miRNA對垂體瘤細胞株中增生細胞核抗原、垂體瘤轉化基因、血管內皮細胞生長因子表達的影響

李　東

(壽光市中醫醫院神經外科，山東　壽光　262700)

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miRNA對垂體瘤細胞株中增生細胞核抗原、垂體瘤轉化基因、血管內皮細胞生長因子表達的影響

李東

(壽光市中醫醫院神經外科，山東壽光262700)

摘要〔〕目的探討微小RNA(miRNA)對垂體瘤細胞株中增生細胞核抗原(ki-67)、垂體瘤轉化基因(PTTG)、血管內皮細胞生長因子(VEGF)表達影響。方法將培養好的人垂體瘤細胞放入A、B兩培養瓶中培養，其中A培養瓶培養基中加入標記的miRNA基因2 μl，而B培養瓶只是加入等量的培養基，采用RT-PCR及 Western印跡法檢測培養24 h后人垂體瘤細胞中ki-67、PTTG、VEGF基因及蛋白表達水平。結果①A培養瓶加標記的miRNA基因后培養24 h，人垂體瘤細胞ki-67、PTTG和VEGF mRNA表達水平明顯低于B培養瓶(P<0.05)；②A培養瓶加入miRNA基因后培養24 h，人垂體瘤細胞ki-67、PTTG和VEGF蛋白表達水平明顯低于B培養瓶(P<0.05)。結論垂體瘤細胞中ki-67、PTTG、VEGF處于高水平表達，而miRNA能夠明顯降低ki-67、PTTG、VEGF的表達，抑制細胞的生長，對臨床具有指導意義。

關鍵詞〔〕微小RNA；垂體瘤；增生細胞核抗原；垂體瘤轉化基因；血管內皮細胞生長因子

第一作者：李東(1979-)，男，主治醫師，主要從事神經外科學研究。

垂體腺瘤雖多數為良性腫瘤，但是過度生長的垂體細胞分泌和釋放各種分泌素，導致臨床出現激素紊亂表現〔1，2〕?，F代醫學對垂體瘤的治療多采取手術、放療以及藥物治療等方法，但手術容易對大腦中其他重要組織造成副損傷，引起手術并發癥，放療以及藥物治療副反應較多，嚴重降低患者生活質量〔3〕。垂體腺瘤的病變機制目前尚未完全明確。研究發現〔4〕，微小RNA(miRNA)能夠通過完全或不完全與靶RNA配對，阻止miRNA轉錄、翻譯或者降解靶RNA，負向調節相關蛋白的表達，調節機體生長發育；若miRNA失衡表達，將會導致細胞的生長、發育、增殖、分化以及凋亡過程的紊亂，從而促使腫瘤的發生、發展甚至侵襲性生長。本研究通過觀察垂體瘤細胞中增生細胞核抗原(ki-67)、垂體瘤轉化基因(PTTG)、血管內皮生長因子(VEGF)基因及蛋白表達水平，探究miRNA對垂體腺瘤的影響。

1資料與方法

1.1材料標記的miRNA基因購于陜西鈺堂生物科技發展有限公司；人垂體瘤細胞株購于中國醫學科學院基礎研究所；RPMI-1640培養基及Trizol試劑均購于購于美國GIBCO公司；RT-PCR試劑盒、超純RNA提取試劑盒和逆轉錄試劑盒均購于美國Promega公司；兔抗人ki-67抗體、兔抗人PTTG抗體、兔抗人VEGF抗體、引物、Tap酶和二氨基聯苯胺(DAB)顯色劑購于Cell Signalling Technology 公司。

1.2人垂體瘤細胞及人正常垂體細胞培養無菌操作下，取人垂體瘤細胞株置于RPMI-1640培養基(含10%胎牛血清和2%谷氨酰胺)中，在37℃體積分數為5%的CO2飽和濕度環境中培養，培養24 h至生長對數期，用0.25%胰酶消化細胞，10%體積分數的小牛血清培養基終止消化，按照1∶3傳代培養，3 d傳代培養1次。

預先置有玻片的24孔板內加入1 ml濃度為2×105/ml的人垂體瘤細胞懸液，置于37℃體積分數為5%的CO2飽和濕度環境中培養，24 h長成單層后，抽取并除去上清液，在適宜環境中培養2 h后，除去上清液，并加入適量的RPMI-1640培養基繼續培養。培養24 h后取出玻片，采用蘇木素染色成功，于光學顯微鏡下觀察。見圖1。

圖1　PTTG、VEGF、ki-67在人垂體瘤細胞中的陽性表達(×400)

