顱內動脈瘤相關糖蛋白標志物的蛋白組學研究

許璟 馬費強 陳賢誼 周峰 朱國偉 張建民

DOI：10.3760/cma.j.issn.1671-0282.2015.03.013

基金項目：浙江省衛生廳平臺骨干項目（2011RCB022）;浙江大學橫向科技項目（11-491020-290）

作者單位：310009 杭州，浙江大學醫學院附屬第二醫院神經外科

通信作者：張建民，Email：zjm135@vip.sina.com

【摘要】目的 在腦脊液（cerebrospinal fluid， CSF）中篩選與顱內動脈瘤（intracranial aneurysm， IA）相關的糖蛋白標志物，對其靈敏度和特異性加以評價。方法 采用定量蛋白質組學和質譜技術，平行比較隨機選取的4組研究對象即正常對照組（healthy control， HC）、疾病對照組（disease control， DC）、未破裂IA組（unruptured IA， UIA）和破裂IA組（ruptured IA， RIA）各10例的CSF中糖蛋白的表達差異，篩選出其中的一個差異蛋白——受體酪氨酸激酶Axl，并在另一相同分組各20例患者基礎上，用受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic curve，ROC曲線）對候選標志物的靈敏度和特異性做出評價。數據分析采用GraphPad Prism5軟件，多組之間比較采用單因素方差分析中的Newman-Keuls多重比較法;相關性分析采用Pearson相關分析。以P<0.05為差異具有統計學意義。結果 首先，在人CSF中一共鑒定了294個糖蛋白。其次，通過HC、DC、RIA以及UIA四組之間的比較，鑒定和定量了59個僅在RIA組中發生特異性改變的蛋白、24個僅在UIA組中發生特異性改變的蛋白以及33個在RIA組和UIA組中均發生改變的蛋白。最后，選取了其中一個僅在RIA組中表達增高的蛋白-酪氨酸受體激酶Axl，在獨立CSF和血漿中進一步加以驗證，ROC曲線分析表明在95%特異性時，CSF中Axl 區分RIA和UIA的靈敏度為60%。血漿Axl在區分RIA和正常對照的靈敏度為40%，區分RIA和UIA的靈敏度為25%。結論 CSF Axl可以作為預測IA破裂的潛在標志物，深入研究其與IA形成和破裂的關系將有助于揭示IA發病機制和尋找新的治療靶點。

【關鍵詞】顱內動脈瘤;腦脊液;定量蛋白質組學;受體酪氨酸激酶Axl;生物標志物

Identify the glycoproteins as biomarkers for intracranial aneurysm with a proteomics approach

Xu Jing，Ma Feiqiang，Chen Xianyi，Zhou Feng，Zhu Guowei，Zhang Jianmin.Neurosurgery Department， Second Affilated Hospital Zhejiang University College of Medicine， Hangzhou 310009， China

Corresponding author： Zhang Jianmin， Email： zjm135@vip.sina.com

【Abstract】Objective To screen the glycoproteins as biomarkers for intracranial aneurysm （IA） in cerebrospinal fluid （CSF） and evaluate the specificity and sensitivity of the biomarker candidates. Methods A complementary proteomic approach integrated with multidimensional chromatography was employed to simultaneously measure relative changes in the gylcoproteins of cerebrospinal fluid （CSF） obtained from patients with ruptured IA （RIA） and unruptured IA （UIA） compared to the healthy controls （HC） and disease controls （DC）. One protein-receptor tyrosine kinase Axl with a unique change in RIA was validated in CSF and plasma. The sensitivity at 95% specificity of Axl in CSF and plasma was evaluated with receiver operating characteristic curve （ROC curve）. Results Firstly， a total of 294 glycoproteins were identified in human CSF with believable evidence. Secondly， the proteomic findings showed the quantitative changes in RIA and UIA as compared to HC and DC. Of 294 identified CSF proteins， 59， 24 and 33 proteins displayed quantitative changes unique to RIA， UIA or IA， respectively. At last， one of these unique proteins-receptor tyrosine kinase Axl with unique increase in RIA was confirmed both in CSF and plasma. ROC curve analysis showed that the sensitivity at 95% specificity of Axl in CSF to differentiate RIA from UIA was 60%. When compared to CSF， the sensitivity at above setting in plasma to differentiate RIA from HC was 40% and to differentiate RIA from UIA was 25%. Conclusions A glycoprotein biomarker Axl might be used as a promising biomarker to predict the rupture of IA. The further investigation of the relations between Axl and IA formation as well as rupture might help to elucidate the underlying pathogenesis and find new therapeutic targets.

