肝干細胞及其應用的研究進展

王政祿，鄭虹（.天津市第一中心醫院病理科，天津 3009；.天津市第一中心醫院器官移植中心，天津市器官移植重點實驗室，天津 3009）

肝干細胞（hepatic stem cell，HSC）是一類具有同時向肝細胞及膽管細胞分化和增殖以及自我更新潛能的原始細胞，當肝實質損傷尤其是肝臟大部分切除后，HSC會發生分化和高效增殖，參與到肝臟的再生和修復過程中，為機體細胞的更新提供潛在的無限細胞來源。相對于手術而言，HSC治療具有損傷小、并發癥少的優勢，為終末期肝病的治療提供了嶄新的思路［1］。本文就HSC的研究和治療進展進行綜述。

1 HSC的分類

目前認為，HSC按照其來源可分為肝源性和非肝源性兩種。肝源性HSC來源于前腸內胚層，在胚胎發育過程中以胚胎肝細胞形式存在，在成年哺乳動物中以膽管源性肝卵圓細胞形式存在，包括肝卵圓細胞（hepatic oval cell，HOC）、小肝細胞和成熟肝細胞（maturity hepatocyte，MH）。非肝源性HSC主要來源于胚胎干細胞（embryonic stem cell，ESC）、骨髓造血干細胞和胰腺干細胞等［1-2］。

1.1 肝源性HSC

1.1.1 HOC：Farber 1956年將肝內具有分化潛能的細胞描述為卵圓細胞。當肝實質細胞嚴重受損和（或）肝功能紊亂時，HOC被激活，進一步增殖、分化成肝細胞和（或）膽管細胞，從而完成肝臟結構和功能的重建［3］。目前，普遍認為HOC是肝祖細胞，但對其來源、增殖、調控分化及其與肝臟疾病的關系仍缺乏深入了解。研究發現，HOC與骨髓干細胞有許多相同的表面標志物，如Thy-1、Flt-3R、c-Kit、CD34等，提示HOC可能來源于骨髓［4-5］，但也有學者認為HOC來源于肝臟非實質細胞［6］。

1.1.2 小肝細胞樣祖細胞（small hepatocyte-like progenitor cell，SHPC）：SHPC為直徑 9 ～ 12 nm 的單核細胞，其形態介于肝細胞與膽管上皮細胞之間，多在肝臟嚴重受損的情況下出現。胚胎發育晚期肝祖細胞首先分化為SHPC，然后在細胞外基質及相關因子作用下分化成熟，成體肝臟HOC先分化為SHPC，再進一步分化為成熟的肝細胞［7］，Sasaki等［8］認為SHPC是可以分化成為成熟肝細胞的定向祖細胞，在培養基中可以選擇性增殖，因此推測SHPC可能是肝細胞的特異性祖細胞。

1.1.3 MH：以往認為MH為終末細胞，但近年來研究發現，MH是具有增殖和分化潛能的干細胞。MH在體外培養中，在一定條件下可表達不同胚層（間葉、神經和造血）前體細胞標志物，如CK7、連接蛋白43（connexin 43）、NCAM、AFP、nestin和Thy1，表明其具有巨大的可塑性和分化潛能［9］。有研究顯示，MH可自我復制70次以上，而且具有歸巢能力［10］。

1.2 非肝源性HSC

1.2.1 ESC：ESC為增殖能力最強的全能干細胞，是一種高度未分化細胞，能誘導分化為3個胚層的各種細胞。Teratani等［11］在誘導因子作用下將小鼠ESC分化為有功能的MH，并移植到小鼠肝損傷模型體內，通過熒光示蹤劑發現移植細胞廣泛分布于損傷的肝臟內，并大量增殖。Shraki等［12］研究也表明，在不同的培養條件下，ESC可以分化為肝細胞。目前，人ESC向肝臟分化多采用擬胚體法（EB）［13］，其最大的特點是具有空間三維結構，與胚胎發育過程相仿，但EB的分化隨機性較強，肝細胞誘導效率不高［14］。Malhi等［15］從人胎肝中分離出一種上皮祖/干細胞，它具有很強的集落形成能力，在培養條件下可增生數月，而且細胞分裂40次以上仍能保持正常核型，在聯合免疫缺陷小鼠體內可分化為MH。

