替佐米的臨床應用在一定程度上驗證了UPS 作為抗癌靶點的有效性。然而，由于蛋白酶體是細胞內諸多信號通路下游的匯聚點，所以蛋白酶體抑制劑可能普遍存在治療指數偏小的問題［5］，硼替佐米的脫靶毒性、耐藥性等問題隨著研究深入逐一顯現。因此，關注開始轉向UPS 中位于蛋白酶體上游的其他酶，如泛素連接酶E3、DUBs 等，以期能夠發現可替代蛋白酶體抑制劑的、特異性更強且毒性更小的抗癌藥物。USP 是DUBs 家族中最大的一類，也是目前研究得較深入的一類，包括約85 個成員［6－8］。研究發現多個USP 成員與腫瘤轉移密切相關，如泛素特異性蛋白酶7(USP7)與前列腺癌、結腸癌、肺癌及多發性骨髓瘤;USP1與范可尼貧血(Fanconi Anemia);USP2 與前列腺癌;USP4 與腺癌;USP9X 與白血病及骨髓瘤等［7］。

本文介紹USP 家族中的泛素特異性蛋白酶7(USP7)與腫瘤的相關性，并總結近年來USP7 抑制劑在抗腫瘤研究中的進展，以引起人們對泛素特異性蛋白酶7 作為抗腫瘤新靶點的潛在應用價值的關注。

1 USP7 的結構與功能

USP7 也被稱為HAUSP(herpes virus-associated ubiquitin-specific protease)，分子量約為135 kDa。如圖1 所示，USP7 包括N 端類TRAF(tumor necrosis factor-receptor associated factor)區、催化區及64 kDa 的C 端區域［9］。N 端類TRAF 區是直接與底物如p53、MDM2 等結合的區域。催化區包含USP 家族中兩個保守的組氨酸盒(His Box)和半胱氨酸盒(Cys Box)。泛素結合口袋位于催化區，由一個木瓜蛋白酶樣的結構和一個展開的手指般區域組成。C 端區域含有5 個連續的類泛素(ubiquitin-like，Ubl)區，組成“2-1-2”形式的Ubl單位，其中Ubl-1/2、Ubl-4/5 分別形成雜二聚體(如圖2 所示［9］)。含有如此多的連續的Ubl 區在USP 家族中較為獨特。

Figure 1 USP7 contains a TRAF-like substrate binding domain，a catalytic domain，and five Ubl domains［10］

Figure 2 Ubl domains are arranged in an extanded“2-1-2”fold［9］

研究發現，不同的USP 家族成員，其Ubl 區的功能也不同。如在USP4 中，Ubl 區的功能為抑制催化，而在USP7 中則是激活催化［9－10］，即Ubl通過結合于催化區中不同于泛素結合部位的其他位點，促進泛素結合［10－11］。在USP7 中，靠近C末端的Ubl-4/5 是活化USP7 酶活性所必需的，當其與催化區的一個“開關環(switching loop)”結合后，可促使泛素結合口袋的形成(如圖3 所示)，從而將USP7 從非活化狀態轉化為活化狀態，促進USP7 與泛素的結合。盡管Ubl-1、Ubl-2、Ubl-3 對USP7 的活化是非必需的，但它們可與GMP 合成酶(GMP-synthetase，GMPs)結合，誘導變構，穩定Ubl-4、Ubl-5 與“開關環”之間的相互作用，間接促進USP7 活化態的形成［9］。

USP7 切斷靶蛋白與泛素C 末端間形成的異肽鍵的過程可簡單地概括為3 個步驟:與底物結合、?；饔眉懊擋；饔?。首先，USP7 與底物發生特異性結合，經過構象的改變形成活化態后，Cys Box 中的半胱氨酸被His Box 中的組氨酸奪去一個質子發生去質子化;隨后，去質子化的半胱氨酸的巰基親核進攻泛素第76 位甘氨酸的羰基碳，發生?；饔眯纬蒛SP7-泛素中間體，導致異肽鍵斷裂;最后，USP7-泛素中間體經過水解釋放出USP7 和泛素［11］。

Figure 3 Ubl domains function to activate the catalytic domain and GMPS can allosterically stabilize the interaction between Ubl-45 and the catalytic domain［9］

2 USP7 與腫瘤抑制因子

USP7 是在研究單純皰疹病毒蛋白ICP0(infected cell protein 0)時被發現的，最初研究發現USP7 與ICP0 結合后可促進病毒生長［12］。隨著研究的深入，人們發現USP7 的底物非常廣泛，且大多數為與腫瘤抑制、DNA 修復或免疫應答等有關的蛋白質。本文著重介紹USP7 對p53、PTEN、FOXO4 這3 種極其重要的腫瘤抑制因子的調控作用［13］。