【Key words】Intracranial aneurysm; Cerebrospinal fluid; Quantitative proteomics; Receptor tyrosine kinase Axl; Biomarker

顱內動脈瘤（intracranial aneurysm， IA）在人群中的發病率相當高，據估計在成人中可以達到1%～5%[1-3]。一旦發生破裂引起蛛網膜下腔出血，病死率可高達50%以上[4]。而通過及時的治療未破裂IA的病死率卻很低[5]，但對無癥狀的UIA是否要進行治療仍存在很大爭議[6]。臨床上制定了一些所謂的“標準”來判斷無癥狀的UIA是否需要進行治療，如IA的大小、位置等[7]。但是這些標準并沒有堅實的科學依據，IA的破裂和大小可能沒有直接關系[8]。迄今為止，IA的病因和發病機制還不清楚[9-10]，國內外學者仍未找到一種有效的生物標志物。本研究利用定量蛋白質組學技術篩選差異表達的糖蛋白，發現了一個僅在RIA中表達增高的蛋白——酪氨酸受體激酶Axl，其可能成為非常有前景的預測IA破裂的生物標志物。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本課題研究對象為2010年1月1日到2012年12月31日就診于浙江大學醫學院附屬第二醫院神經外科的患者。本研究獲得了醫院倫理委員會的批準，且均獲得研究對象的同意并簽署書面知情同意書。

入選標準：（1）正常對照（HC） 從腦外傷完全恢復至少兩個月以上入院行顱骨修補的患者中選取。入選標準為：①各項常規和實驗室檢查的指標均在正常范圍;②無嚴重肝腎心肺病史;③無遺傳性家族疾病史;④無嚴重抽煙、酗酒史（抽煙<40 支/周，飲酒<150 g酒精/周）;⑤經CTA檢查排除IA。（2）其他神經系統疾病對照（DC） 從非出血性疾病相關的腦腫瘤患者或其他神經系統疾病患者中選取，并且經CTA或MRA證實排除IA。（3）未破裂IA患者（UIA） 經DSA或CTA、MRA檢查后確診，并且無任何IA相關癥狀的患者。（4）破裂IA患者（RIA） 經DSA檢查確診是由于IA破裂引起蛛網膜下腔出血的患者。破裂動脈瘤腦脊液的采集在手術或栓塞后的一個月進行。用于腦脊液和血液標志物篩選的4組患者（RIA， UIA， 正常對照和疾病對照，每組各10 例）在年齡（52.4±9.0）歲 vs.（55.2±3.9）歲vs.（52.8±6.9）歲vs.（54.6±4.2）、性別（男/女：8/2 vs. 8/2 vs. 8/2 vs. 8/2 vs. 8/2）等方面差異無統計學意義。而用于驗證的4組患者（RIA， UIA， 正常對照和疾病對照，每組各20 例）在年齡（51.7±8.4）歲vs.（51.2±10.2）歲vs.（50.8±7.6）歲vs.（49.5±7.7）歲和性別（男/女：7/13 vs. 7/13 vs .7/13 vs. 7/13）亦差異無統計學意義。

1.2 實驗方法

1.2.1 腦脊液和血液標本的采集 腰穿由熟練的醫生操作，統一在清晨（7：00-8：00）采集?；颊咂教蓚扰P位，腰3～4椎間隙為進針位置，第一管2～5 mL送腦脊液常規。第二管收集約10 mL作為實驗標本，分裝成0.5 mL/管。血液在空腹下采集，每個病例采集1 mL左右血液至肝素抗凝管中;離心分離得到的血漿分裝成0.1 mL/管。所有標本收集后均立即放在-80 ℃低溫冰箱備用。