向預先準備好的A、B兩個50 cm3培養瓶中分別加入濃度為2×105/ml的人垂體瘤細胞懸液10 ml，置于37℃體積分數為5%的CO2飽和濕度環境中培養，24 h長成單層后，抽取并除去上清液，除去上清液，培養24 h后，向A培養瓶加入2 μl標記的miRNA基因，向B培養瓶加入等量RPMI-1640培養基，置于適宜環境中繼續培養，分別取培養24 h后細胞備用。

1.3RT-PCR法檢測人垂體瘤細胞中ki-67、PTTG、VEGF基因表達水平

1.3.1總RNA的提取分別取A、B兩培養瓶人垂體瘤細胞置于0.2%膠原酶中消化，采用D-Hank液清洗，4℃冰浴30 min，1 200 r/min離心8 min，制備成單細胞沉淀，向單細胞沉淀中加入1 ml Trizol試劑，采用超純RNA提取試劑盒提取人垂體瘤細胞中總RNA。實驗操作按產品說明書進行，用紫外分光光度法測定RNA的OD260/OD280確定總RNA純度。

1.3.2反轉錄聚合酶鏈反應根據逆轉錄試劑盒要求進行反轉錄反應操作，按照相關文獻資料設計聚合酶鏈反應(PCR)中內參照ki-67、PTTG、VEGF和β-actin引物，將RNA模板、引物、5×RT Buffer 和RNase-free水溶解并置于冰上備用，將2 μl Primer mix試劑和10 μl消化后RNA分別加入20 μl反應體系的第一部分，混勻。PCR反應體系為：SYBR Premix Ex Taq(2×)10 μl，PCR正義引物(10 μmol/L)0.4 μl，PCR正義引物(10 μmol/L)0.4 μl，ROX Reference Dye Ⅱ 0.4 μl，cDNA模板2 μl，dH2O 6.8 μl，總反應體系為20 μl。經過PCR反應條件的優化,PCR循環條件為94℃30 s,55℃30 s,72℃1 min,共35個循環,最后72℃再延伸5 min。引物序列見表1。

表1目的基因的實時定量RT-PCR引物序列

引物名稱引物序列(5'-3')產物大小(bp)ki-67正義CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAA747ki-67反義ACACTCCAGCTGGGAGCTGGTGTTGTPTTG正義GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGT645PTTG反義TGCGGGTGCTCGCTTCGGCAGCVEGF正義CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAA524VEGF反義ACACTCCAGCTGGGTAGGCAGTGTCAβ-actin正義CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAA519β-actin反義ACACTCCAGCTGGGTAGCTTATCAGAC

1.3.3結果觀察PCR產物經1.2%瓊脂糖凝膠電泳后,溴乙啶染色，通過成像分析scion軟件計算和比較ki-67、PTTG和VEGF產物條帶的吸光度值，并與β-actin條帶光密度值比較，計算出ki-67、PTTG和VEGF在人垂體瘤細胞中mRNA表達含量相對值。

1.4Western印跡法檢測人垂體瘤細胞中ki-67、PTTG和VEGF表達無菌操作下，分別取A、B兩培養瓶人垂體瘤細胞，將選取好的人垂體瘤細胞經磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌，洗滌后離心收集，用冰冷PBS洗滌細胞3次后，加入裂解緩沖液，搖勻，4℃冰浴30 min，1 200 r/min離心10 min，吸取上清液，即胞質蛋白。采用二喹啉甲酸(BCA)法對樣品蛋白質進行蛋白定量。調整樣品蛋白量為30～40 μg后進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分離，并將蛋白質轉移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。PBS洗膜5 min后，PBS溶解封閉PVDF 2 h。繼而加入兔抗人ki-67抗體、兔抗人PTTG抗體、兔抗人VEGF抗體(1∶1 000稀釋)或抗β-actin(1∶2 000稀釋)，置于4℃環境中過夜。PBS洗滌3次，10 min/次，加入二抗，溫室孵育2 h。再次用PBS洗滌3次，10 min/次。將PVDF膜增強化學發光法(ECL)顯色，在暗室中將PVDF曝光于X光片中，用凝膠成像系統掃描分析結果。

1.5統計學方法應用SPSS17.0統計學分析軟件，組間比較進行t檢驗。

2結果

2.1總RNA提取結果紫外分光光度法測定中可知人垂體瘤細胞ki-67、PTTG和VEGF總RNA OD260/OD280值在1.8～2.0之間，在1.2%的瓊脂糖凝膠電泳可觀察到28 S、18 S、5 S三條產物條帶，說明提取人垂體瘤細胞中的總RNA完整性較好。

