乳酸和氫鹽水聯合后適應減輕心肌細胞凋亡

張國明 劉科衛 李曉燕 許琳 孫媛媛 談紅 沈虹 王曉菲

DOI：10.3760/cma.j.issn.1671-0282.2015.03.014

基金項目：國家自然科學基金（30740080）;濟南軍區總醫院院長青年基金（2011Q08）

作者單位： 250031 濟南，濟南軍區總醫院心內科（張國明、劉科衛、李曉燕、許琳、談紅、沈虹），超聲科（孫媛媛），聯勤部門診部（王曉菲）

通信作者： 談紅，Email：tanhongpaper@126.com

【摘要】目的 探討乳酸和飽和氫鹽水能否模擬后適應通過絲裂原活化蛋白激酶途徑（MAPK）減輕心肌細胞凋亡。方法 在濟南軍區總醫院108 只SD大鼠隨機（隨機數字法）分為假手術組、缺血-再灌注組（R/I組， 移除球囊后立即在缺血部位分三點注射生理鹽水共計60 μL，而后持續再灌注）、后適應組（M-Post組，后適應處理方案為20/20 s×4， 移除球囊后立即在缺血部位分三點注射生理鹽水共計60 μL，而后持續再灌注）、乳酸組（Lac組，再灌注即刻微量注射器在缺血心肌部位分三點注射乳酸60 μL，而后持續再灌注）、飽和氫鹽水組（Hyd組，再灌注即刻微量注射器在缺血心肌部位分三點注射氫鹽水60 μL，而后持續再灌注）、乳酸+飽和氫鹽水組（Lac+Hyd組，再灌注即刻微量注射器在缺血心肌部位分三點注射乳酸和氫鹽水各60 μL，而后持續再灌注），每組18只。心肌缺血45 min制作急性心肌梗死模型，測定每只大鼠再灌注3 min后右心房血漿pH值。再灌注3 min后每組取6只處死，取心肌組織采用硫代巴比妥酸法和分光光度計法測定心肌組織MDA含量和SOD活性。另再灌注30 min后每組取6只處死，取心肌組織用Western blot方法分別測定磷酸化MAPK（p38/JNK 和ERK）、TNF-α、Caspase-8的表達。另再灌注24 h后各組剩余6只大鼠測定血流動力學，處死后取心臟進行TUNEL凋亡檢測。統計學多組間比較應用單因素方差分析，如組間差異顯著則兩兩比較應用q檢驗。結果 Lac+Hyd組再灌注后3 min 右心房血漿pH值顯著低于R/I組（7.32±0.06）vs.（7.43±0.03），P<0.05;MDA含量顯著低于R/I組（1.14±0.16）nmol/mgpro vs.（1.56±0.21）nmol/mgpro，P<0.05;SOD含量顯著高于R/I組（57.92±15.12）U/mgpro vs.（35.48±12.46）U/mgpro，P<0.05。Lac+Hyd組再灌注30 min后心肌組織P-p38（0.46±0.06）vs.（2.18±0.32）， P<0.05;和P-JNK含量（0.59±0.03）vs.（1.62±0.29）， P<0.05，顯著低于R/I 組，TNF-α含量（0.34±0.08）vs.（1.78±0.31）， P<0.05;和Caspase-8含量（0.31±0.07）vs.（1.52±0.28）， P<0.05，均顯著低于R/I 組;心肌細胞凋亡指數顯著低于R/I組（9.50±1.51）% vs.（15.21±1.91）%， P<0.05。以上指標均與M-Post組相比均差異無統計學意義（P>0.05）。再灌注30 min后缺血心肌組織P-ERK含量Lac+Hyd組與R/I組相似（0.55±0.13）vs.（0.57±0.05），P>0.05;Hyd組顯著低于R/I組（0.30±0.09）vs.（0.57±0.05），P<0.05;Lac、Hyd和Lac+Hyd組P-ERK表達均顯著低于M-Post組（1.21±0.13），（0.30±0.09），（0.55±0.13）vs.（1.96±0.39），P<0.05。結論 乳酸和飽和氫鹽水聯合使用可較好模擬后適應上游觸發因子，抑制p38/JNK和ERK的磷酸化，減輕心肌細胞凋亡。