1.2.2 使用凝集素親和柱分離腦脊液中的糖蛋白 將等分的腦脊液樣本（2 mL）用Qproteome糖蛋白試劑盒（Qiagen，Valencia，CA）進行糖蛋白的分離和富集。使用SpeedVac （Thermo， Asheville， NC）將樣品干燥至約200 μL，在1000 g下離心5 min后，把上清液轉移到另一新管中，沉淀則用凝集素親和試劑盒中的去污劑100 μL進行溶解后與上清液合并。處理好的樣品與1500 μL結合緩沖液以及蛋白酶抑制劑（100×）混和，旋轉震蕩充分混勻。將糖蛋白用100 μL帶有蛋白酶抑制劑溶液的洗脫緩沖液洗脫6次。洗脫液則通過添加4倍體積的冰冷丙酮沉淀，在-20 ℃下孵育2 h洗脫沉淀池，然后4 ℃12 000g下，在預冷微離心機離心10 min。去除上清液，沉淀后的蛋白樣品加入100 μL 0.5 mol/L TEAB（triethylammonium biocarbonate）溶解。最后使用BCA法測定蛋白濃度（Thermo， Rockford， IL）。

1.2.3 iTRAQ標記和二維液相色譜及串聯質譜分析 來自四個比較組的100 μg蛋白質用胰蛋白酶消化后分別用四種iTRAQ^TM試劑的一種來標記（Applied Biosystems， Foster City， CA）。然后，把iTRAQ標記的樣本混合后（共400 μg），用PolySulfoethyl ATM 強陽離子交換色譜柱將樣品分成6個部分，分別用SpeedVac真空離心干燥，溶解于0.5%三氟乙酸中，然后通過毛細管C18反相柱，線性梯度設置5%～95%流動相B（80% 乙腈/0.08TFA/HPLC 級純水）85 min，洗脫后的組分與重結晶的α-cyano-4-hydroxycinnamic acid （7 mg/mL 溶解于60% 乙腈/2.6% 醋酸銨，sigma）以及內參（4700 Mass Standard Kit， Applied Biosystems）混合，用Probot^TM自動點樣器點至不銹鋼MALDI 24×24 矩陣的點樣板上，每板一共有576個點，用MALDI-TOF/TOF質譜儀（4700 Proteomics Analyzer withTOF/TOF OpticsTM，Applied Biosystems）進行蛋白鑒定，通過比較不同組與對照組的比值進行定量分析。

1.2.4 血漿和腦脊液中可溶性Axl（sAxl）的ELISA驗證 根據制造商的說明書，在人ELISA試劑盒（Abcam， Cambridge， MA）測定血漿和腦脊液中sAxl。在測定前腦脊液和血漿樣品分別為1∶100和1∶1000稀釋。在微孔板上讀出450 nm處的吸光度。用標準曲線測定血漿和腦脊液中sAxl濃度。

1.3 統計學方法

數據分析采用GraphPad Prism 5 軟件，多組之間比較采用單因素方差分析中的Newman-Keuls Multiple Comparison Test;相關性分析采用Pearson相關分析;靈敏度和特異性評價采用受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic curve，ROC）分析。以P<0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 腦脊液糖蛋白質組的鑒定

結合糖蛋白分離和定量蛋白質組學技術，本研究在腦脊液中一共鑒定了294個糖蛋白質，這些被鑒定的蛋白通過Uniprot數據庫（http：//www.uniprot.org）的搜索，主要涉及以下11類：（1）與免疫或炎癥反應相關;（2）與細胞黏附相關;（3）與細胞外基質組成相關;（4）與蛋白合成和降解相關;（5）與轉運相關;（6）與細胞凋亡或抗凋亡相關;（7）與細胞增殖、分化和遷移相關;（8）與信號轉導途徑相關;（9）與物質代謝相關;（10）與細胞結構和細胞骨架相關;（11）功能未知。在這些蛋白中，除了有相當一部分蛋白（21%）功能未知，其他最常見的是與免疫及炎癥反應相關的蛋白（13%）、與細胞黏附相關的蛋白（12%）以及與蛋白合成及降解相關的蛋白（13%），其在動脈瘤的形成和破裂過程中發揮了重要作用。

2.2 在破裂和未破裂動脈瘤中發生改變的腦脊液糖蛋白

利用同時可以標記四組樣品的iTRAQ試劑分別標記HC（iTRAQ-114）、DC（iTRAQ-115）、RIA（iTRAQ-116）和UIA （iTRAQ-117），然后分別比較115/114、116/114和117/114的比值，找出以下三組感興趣的蛋白：（1）僅在RIA組中發生變化或者特異性改變（變化的方向有別于其他組）的蛋白;（2）僅在UIA組中發生變化或者特異性改變的蛋白;（3）同時在RIA組和UIA組中發生變化的蛋白。利用這些標準，筆者分別鑒定了59個、24個和33個在RIA組、UIA組或IA組中發生特異改變的蛋白（見表1～3）。