2.2A、B兩個培養瓶中人垂體瘤細胞ki-67、PTTG和VEGF mRNA表達比較A培養瓶加標記的miRNA基因后培養24 h，人垂體瘤細胞ki-67、PTTG和VEGF mRNA表達水平(0.41±0.11，0.38±0.13，0.34±0.06)明顯低于B培養瓶(0.66±0.05，0.71±0.12，0.69±0.11)(P<0.05)。見圖2。

2.3A、B兩個培養瓶中人垂體瘤細胞ki-67、PTTG和VEGF蛋白表達比較A培養瓶加入miRNA基因后培養24 h，人垂體瘤細胞ki-67、PTTG和VEGF蛋白表達水平(0.37±0.13，0.41±0.09，0.32±0.07)明顯低于B培養瓶(0.56±0.12，0.61±0.11，0.62±0.13)(P<0.05)。見圖3。

圖2　人垂體瘤細胞ki-67、PTTG和VEGF PCR產物瓊脂糖凝膠電泳結果圖

圖3　人垂體瘤細胞中ki-67、PTTG和VEGF 編碼蛋白表達結果圖

3討論

垂體瘤是良性垂體前葉腫瘤，是顱內生長較緩慢的常見腫瘤，腫瘤直徑<1 cm，生長限于鞍內者為微腺瘤，除影像學外還需血清內分泌素含量測定確診；直徑>1 cm并已超越鞍膈者為大腺瘤；腫瘤直徑>3 cm者為巨腺瘤〔5～7〕。微腺瘤和大腺瘤臨床主要以內分泌癥狀表現為主，而巨腺瘤表現為內分泌癥狀之外還有壓迫視神經及高顱內壓癥狀〔8〕。垂體瘤的發病機制是多種因素共同參與、病理生理十分復雜，目前尚未有明確的發病機制。垂體腺瘤雖為良性腫瘤，但是由于顱內結構特殊，手術很難做到完全切除，極易復發，放療以及藥物治療效果亦不明顯〔9〕。研究發現〔10〕，miRNA是一類動植物中的基因表達調控因子，作用于腫瘤相關的脆性位點，對癌基因產生抑制作用，與腫瘤的發生有著密切的關系。

本研究結果說明miRNA通過抑制垂體細胞中ki-67、PTTG、VEGF的表達，抑制腫瘤細胞的生長，削弱腫瘤細胞的侵襲性，有效抑制癌基因，從而阻止垂體腫瘤的發生、發生甚至浸潤。VEGF〔11〕是迄今為止最重要的血管形成因子，垂體腺瘤的發生、發展、浸潤依賴新生血管的形成和營養供應，垂體腺瘤新生血管的形成依靠VEGF的作用，垂體腺瘤是血運豐富的腫瘤，其的不斷、快速的增長從而促使機體分泌大量的VEGF〔12〕。垂體腺瘤的生長還需PTTG通過血管活性物質來促進，堿性成纖維細胞生長因子是PTTG促進垂體腺瘤生長的主要血管活性物質〔13〕。研究發現〔14〕，通過上調垂體瘤組織中PTTG生長因子受體，其VFGE表達水平亦隨之增高，說明VEGF和PTTG共同促進垂體腺瘤血管的形成，從而促進垂體腺瘤的生長和浸潤。ki-67〔14〕為一種細胞核抗原蛋白，主要存在于增殖細胞核內，在細胞有絲分裂的M期呈現表達高峰，然而不在G0期細胞中表達。ki-67半衰期短，在DNA修復狀態的細胞中不表達，能夠反映出細胞增殖活性、腫瘤細胞的生長方式和復發等生物學行為，也能夠作為腫瘤預后的標志。miRNA能夠通過完全或不完全與靶RNA配對，阻止miRNA轉錄、翻譯或者降解靶RNA，負向調節相關蛋白的表達，調節細胞生長、發育、凋亡過程〔15〕。相關研究表明〔15〕，垂體腺瘤細胞中miRNA處于低水平表達，無法抑制癌基因的表達，導致垂體腺瘤細胞無限期增長，從而使機體分泌大量的PTTG、VEGF和ki-67。

綜上所述，miRNA能夠調節細胞的生長、發育和凋亡的過程，抑制癌細胞的表達，從而降低垂體瘤細胞中PTTG、VEGF和ki-67的表達，有利于提高臨床對垂體腺瘤的治療療效，改善患者生活質量，對臨床實際應用具有重要的指導意義。

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〔2015-02-09修回〕

(編輯袁左鳴)

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中圖分類號〔〕R739.41〔

文獻標識碼〕A〔

文章編號〕1005-9202(2015)24-7033-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.24.029