【關鍵詞】 凋亡;藥物后適應;乳酸;氫鹽水;再灌注損傷;絲裂原活化蛋白激酶

Pharmacological post-conditioning with lactic acid and saturated hydrogen saline could attenuate myocardial apoptosis

Zhang Guoming，Liu Kewei，Li Xiaoyan，Xu Ling，Sun Yuanyuan， Tan Hong， Shen Hong， Wang Xiaofei.Department of Cardiology， the General Hospital of Jinan Military Command， Jinan 250031，China

Corresponding author：Tan Hong，Email：tanhongpaper@126.com

【Abstract】Objective To study the hypothesis about the pharmacological post-conditioning with lactic acid and saturated hydrogen saline after ischemic injury of myocardium instead of post-conditioning with mechanical dilatation of severely occluded coronary vessels to attenuate apoptosis of cardiocyte by mitogen-activated protein kinases （MAPK） pathway. Methods A total of 108 rats were randomly（random number） divided into 6 groups （n=18 in each group）： sham operated group （received 60 μL normal saline without ischemia）， reperfusion/injury group（R/I， received 60 μL normal saline solution and routine ischemic-reperfusion [IR] procedure）， post-conditioning group （M-Post， received 60 μL normal saline and post-conditioning treatment， 4 cycles of 20/20 s of reperfusion/re-occlusion）， lactic acid group （Lac， received 60 μL lactic acid and routine IR procedure）， saturated hydrogen saline group （Hyd， received 60 μL hydrogen rich saline and routine IR procedure）， and lactic acid + saturated hydrogen saline group （Lac+Hyd， received a combination of 60 μL of lactic acid and 60 μL of hydrogen rich saline along with routine IR procedure）. Acute myocardial infarction model was made by ischemia for 45 min， and pH value of blood from right atrium was detected in rats of all groups. After 3 min reperfusion， 6 rats of each group were sacrificed and myocardial tissue was taken out to measure the level of MDA and SOD. After 30 min reperfusion， other 6 rats of each group were sacrificed and myocardial tissue was taken out to measure the level of phosphorylated MAPK （p38/JNK and ERK）， TNF- α， Caspase-8 by Western-blot method. After 24 h reperfusion， there were only 6 rats in each group， and hemodynamics were measured in each rat， and then rats were sacrificed and hearts were taken out to detect cell apoptosis by TUNEL method. A one-way analysis of variance （ANOVA） was used， and q tests were employed to determine if any significant differences in individual variable existed between groups.Results The pH of blood from right atrium after 3 min of reperfusion in Lac+Hyd group was significantly lower than that in R/I group （7.32±0.06 vs. 7.43±0.03，P<0.05）， the content of MDA was lower（1.14±0.16 vs.1.56±0.21，P<0.05）and the content of SOD was higher in Lac+Hyd group than those in R/I group （57.92±15.12 vs.35.48±12.46，P<0.05）. Apoptotic index of Lac+Hyd group was much lower than that of R/I group （9.50±1.51）% vs. （15.21±1.91）%， P<0.05. After 30 min of reperfusion， the level of P-p38 in ischemic myocardia in Lac+Hyd group was significantly lower than that in R/I group （0.46±0.06 vs.2.18±0.32， P<0.05）， the levels of P-JNK （0.59±0.03 vs.1.62±0.29， P<0.05）， TNFα （0.34±0.08 vs.1.78±0.31， P<0.05） and Caspase-8 （0.31±0.07 vs.1.52±0.28， P<0.05） were all lower than those in R/I group. However， there were no significant differences in levels of all above variables between Lac+Hyd group and M-Post group（P>0.05）. After 30 min of reperfusion， there was no significant difference in the level of P-ERK between Lac+Hyd group and R/I group （0.55±0.13 vs.0.57±0.05， P>0.05），and the level of P-ERK in Hyd group was significantly lower than that in R/I group（0.30±0.09 vs.0.57±0.05， P<0.05）， And the level of P-ERK in Lac、Hyd and Lac+Hyd groups was significantly lower than that in M-Post group （1.21±0.13，0.30±0.09， 0.55±0.13 vs.1.96±0.39， P<0.05）.Conclusion Pharmacological post-conditioning with lactic acid and saturated hydrogen saline could be used instead of mechanical post-conditioning to inhibit the phosphorylation of p38/JNK and ERK， attenuating myocardial cell apoptosis.

