同型半胱氨酸對大鼠血管平滑肌細胞增殖、遷移能力的影響及其可能機制

鮑曉梅，鄭宏超

(上海市徐匯區中心醫院，上海200031)

目前認為，動脈粥樣硬化的發生、發展與血管內皮細胞損傷和血管平滑肌細胞(SMCs)增殖和遷移有關。我們既往研究證實，Hcy可通過p38MAPK(分裂原激活的蛋白激酶)途徑激活NADPH氧化酶，增加活性氧(ROS)的產生，誘導內皮細胞凋亡，促進動脈粥樣硬化形成［1，2］。有研究發現，Hcy引起的氧化應激反應不僅不能誘導SMCs凋亡，反而會促進其增殖和遷移［3～6］，但其具體作用機制尚不明確。2014年10～12月，我們觀察了Hcy對大鼠血管SMCs增殖和遷移的影響，現分析結果，探討其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 健康雄性SD大鼠，8周齡，體質量(281±22)g，購自中國科學院上海生命科學研究院動物中心［許可證號:SCXK(滬)2012-0002］。Hcy、p38 MAPK抑制劑SB203580、四唑鹽(MTT)、NADPH氧化酶抑制劑(DPI)及光澤精，美國Sigma公司;乙酰乙酸二氯熒光黃(DFC-DA)、N-乙酞半胱氨酸(NAC)，德國 Calbiochem公司;DMEM 培養液、0.25%胰蛋白酶、FBS，美國 GIBCO公司。FACS Calibur流式細胞儀，美國BD公司;Berthold LB960化學發光檢測儀，德國伯托公司。

1.2 大鼠血管SMCs分離、培養 常規處死SD大鼠，剖胸取出胸主動脈。分離血管周圍組織，縱向剖開血管，分離中膜。將中膜剪成1 mm×1 mm×1 mm組織塊，置入含20%FBS的DMEM培養液，37℃ 5%CO2培養箱培養9～10天。當細胞融合達80%時，用0.25%胰蛋白酶消化、傳代。

1.3 Hcy最佳濃度確定 取傳3～6代的SMCs接種于96 孔板，分別予 0、50、100、200 μmol/L Hcy 處理24 h，檢測不同濃度Hcy對細胞增殖、遷移、活性氧、NADPH氧化酶活性的影響(方法見1.4)，以對上述指標影響最明顯的濃度為最佳濃度。結果見表1。由表1可見，Hcy呈劑量依賴性誘導SMCs增殖和遷移及ROS產生，激活NADPH氧化酶。本研究確定200 μmol/L為 Hcy最佳濃度，并用于以下研究。

1.4 細胞干預及相關指標觀察

1.4.1 細胞增殖能力 采用MTT比色法。將培養細胞隨機分為五組，對照組不處理;Hcy組加入200 μmol/L的 Hcy;NAC+Hcy組、DPI+Hcy組、SB203580+Hcy組先分別加入1mmol/L的NAC、10 μmom/L 的 DPI、10 μmol/L 的 SB203580 干預0.5 h，再分別加入 200 μmol/L 的 Hcy;各組均干預24 h。分別加入5 g/L MTT 10 μL繼續培養4 h。吸出孔內培養液，加入二甲亞砜100 μL/孔，將培養板置于微孔板振蕩器上振蕩10 min，使結晶物溶解后，用酶標儀檢測各孔570 nm處光密度值(OD值)。

表1 不同濃度Hcy對SMCs增殖、遷移能力及ROS生成、NADPH氧化酶活性的影響(±s)

表1 不同濃度Hcy對SMCs增殖、遷移能力及ROS生成、NADPH氧化酶活性的影響(±s)