1.2.2 骨髓干細胞：目前的研究發現，骨髓干細胞至少包括兩種類型干細胞：造血干細胞和骨髓間充質干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSC），它們在特定條件下可分化為多功能祖細胞（multipotent adult progenitor cells，MAPC），進而分化成不同種類的細胞，如肝細胞、神經細胞、心肌細胞和骨骼肌細胞等［16］。研究顯示，BMSC具有體外易獲得、來源可靠、免疫原性較弱且移植后不易發生免疫排斥反應等優點［17-18］。BMSC可遷移、歸巢至肝細胞內，定向分化為有功能的肝樣細胞和膽管細胞，參與肝臟的損傷修復、細胞更新和功能重建等病理生理過程［19-20］。BMSC可通過調解多種細胞信號轉導通路、抑制肝星狀細胞增殖及活化、促使基質金屬蛋白酶（MMP）高表達，從而抑制膠原合成、降解細胞外基質、減輕肝纖維化，以改善肝功能［21］。此外，BMSC還能分泌白蛋白，使血清中白蛋白水平升高［22］。BMSC來源充足，可直接來源于成人的骨髓或外周血，采集方便，且自體移植不存在倫理上的爭議，因此是干細胞移植的理想選擇［23］。有研究表明，BMSC不僅能通過再生細胞來恢復肝細胞代謝功能，還能分泌MMP來降解肝臟間質纖維組織，改善肝臟纖維化和肝硬化［24］。姜雪明等［25］研究顯示，BMSC療法在臨床移植領域中是一項很有前途的治療策略，由BMSC分泌的吲哚胺2，3-雙加氧酶（IDO）是促進調節T細胞生成和延長移植物存活的關鍵因素。

1.2.3 其他來源干細胞：其他來源干細胞包括胰島祖細胞、唾液腺祖細胞等［1］。Burke 等［26］利用地塞米松體外誘導胰島祖細胞表達肝蛋白，并轉分化為肝細胞，提示在胚胎發育過程中，一些原始的多能干細胞以未分化狀態滯留在機體組織中。

2 HSC的采集與疾病治療

2.1 HSC的分離和采集：目前，臨床上最常用的是BMSC治療終末期肝病，BMSC的提取和分離是治療的前提，供體細胞的質量則直接影響治療效果。BMSC的提取通常在髂前上棘或髂后上棘進行，抽取骨髓50 ～ 100 ml，并以4 000 U肝素抗凝。BMSC的分離方法有負收集混合法、流式細胞儀法、Percoll法、貼壁篩選法、密度梯度離心法和免疫磁珠分離法等。Percoll法和免疫磁珠分離法是兩個最常用的方法［24］。Percoll法的原理是將蛋白酶選擇性地與非靶細胞結合，使非靶細胞表面活性發生變化，細胞密度發生改變，利用密度梯度離心方法分離所需細胞，其優點是不損傷干細胞，表面無任何標志物，能完整保持干細胞活性，是目前值得推薦的方法之一。免疫磁珠分離法是利用磁珠顆?；钚曰鶊F在一定條件下與細胞表面特異性標志物結合及解離的原理，將BMSC分為陰性細胞和陽性細胞。收集CD45細胞，錐蟲藍拒染計數免疫磁珠分離前后細胞活力［27］，其優點是干細胞回收率高、純度好、能保障足夠的細胞數目及細胞活力，在臨床應用中取得了理想的治療效果。