【Key words】Apoptosis;Pharmacological postconditioning;Lactic acid;Hydrogen;Reperfusion injury;Mitogen activated protein kinase

再灌注治療是影響急性心肌梗死急診介入和溶栓治療療效的重要因素，Zhao等[1]發現的缺血后適應可有效降低心肌梗死面積、減輕細胞凋亡、改善血管內皮功能，在多種屬研究中均發現后適應具有保護作用[2-6]。但在臨床應用中，閉塞部位反復機械擴張和堵塞，容易導致冠脈斑塊碎裂、遠端栓塞乃至冠脈夾層等并發癥，存在一定風險。故國內外學者提出了藥物后適應的概念，即使用藥物模擬機械后適應的細胞保護機制，無需機械刺激卻發揮同樣的心肌保護作用。

機械后適應的最上游觸發因子目前尚未完全明確Penna 等[7]和Cohen等[8]提出的酸中毒和適量氧自由基假說引起了學者關注。既往研究發現在缺血心肌局部注射乳酸可較好模擬心肌酸中毒[9];另外，近年來多項研究發現氫氣可有效清除羥自由基（·OH）和過氧亞硝基陰離子（ONOO^-），而對超氧負離子（O₂^-）和雙氧水（H₂O₂）等無抑制作用[10-13]。造成組織損傷的自由基主要是羥自由基和過氧亞硝基陰離子，而超氧負離子和雙氧水可激活多條細胞保護通路。因此本研究擬在活體大鼠急性心肌梗死再灌注模型中，使用乳酸和飽和氫鹽水模擬Cohen提出的觸發因子，并重點觀察上述藥物對心肌細胞凋亡以及MAPK 途徑的影響，以進一步探討后適應保護機制的上游觸發因子。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

1.1.1 實驗分組 健康雄性SPF級SD大鼠108 只，購于山東大學實驗動物中心，隨機（隨機數字法）分為6 組。（1）假手術組（Sham）：開胸并分離左冠狀動脈，穿線但不結扎，曠置45 min后在心臟前壁注射生理鹽水60 μL;（2）缺血-再灌注組（R/I）：缺血45 min后將壓力泵壓力調至0 atm（1 atm=101.325 Pa），移除球囊后立即在缺血部位分三點注射生理鹽水共計60 μL，而后持續再灌注;（3）后適應組（M-Post）：缺血45 min后、再灌注前通過球囊放氣-充盈實現再灌注和缺血反復4 輪，其時間為20/20 s×4，移除球囊后立即在缺血部位分三點注射生理鹽水共計60 μL，而后持續再灌注;（4）乳酸組（Lac）：缺血45 min移除球囊后，立即在缺血部位分三點注射乳酸共計60 μL，而后持續再灌注;（5）氫飽和鹽水組（Hyd）：缺血45 min移除球囊后，立即在缺血部位分三點注射氫飽和鹽水60 μL，而后持續再灌注;（6）乳酸+氫飽和鹽水組（Lac+Hyd）：缺血45 min移除球囊后，立即在缺血部位分三點注射乳酸和氫飽和鹽水稀釋液各60 μL，而后持續再灌注。

1.1.2 模型制備 大鼠稱質量后腹腔注射麻醉（2%戊巴比妥鈉， 0.23 mL/100 g），氣管插管成功后呼吸機輔助呼吸（HX-200 型小動物呼吸機，潮氣量 30 mL/ kg ，頻率50～60 次/min ，吸呼比1∶2）開胸顯示心臟后，于左心耳下緣與肺動脈圓錐間用5-0無創帶針縫合線穿過前降支深部，將后擴張冠脈球囊墊于血管與結扎線之間用力結扎（Grip，3.0×12 mm，Acrostak 公司，瑞士，壓力調為1 atm），而后迅速調整為12 atm。45 min后壓力迅速減為0 atm，根據分組給予不同處理。再灌注3 min后以1 mL注射器抽取右心房血液0.5 mL，立即使用血氣分析儀測定pH值。術后24 h再次麻醉后經右頸總動脈插入左心室導管，使用生物信號及壓力測試系統監測主動脈及左心室血流動力學參數。最后通過頸動脈插管抽取血3～4 mL，處死大鼠取心臟，準備行心肌細胞凋亡檢測。另術后30 min每組各取6只大鼠直接處死取左心室缺血心肌組織冷凍后，擬行Western blot檢測。