注:與0 μmol/L 比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01。

Hcy濃度 增殖能力 遷移能力 ROS生成NADPH mol/L 0.72 ±0.05 - - -50 μmol/L 0.78 ±0.04 1.33 ±0.19 1.63 ±0.27* 1.59 ±0.15*100 μmol/L 0.84 ±0.05* 2.29 ±0.17＊＊2.46 ±0.23＊＊ 2.33 ±0.18＊＊200 μmol/L 0.93 ±0.06＊＊ 3.57 ±0.24＊＊3.22 ±0.26＊＊ 3.01 ±0.21＊＊P氧化酶活性0 μ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

1.4.2 細胞遷移能力 采用Transwell小室法。細胞按1.4.1分組及處理。孵育24 h后，從37℃孵箱中取出Transwell，將上室取出，用棉簽輕輕搽拭上室內側壁，磷酸鹽緩沖液清洗，冰乙醇固定，蘇木素、伊紅染色，顯微鏡下細胞計數，隨機選取5個視野(200倍)，取其平均數。將對照組的遷移能力設為1，其他各組細胞遷移能力為與對照組的比值。

1.4.3 細胞內ROS 采用熒光探針H2DCF-DA法。細胞按1.4.1分組及處理。孵育24 h后，冰PBS洗3次，加入10 μmol/L H2DCF-DA 避光反應30 min，PBS洗3次。0.25%胰酶消化后，流式細胞儀觀察各組平均熒光強度。將對照組的熒光值定為1，其他各組細胞的熒光值為與對照組的比值。

1.4.4 NADPH氧化酶活性 采用光澤精化學發光法。細胞按1.4.1分組及處理。孵育24 h后加入含蛋白酶抑制劑的冰緩沖液，裂解細胞。以Bradford方法檢測蛋白濃度(調整濃度至1 mg/mL)。取100 μL 樣品，加入光澤精(5 μmol/L)、NADPH(100 μmol/L)，于化學發光計數器上計數。將對照組的NADPH氧化酶活性設為1，其他各組NADPH氧化酶活性為與對照組的比值。

1.5 統計學方法 采用SPSS13.0統計軟件。計量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

NAC+Hcy組、DPI+Hcy組、SB203580+Hcy組細胞增殖及遷移能力、ROS生成、NADPH氧化酶活性均低于 Hcy組(P ＜0.05或 ＜0.01)，見表2。

3 討論

高同型半胱氨酸血癥是心血管疾病的獨立危險因素，Hcy可損傷血管內皮細胞，促進血管壁細胞合成分泌黏附分子和趨化因子，誘導中膜SMCs向內膜下遷移和增殖，是動脈硬化的始動環節［4］。Hcy在血漿中可以自身氧化或通過二硫鍵硫化，生成同型胱氨酸和同型半胱氨酸硫內酯，同時激活黃嘌呤氧化酶等氧化酶系統，誘導血管壁細胞產生超氧化物陰離子等ROS并抑制谷胱甘肽過氧化物酶等抗氧化酶活性，最終誘導氧化應激損傷，動脈粥樣硬化形成［6］。研究發現，ROS作為第二信使參與細胞信號轉導，調控內皮細胞及內皮祖細胞的增殖和凋亡［1，2］。本研究發現，不同濃度 Hcy呈劑量依賴性誘導SMCs增殖、遷移，并伴隨細胞內ROS水平進行性升高，給予氧自由基清除劑NAC和NADPH氧化酶抑制劑DPI預處理，在減少ROS生成的同時可明顯抑制SMCs增殖和遷移，提示Hcy誘導SMCs增殖、遷移作用也有氧化應激機制參與。

表2 各組SMCs增殖、遷移能力及NOS生成、NADPH氧化酶活性比較(±s)

表2 各組SMCs增殖、遷移能力及NOS生成、NADPH氧化酶活性比較(±s)

注:與 Hcy組比較，*P ＜0.05，△P ＜0.01。

組別 增殖能力 遷移能力 ROS NADPH氧化酶活性對照組0.72 ±0.05 - - -Hcy 組 0.93 ±0.06 3.57 ±0.24 3.22 ±0.26 3.01 ±0.21 NAC+Hcy組 0.84 ±0.08* 2.03 ±0.17△ 1.37 ±0.31△ 2.61 ±0.18*DPI+Hcy組 0.79 ±0.04△ 2.25 ±0.21△ 1.25 ±0.25△ 1.16 ±0.12△SB203580+Hcy組 0.83 ±0.07*2.17 ±0.18△ 2.11 ±0.18△ 2.02 ±0.15△