2.3 候選糖蛋白標志物Axl在腦脊液和血漿中

驗證

在本研究中優先選擇了受體酪氨酸激酶Axl進行驗證，因為該蛋白僅在RIA的腦脊液中表達增加44%;數據庫中顯示有N-linked糖基化位點;大量的文獻支持Axl介導的信號通路在各種類型細胞的存活、生長、聚集、遷移以及在抗炎癥反應中發揮重要的調節作用;目前可方便地對其進行定量。

首先在4組合并的腦脊液樣品中Axl的含量分別為：HC組（65.89±12.89）ng/mL; DC組（95.99±16.51）ng/mL; RIA組（152.64±12.52）ng/mL;UIA組（61.87±22.18）ng/mL（每組樣品重復三次，如圖1）。

然后，每組單獨10個樣品的Axl質量濃度分別為：HC組 （52.27±29.00）ng/mL; DC組 （93.51±38.45）ng/mL; RIA組 （140.90±28.59） ng/mL;UIA組 （55.34±34.80）ng/mL（圖1B）。由此可見，單獨檢測10個樣品的Axl均數與合并樣品基本接近。單因素方差分析顯示，與HC組相比，RIA組的Axl質量濃度顯著增加（q=3.956， P<0.01）;但UIA組差異無統計學意義（P>0.05）。雖然DC組與HC組相比，Axl質量濃度也顯著增加（P<0.05），但是RIA組與DC組相比，Axl質量濃度也顯著增加（q=4.547， P<0.01），因此Axl在RIA中的增加具有特異性。

然后在另一批性別、年齡匹配的患者和對照，每組20個樣品同時采集腦脊液和血液標本，檢測4組的Axl質量濃度：HC組 （71.18±42.74）ng/mL; DC組（81.75±45.66）ng/mL; RIA組（107.30±41.49）ng/mL;UIA組（54.90±31.86）ng/mL（圖2A）。單因素方差分析顯示，與HC組相比，RIA組的Axl質量濃度顯著增加（q=4.254， P<0.05）;DC組和UIA組差異無統計學意義（P>0.05）。雖然RIA組Axl的均數略高于DC組，但差異無統計學意義（P>0.05）。血漿中的Axl質量濃度比腦脊液高10倍以上，但是4組的變化趨勢與腦脊液中定量結果基本一致。血漿中Axl質量濃度分別為：HC組（804.5±345.1）ng/mL; DC組（976.0±402.6）ng/mL; RIA組（1252.0±601.4）ng/mL;UIA組（835.9±494.2）ng/mL（圖2B）。單因素方差分析顯示，與HC組和UIA組相比，RIA組Axl質量濃度顯著增加（q=4.254和3.956， P<0.05）;但與DC組相比，RIA組Axl的均數略高，但差異無統計學意義（P>0.05）。Pearson相關性分析表明，血漿與腦脊液中的Axl質量濃度顯著相關（P<0.01），相關性系數r²=0.774（圖3）。

最后，筆者利用ROC分析，評價CSF和血漿中Axl的質量濃度作為候選的生物標志物的靈敏度和特異度。CSF中Axl質量濃度的ROC分析結果顯示，RIA能較好地和UIA區分，AUC為0.83，95%特異性時的靈敏度為60%，P<0.01;同時RIA也能夠較好地與HC區分，AUC為0.732 5，但95%特異度時的靈敏度僅為15%，P<0.05（表4）。血漿中Axl質量濃度的ROC分析結果顯示，RIA能夠較好地與HC區分，AUC為0.72， 95%特異度時的靈敏度為40%，P<0.05。同時RIA也能夠較好地與UIA區分，AUC為0.705， 95%特異度時的靈敏度為25%，P<0.05（表5）。