1.1.3 主要試劑 乳酸（北京化學試劑公司，中國）為分析純產品，注射前使用4 mol/L NaOH滴定pH至5.5備用;氫氣飽和鹽水按文獻[14]方法制作， 將高壓氫氣（輸出壓力0.4 MPa）通人0.9%氯化鈉6 h以達到飽和，4 ℃保存，3 d內使用;注射用生理鹽水使用4 mol/L NaOH滴定pH至7.4備用。微量丙二醛（malondialdehyde，MDA）和超氧化物岐化酶（superoxide dismutase ，SOD）試劑盒購自南京建成科技有限公司。凋亡檢測試劑盒購自Promega公司（美國）。P-ERK、P-p38、P-JNK、TNF-α、Caspase-8多克隆抗體購自Santa Cruz公司（美國），相應二抗購自Amersham公司（瑞典）。

1.1.4 指標測定 血流動力學監測：再灌注后24 h大鼠腹腔注射麻醉后，經右頸總動脈插入左心室導管，使用生物信號及壓力測試系統描記頸動脈和左心室壓力曲線，以MFL lab 200軟件分析心率、平均主動脈壓（mean artery pressure， MAP）、左心室內壓最大上升速率（+dp/dt_max）和左心室內壓最大下降速率（-dp/dt_max）。

血漿pH值測定：再灌注3 min后，以1 mL注射器抽取右心房血液0.5 mL，立即使用血氣分析儀測定pH值，同時無菌棉球填塞止血。

缺血心肌組織丙二醛（MDA）含量和超氧化物歧化酶（SOD）活性的測定：分別采用硫代巴比妥酸法和分光光度計法測定心肌組織MDA含量和SOD活性，操作嚴格按照試劑盒說明書進行檢測。

心肌細胞凋亡指數的檢測：處死大鼠取缺血心肌組織置于中性甲醛固定24 h， 常規石蠟包埋， 用末端脫氧核苷酸轉移酶介導的 dUTP 缺口末端標記法進行心肌組織切片細胞凋亡的原位檢測。每張切片于凋亡細胞分布區域各取5個高倍視野，計算平均每100個細胞中的凋亡細胞數，并以百分數（%）表示心肌細胞凋亡指數。

既往研究發現缺血后適應可通過MAPK途徑發揮保護作用，后適應可增強ERK磷酸化，抑制p38和JNK的磷酸化[15-18]，繼而通過抑制TNF-α進一步抑制NF-κB等，從而抑制凋亡信號瀑布的激活[19]。本研究發現Lac+Hyd組P-p38/JNK濃度顯著低于R/I組，同M-Post組相似，上述結果進一步驗證了乳酸和氫鹽水組合模擬機械后適應的細胞保護機制。但Lac+Hyd組P-ERK較M-Post組顯著降低，同R/I組相似;同時Hyd組P-ERK顯著低于R/I組，以上結果同Cardinal等[20]關于氫氣對ERK磷酸化的影響相一致。雖P-ERK的激活上同機械后適應不同，但在下游TNF-α、Caspase-8表達方面，Lac+Hyd組同M-Post組相似，最終凋亡指數也同M-Post組相似。上述結果再次說明缺血后適應和氫鹽水減輕細胞凋亡機制的復雜性。

本研究的不足之處是未能測定缺血心肌組織的pH值，而是使用右心房血漿pH值作為替代指標;另外，未能直接測量羥自由基、超氧陰離子和雙氧水的濃度，未能直接判斷其對下游信號分子的影響，這也是本研究的不足之處。

綜上所述，本研究發現乳酸和飽和氫鹽水聯合使用可較好模擬機械后適應的上游觸發因子，有效減輕心肌細胞凋亡;但會抑制ERK的磷酸化，故具體保護機制還需要進一步探討。

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（收稿日期：2014-07-21）

（本文編輯：鄭辛甜）

P293-296