作為血管壁ROS的主要來源，NADPH氧化酶的活性受許多外源性或內源性刺激因子的調節。NADPH氧化酶來源的ROS參與了堿性成纖維細胞生長因子、血管緊張素Ⅱ、IL-18和單核細胞趨化蛋白-1誘導的 SMCs遷移［7～11］。有研究發現，采用siRNA技術干擾Nox1基因表達的SMCs，經堿性成纖維細胞生長因子誘導產生的活性氧水平明顯降低，遷移活性明顯下降，轉染Nox1后SMCs的遷移活性可恢復正常。進一步研究發現，來源于Nox1 y/-小鼠的SMCs細胞遷移能力較來源于Nox1 y/+小鼠的SMCs細胞遷移能力明顯下降［7］。上述研究均證實，NADPH氧化酶是平滑肌細胞遷移過程中的一個重要環節。有研究還發現，NADPH氧化酶亦參與SMCs增殖過程［8］。因此，抗氧化劑可能通過降低NADPH氧化酶的活性進而降低SMCs的增殖遷移能力。本研究發現，不同濃度Hcy誘導后，SMCs的NADPH氧化酶活性呈劑量依賴性逐漸上升，與ROS的生成相一致。DPI是NADPH氧化酶特異性抑制劑，可與NADPH氧化酶的核黃素結合，從而抑制電子的傳遞，阻斷ROS生成途徑。用DPI預孵育0.5 h可基本抑制NADPH氧化酶活性，使ROS生成下降，并明顯減少200 μmol/L Hcy誘導的SMCs的增殖和遷移。提示Hcy誘導的SMCs ROS的產生主要來源于NADPH氧化酶。

ROS主要通過激活MAPK家族及其下游轉錄因子(如NF-κB)產生氧化應激反應。本研究發現，p38 MAPK阻斷劑SB203580預孵育0.5 h，再與200 μmol/L Hcy共孵育 24 h，可明顯減少 200 μmol/L Hcy誘導的SMCs增殖和遷移，提示MAPK信號途徑參與了Hcy介導的SMCs增殖和遷移能力的調節。MAPK屬絲氨酸/蘇氨酸激酶(Ser/Thr)，其家族成員包括 ERK1/2、P38 MAPK、JNK。其中 p38 MAPK可以被細胞外應激源(紫外線、缺氧、血管緊張素Ⅱ、內皮素)等激活，廣泛參與細胞增殖、遷移和炎癥反應等過程，被認為是細胞外信號引起細胞增殖反應的細胞內信號傳遞的共同通路或匯聚點。在ERK和JNK途徑中，ROS刺激使細胞內Raf-1明顯升高［12］，Raf-1被激活后依次激活MAP的上游激酶MAK1和MAK3，催化ERK和JNK激酶的酪氨酸和Ser/Thr同時磷酸化，最終通過對轉錄調節因子表達的影響將細胞增殖信號傳遞到細胞核內。有研究證實，ROS 增多能增加 p38MAPK 磷酸化［13，14］，而siRNANox能抑制 p38 MAPK 磷酸化［15］;Nox4 的細胞核定位提示細胞核內源性ROS的生成可直接干預基因表達并激活絲/蘇氨酸蛋白激酶［16］;氧化應激可使p38 MAPK激活，繼而調節下游各種激酶活性，如激活絲裂原應激激酶1和環磷酸腺苷反應結合蛋白轉錄因子，最終導致基因表達的改變，影響細胞的增殖和遷移［13～15］。

綜上所述，Hcy對SMCs增殖和遷移活性具有促進作用，其機制可能與激活NADPH氧化酶、增加ROS生成、活化p38 MAPK信號途徑有關。

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