3 討論

蛋白質的糖基化是最重要的翻譯后修飾之一，目前發現的蛋白質中有一半以上有糖基化修飾[11]。尤其是存在于細胞外環境的蛋白如各種體液、分泌蛋白和細胞外基質蛋白等。并且，糖基化修飾對蛋白質的功能有重要影響，如蛋白質的折疊和運輸等[12];絲氨酸、蘇氨酸殘基的乙酰氨基葡萄糖化與信號轉導密切相關[13];蛋白質的糖基化程度以及糖鏈結構的異常變化常常與腫瘤等疾病相關[14-15];參與免疫或炎癥反應的幾乎所有的關鍵性分子都是糖蛋白[16]。筆者在4組人CSF中鑒定的294個蛋白中有142個蛋白有明確的糖基化修飾位點，并包含了各種形式的糖基化修飾。另外，132個蛋白在數據庫中明確注釋為細胞外基質蛋白、分泌蛋白或是細胞膜相關蛋白。其余的蛋白大部分定位不明。

本研究一共鑒定了116個在RIA和（或）UIA中發生特異改變的蛋白，其功能涉及免疫與炎癥反應、細胞黏附和細胞外基質的組成、重建與降解等，均與IA的形成和破裂相關[17-18]。在這發生改變的116個蛋白中，既有原來已經有報道的與IA或其他動脈瘤如腹主動脈瘤相關的蛋白，如蛋白酶抑制劑α2微球蛋白（α2-microglobin）;也有在血管內皮細胞的損傷修復和再生等過程中發揮重要作用的蛋白，如色素上皮衍生因子（Pigment epithelium-derived factor，PEDF））和Axl等。

Axl最初在腫瘤細胞中被發現，在各種細胞中（如血管內皮細胞和平滑肌細胞等）都有廣泛表達，并且在許多慢性疾病中有表達增高或活性增加[19-20]。它的兩個主要配體是生長休止特定蛋白6（growth-arrest-specific protein 6， Gas6）和蛋白S（protein S）。Axl介導的信號通路在各種類型細胞的存活、生長、聚集、遷移以及抗炎癥反應中發揮調節作用。目前認為，Axl信號通路主要有四種激活形式：（1）配體（聚化，引起細胞內酪氨酸激酶結構域的自身磷酸化，使得Axl能與PI3K、PLC、Grb2等結合，調節細胞的存活和增殖等[19]。Gas6/Axl信號通路能夠通過激活SHP-2（Src homolog 2 domain containing protein tyrosine phosphatase 2）抑制血管內皮生長因子受體2的激活[21-22]。（2）兩個相鄰細胞的Axl受體的細胞外結構域可以互相結合而激活，但不依賴其酪氨酸激酶活性。（3）配體非依賴的Axl二聚化和自身磷酸化激活。有研究報道，活性氧在血管平滑肌細胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）中通過Gas6不依賴的方式促進Axl的磷酸化，這種方式在氧化應激或Axl受體過量表達的病理情況下更有意義[23]。（4） Gas6與Axl 結合后還可導致Axl的細胞外結構域被剪切，形成可溶性的sAxl-Gas6復合物，而抑制配體依賴的激活信號。Gas6/Axl信號通路在生理性的固有免疫反應中發揮關鍵的調節作用，干擾素α/β受體能激活Gas6/Axl信號通路，通過激活促炎信號的抑制因子如Twist等進而抑制Toll樣受體和細胞因子發揮抗炎作用[24]。但是，在乳腺癌中卻發現抑制Axl降低了促炎性細胞因子的表達?？梢?，在病理條件下，Axl依賴的信號在炎癥中可能有不同于生理穩態中的調節作用。Gas6/Axl信號通路還在心血管系統尤其在病理狀態下發揮重要作用。在Axl基因敲除的小鼠中發現Axl在血管重建中發揮作用[22]。VSMC損傷時，能通過自分泌機制誘導多種生長因子（包括PDGF和Gas6）以及生長因子受體（包括PDFGR和Axl）的表達，Gas6/Axl能激活PI3K/Akt促進VSMC和內皮細胞的存活。有研究發現，Gas6的血漿濃度與腹主動脈瘤的大小呈正相關而與sAxl則呈負相關，提示Axl信號可能與其發病機制相關，而且血漿中的Gas6/sAxl的比例可作為該病的生物標志物[25]。本研究發現Axl特異性地在RIA的CSF和血漿中增高，提示Axl可能成為RIA的生物標志物，而且Axl依賴的信號通路可能在IA的形成和破裂中發揮了關鍵性的作用。

總之，本研究在人CSF和血漿中的蛋白質組學定量研究，發現Axl可成為非常有前景的預測IA破裂的生物標志物，并且深入研究Axl介導的信號通路在IA形成和破裂的作用有助于揭示IA的發病機制和尋找新的治療靶點。

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