2.2 HSC的移植途徑：BMSC移植治療肝損傷的途徑很多，包括肝動脈注射、門靜脈注射、脾臟內或腹腔內移植等，臨床上以肝動脈注射最為常用。影像引導下腹膜腔穿刺移植的優點是創傷較小、移植細胞數量多，缺點是BMSC在腹腔內較難存活。經皮肝內靜脈穿刺套管插入術是在超聲、CT或透視引導下經皮穿刺到肝內門靜脈，造影明確后引入套管，同時緩慢輸注移植細胞，注射細胞期間密切監測門靜脈壓力，注射完畢后給予肝素抗凝以防止門靜脈血栓形成，術后給予以凝血酶飽和的海綿栓塞穿刺針道。經門靜脈注射BMSC符合肝臟組織學及生理學特點，與其他途徑相比，細胞更易進入肝竇；從生理學角度看，門靜脈是肝臟的營養靜脈，門靜脈血中的營養成分對BMSC有益，肝臟本身的微循環也可以調節其分化，但移植細胞可能導致門靜脈栓塞。為降低門靜脈栓塞等并發癥的發生率，需要對 BMSC 的數量進行控制［28-29］。Salama等［30］報道了48例經皮穿刺肝內門靜脈插管移植HSC的患者，其中42例1次穿刺成功。目前，肝動脈介入插管技術已日臻成熟，通過該途徑可方便地將分離純化后的BMSC懸液直接輸注至肝臟，其優點是符合介入移植的動脈插管途徑，而且不受細胞濃度及數量的影響，因此，國內臨床多采用此途徑［31-33］。

2.3 HSC與肝臟疾病治療

2.3.1 急慢性肝功能衰竭（肝衰竭）：急慢性肝炎、肝硬化等導致的急慢性肝衰竭發生率和病死率較高。目前，肝移植仍然是治療終末期肝病的主要治療措施，但供體缺乏、費用較高等因素限制了其應用，行HSC移植治療成為最佳治療手段。骨髓HSC已經開始臨床應用研究，特別是BMSC，因其具有體外易得、來源可靠、免疫原性較弱且移植后不易發生免疫排斥反應等優點，無論是在動物實驗，還是人體BMSC體外培養及臨床應用研究中均取得了較好的效果［34-35］。該治療手段能夠減輕肝纖維化，促進肝功能恢復，修復肝損傷，發揮免疫調節功能［36-37］，故成為治療肝病的研究熱點。

2.3.2 代謝性肝臟疾?。捍x性肝病通常是由于遺傳性酶缺陷導致體內毒性代謝產物堆積，繼而對機體產生毒性作用的一組先天性肝臟疾病。目前，臨床上普通的治療效果較差。但是，隨著HSC研究的發展，這類疾病將會獲得良好的治療效果?？死锔窭?納賈爾綜合征Ⅰ型鼠模型接受50Gy光照射然后再給予HSC移植，檢驗指標提示鼠克里格勒-納賈爾綜合征Ⅰ型已臨床治愈［30］。

2.3.3 肝臟移植手術的輔助治療：由于肝臟手術往往經歷了缺血/再灌注損傷（IRI）及術后各種免疫損傷，嚴重影響了患者的生活質量及移植肝的長期存活率。鑒于BMSC的生物學特性，目前已將其應用于肝移植術后輔助治療的臨床研究中。2011年日本學者研究證實了BMSC通過抑制肝細胞凋亡和促進肝細胞再生來明顯減輕大鼠IRI［38］。Ismail等［39］通過比較肝切除手術前接受與未接受自體HSC移植治療的兩組患者發現，術前接受HSC移植患者術后肝功能指標恢復明顯優于后者，且未發生術后并發癥。由此可見，肝移植聯合干細胞移植可有效減輕IRI及排斥反應的發生，并可減少免疫抑制劑的使用。

3 問題與展望

HSC的研究雖然已經進入一個新的階段，但由于自體BMSC移植開展時間不長，因此仍有大量的難題需要研究和解答，例如肝細胞在實際的分離純化及特異性標志物鑒定過程中的進一步優化，在誘導分化成為成熟干細胞過程中各種細胞刺激因子及其他因素的調控作用機制，及HSC移植到活體肝臟中后各種微環境的具體作用機制等。同時，HSC移植途徑、部位、移植細胞數量等移植標準及規范化也有待于建立。隨著對HSC研究的不斷深入，我們相信HSC移植治療晚期肝病的應用前景會非常廣闊，必將在各種肝臟疾病尤其是晚期肝病的治療領域中開辟新的途徑［24，40］。