2.1 USP7 與p53

p53 是腫瘤抑制因子中的研究熱點。p53 具有抑制細胞生長、促進細胞凋亡等功能。在正常細胞中，p53 的含量非常低，其活化受到嚴格的調控。鼠雙微體2(mouse double minute 2，MDM2)是p53 的主要負調控因子之一，人類雙微體2 則稱為HDM2(human double minute 2)。MDM2 可通過多種途徑抑制p53 的活性。首先，MDM2 不僅自身能被泛素化，它還具有E3 泛素連接酶的活性，可介導p53 的泛素化，使p53 被蛋白酶體降解。其次，MDM2 通過結合于p53 N 端的轉錄活化區域，直接抑制p53 的轉錄活性。再者，MDM2可以將p53 外排出細胞核，使其遠離靶基因。MDM4(也稱MDMX)是MDM2 的同系物，可通過與MDM2 形成雜二聚體而增強MDM2 介導的p53 泛素化，也可以直接與p53 發生蛋白間的相互作用從而阻斷p53 轉錄活性［14］。

USP7 對p53 的調控是非常復雜的(見圖4)。一方面，USP7 能將p53 去泛素化，使p53 因去泛素化而免于被蛋白酶體降解，從而增加p53 的細胞內水平。另一方面，USP7 還能將p53 的負調控蛋白如MDM2、MDM4 等去泛素化，使p53 負調控蛋白的細胞內水平增加，進而導致p53 的細胞內水平下降，活性降低。Hu 等［15］的研究表明，p53、MDM2 均結合于USP7 的N 端類TRAF 區域，且MDM2 的結合能力強于p53。當細胞內DNA 受損時，毛細血管擴張性共濟失調癥突變蛋白(ATM)激酶被活化，磷酸化MDM2、MDM4，從而降低兩者與USP7 的親和力，結果導致MDM2、MDM4 水平降低，而p53 水平升高。p53 進而發揮其DNA 修復或者促細胞凋亡的功能［16］。

Figure 4 The interrelationships among p53，MDM2 and USP7［6］

研究表明，USP7 在前列腺癌、結腸癌、肺癌、膀胱癌等癌細胞中存在過度表達的情況，且這種過度表達與腫瘤的發生直接相關［17］。抑制USP7的活性，有可能降低細胞內MDM2 的水平而升高p53 的水平，從而發揮p53 促細胞凋亡的作用。

2.2 USP7 與PTEN

PTEN(phosphatase and tensin homolog)作為一種脂質磷酸酶，可抑制磷脂酰肌醇-3 激酶(PI3 K)/Akt 通路。除此之外，PTEN 還具有腫瘤抑制的作用，然而其機制尚不清楚。研究表明，單泛素化的PTEN 可從胞漿轉移至細胞核內，從而發揮其抑制腫瘤的作用［18］。USP7 可使PTEN 去泛素化繼而被外排出細胞核，因而抑制USP7 的活性，可增加單泛素化的PTEN 在細胞核內的水平。

2.3 USP7 與FOXO4

FOXO4 是轉錄因子FOXO(fork head box O)蛋白家族的一員，具有腫瘤抑制的作用。FOXO4 被磷酸化后可從細胞核中排出，并依次被多聚泛素化、蛋白酶體降解。當FOXO4 被單泛素化時，可使其定位在細胞核內發揮轉錄活性。USP7 能將FOXO4 去泛素化而失活，因此抑制USP7 的活性可增加細胞核內單泛素化的FOXO4水平［12］。

近來有研究表明HDM2 的E3 泛素連接酶活性會使FOXO4 發生單泛素化［19］。因此，USP7、HDM2、FOXO4 三者間的相互關系變得更為復雜。一方面，USP7 使HDM2 去泛素化，導致HDM2 濃度增加，轉而增加單泛素化的FOXO4。另一方面，USP7 直接使FOXO4 去泛素化，使得單泛素化的FOXO4 減少。在不考慮HDM2 的作用下，抑制USP7 的活性，的確可上調FOXO4 的轉錄活性［12］。HDM2 在調節FOXO4 方面發揮的具體作用尚待深入研究。

3 USP7 抑制劑

近年來小分子USP7 抑制劑開始進入人們視野，一些代表性化合物(1 ～11)如圖5 所示。目前所報道的小分子USP7 抑制劑按化學結構主要可分為4 類:氰基茚并吡嗪類、吡咯酮類、9-氯四氫吖啶酰胺類及噻吩類。

Figure 5 Small molecule inhibitors of USP7

3.1 氰基茚并吡嗪類

該類抑制劑由法國Hybrigenics 醫藥公司研發?；衔?(HBX41108)是該類抑制劑的代表，也是文獻報道的第一個USP7 抑制劑，其對USP7的IC50達到了0.4 μmol·L－1。然而，HBX41108選擇性較差，它對USP8 也有強的抑制作用。HBX41108 對USP7 的抑制屬于反競爭性抑制，即它是與酶和底物的復合物結合，而不是直接與酶結合。分子對接結果顯示，HBX41108 優先結合于酶的Val256、Phe283、Trp285、His294、Leu299及Val302 所形成的疏水口袋，其苯環上的氯原子與疏水殘基Val256、Phe283 及Val302 發生相互作用。HBX41108 的另一特點是導致細胞內p53水平上升的同時，不會引起p53 的15 位絲氨酸被磷酸化，因此與多柔比星相比，該化合物無基因毒性。在HCT116 細胞株上，HBX41108 顯示出劑量依賴性的抗癌細胞增殖活性。Colland 等［20］還研究了p53 在HBX41108 的抗增殖活性中所扮演的角色，通過在細胞株HCT116(p53 野生型)和PC3(p53 突變型)上的對比實驗，發現HBX41108的促凋亡作用依賴于p53 的水平。

Colombo 等［21］對該分子進行了結構改造和修飾。初步的構效關系研究表明，若將苯環上7位氯原子換成氟原子則活性下降10 倍，而換成甲氧基或羥基后活性消失;8 位引入甲基也導致活性消失，如8 位引入甲基的同時7 位氯換成氟原子則活性仍可保持，7、8 位同時以甲氧基取代亦導致活性下降;6 位以氯原子或甲基取代使活性下降，而以甲氧基取代則導致活性消失;3 位氰基對活性的保持是必需的，若換成其他基團(甲氧基、乙氧基、氨基等)都將引起活性消失;9 位羰基變成取代肟基后，其活性與苯環上取代基有關，若苯環7 位無取代，則化合物活性消失，若苯環7 位被氯取代，則化合物活性保持。

3.2 吡咯酮類

Hybrigenics 醫藥公司于2010 年報道了該類USP7 抑制劑［22］，以化合物2 ～5 為代表。研究表明，在這類化合物中與氮連接的側鏈苯環上有雙取代時活性強于單取代，且鹵素取代時活性強于其他給電子基團，如甲氧基、乙氧基等。該類化合物對USP7 具有一定選擇性，對USP7 的抑制活性比對USP8、USP5 及UCH 家族的部分成員強幾十倍。

3.3 9-氯四氫吖啶酰胺類

Hybrigenics 醫藥公司又于2011 年報道了一類具有9-氯四氫吖啶結構的USP7 抑制劑［23］，代表化合物為6(HBX19818)、7(HBX28258)。研究表明HBX19818、HBX28258 對USP7 具有一定的選擇性，其對USP7 的抑制活性比對USP 家族的其他成員至少強30 倍。細胞實驗結果也顯示HBX19818 直接作用于USP7，而對其它去泛素化酶無影響。Hybrigenics 醫藥公司還利用多種質譜手段對這類化合物與USP7 的作用模式進行了研究。結果表明，分子中連接氯的碳原子可與酶活性位點上的半胱氨酸殘基的巰基脫去一分子氯化氫形成C—S 共價鍵。因此，該類化合物對USP7 的抑制屬于不可逆抑制。分子對接結果也顯示該類分子中氯原子在空間上非常接近酶活性位點上的Cys223，有利于共價鍵的形成，而分子中的堿性胺基則與酶的兩個酸性氨基酸Asp295、Glu298 之間存在強的靜電作用。在HCT116 細胞株上，HBX19818 同樣顯示出劑量依賴性的抗癌細胞增殖活性。為了進一步評估p53 在該類分子抗增殖活性中所發揮的作用，該公司研究人員還選取了細胞株HCT116(p53 野生型)、DU145(p53 突變型)及Hela(p53 不由MDM2 調控)進行細胞活力測試實驗，結果表明HBX19818 對3種細胞株的抑制活性相當，說明HBX19818 的抗癌細胞增殖活性與p53 的狀態無關［24］。

3.4 噻吩類

該類抑制劑由專門致力于泛素通路研究的美國Progenra 公司研發［25］，其代表化合物為P5091(化合物8)。P5091 對USP7 的抑制具有一定的選擇性，而對USP2、USP8 等DUBs 無影響。Chauhan 等［26］研究表明，P5091 可通過抑制USP7的活性而誘導對傳統治療或硼替佐米治療抵抗的多發性骨髓瘤(MM)細胞凋亡，亦可與地塞米松或來那度胺聯用發揮協同作用。對USP7 基因敲除的HCT116 細胞株，P5091 并未顯示出細胞毒性，說明P5091 的細胞毒性是依賴于細胞內USP7而實現的。進一步的機制研究發現，P5091 對多發性骨髓瘤的細胞毒性并未因p53 基因敲除而受到影響，而對HDM2 或p21 基因沉默細胞株的細胞毒活性卻大為減弱，說明P5091 的細胞毒活性并不依賴于p53，而是部分通過HDM2-p21 信號通路介導的。

Progenra 公司的研究人員還對P5091 進行了結構改造和構效關系分析。研究發現，若將P5091 的苯環上取代基去除，則活性消失;如將苯環上兩個氯原子換成兩個氟原子時，活性相當;二氯苯環替換成3，5-二氯吡啶環，則活性提高;硝基以溴原子等鹵素替代后活性也消失，而以氰基替代則活性可保持，同時化合物的穩定性也得到提高;2 位乙?；⒉皇腔钚运匦璧?，改成各種酰胺側鏈后其活性可提高數十倍，也可引入水溶性基團以改善化合物的理化性質［27］。

該類化合物對USP47 亦具有抑制活性，其活性強度與對USP7 的相當。USP47 是新近發現的一個潛在抗腫瘤靶點，有研究表明敲除USP47 基因可以降低腫瘤細胞的增殖能力及增強化療藥物的細胞毒活性［28－29］。USP47 是DUBs 家族中與USP7 高度相似的一個去泛素化酶，通過控制DNA 聚合酶β(Polβ)的去泛素化，調節DNA 堿基切除修復。Polβ 在DNA 堿基切除修復中既充當聚合酶又充當裂合酶。

3.5 其他

據文獻報道，化合物9(flupenthixol)、10(trifluoperazine)及11(rottlerin)也具有USP7 抑制活性，其IC50分別為13、9、13 μmol·L－1。同時，這3個化合物對USP1 也有一定抑制活性。USP1 與范可尼貧血有關，亦被認為是一個潛在的抗腫瘤治療靶點［30］。

4 結語

從2009 年首個USP7 小分子抑制劑HBX-41108 被報道以來，至今尚未有USP7 抑制劑進入臨床研究階段。目前專利和文獻報道的USP7 抑制劑，活性普遍不強，其IC50僅為微摩爾級別。因此，如何提高化合物的活性是亟待解決的問題之一。此外，所面臨的另一難題是USP7 抑制劑的選擇性問題。DUBs 家族非常龐大，僅USP 家族就包含多達80 多個成員，成員的同源性高低將影響化合物的選擇性。因此，開發USP7 選擇性抑制劑可能面臨巨大挑戰，而開發具有協同作用的雙重甚至多重抑制劑或將成為今后該類藥物研發的一個方向。

在分子機制研究方面，USP7 抑制劑的抗增殖、促凋亡作用是否依賴于p53 尚無定論。Colland 等［20］在 一 份 研 究 中 發 現USP7 抑 制 劑HBX41108 的促凋亡作用有賴于p53 的水平，而在另一份研究中卻發現另一抑制劑HBX19818 不依賴于p53［24］。Chauhan 等［26］研究也發現USP7抑制劑P5091 的促細胞凋亡作用同樣與p53 的狀態無關。實際上，USP7 的底物除p53、MDM2 之外，還有FOXO4、PTEN 等腫瘤抑制因子以及其他潛在底物。這些底物有可能參與USP7 抑制劑的抗增殖、促凋亡作用，使p53 非依賴途徑成為可能。事實上，Kon 等［31］的研究的確強調了USP7具備p53 依賴和p53 非依賴途徑的功能。與高度依賴于p53 水平的MDM2 抑制劑相比，USP7 抑制劑或具有更廣闊的市場前景，因為約50%的腫瘤患者存在p53 功能失活的現象，對于這一類患者，依賴于p53 的MDM2 抑制劑束手無策，而USP7 抑制劑卻可能有效。

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