線性減小比生長速率指數補料策略對酵母生產效率的改善

季萌，繆冶煉*，陳介余，尤業兵，劉飛龍，許琳

1(南京工業大學 食品與輕工學院，江蘇 南京，211800)2(日本秋田縣立大學 生物資源學部，日本 秋田，010-0195)3(南京工業大學 生物與制藥工程學院，江蘇 南京，211800)

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線性減小比生長速率指數補料策略對酵母生產效率的改善

季萌1，繆冶煉1*，陳介余2，尤業兵1，劉飛龍1，許琳3

1(南京工業大學 食品與輕工學院，江蘇 南京，211800)2(日本秋田縣立大學 生物資源學部，日本 秋田，010-0195)3(南京工業大學 生物與制藥工程學院，江蘇 南京，211800)

酵母的生產效率和成本在很大程度上依賴于培養模式。根據酵母的生長特性，提出了一種新的線性減小比生長速率指數補料(exponential-feeding based on linear reducing specific-growth-rate, LR-μ-EF)策略。首先，采用該策略進行抗凍酵母SaccharomycescerevisiaeAFY-1的3 L發酵罐培養試驗，比較了培養過程中生物量的計算值和實驗值。然后在此基礎上，以最終生物量、收率和生產速度為酵母生產效率的評價指標，討論了補料速度和累計補料體積對酵母生產效率的影響。當恒定比生長速率指數補料(constant-μexponential-feeding, C-μ-EF)培養階段的比生長速率(μ)為0.05 h-1、LR-μ-EF培養階段的μ減小速度為0.000 8 h-2時，生物量的實驗值與計算值基本一致。在累計補料體積560 mL的條件下，最終生物量和酵母收率隨著μ減小速度的增大而逐漸上升，當μ減小速度為0.000 8 h-2時分別達到77.5g/L和38.0%。這與μ減小速度為0(即C-μ-EF策略)時相比，分別增加了26.7%和27.5%。此外，酵母生產速度基本與μ減小速度無關，保持在0.8～0.9g/(L·h)范圍。以上研究結果表明了LR-μ-EF策略改善酵母生產效率的能力，為酵母的工業化生產提供了有用信息。

酵母；分批培養；補料策略；比生長速率；生產效率

酵母在食品、醫藥、生物工程、發酵工程、飼料工業等領域有著廣泛的應用，目前其全球年消費量高達數百萬噸，并仍在不斷增長[1]。酵母的培養模式直接影響其生產效率和成本，是酵母生產技術的研究熱點之一[2-3]。從理論上來說，指數流加培養是一種最為有效的酵母培養模式。指數流加培養根據酵母的指數生長規律確定培養基的流加速度，可避免一次性投料培養中的底物抑制問題，減少乙醇和其他副產物的形成，從而提高酵母的收率和生產速度[4-6]。

目前關于酵母指數流加培養的研究大多數都假設培養過程中酵母的比生長速率保持恒定，也就是說酵母以恒定的比生長速率按時間的指數函數生長[7-9]。但實際上，指數流加培養過程中，比生長速率難以保持恒定。這是因為隨著培養的進行(特別是在培養的中后期)，酵母、乙醇和溶氧濃度等環境條件發生改變，酵母生長受到抑制[10-12]。此外，合理的比生長速率也難以確定。若比生長速率設定過高，則培養基供給超出酵母生長的需要，酵母生長受到抑制，反之若比生長速率設定過低，則培養基供給不足，限制酵母生長速度[13]。在指數流加培養的前期采用較大的比生長速率，后期采用較小的比生長速率，可改善溶氧不足問題，提高最終生物量[7,14]。因此，本研究根據糖代謝受到氧和糖濃度雙重影響的酵母生長特性，提出一種新的線性減小比生長速率指數補料(exponential feeding based on linear reducing specific-growth-rate, LR-μ-EF)策略。該補料策略在培養初期采用較大的比生長速率，而在培養中后期采用隨時間線性減小的比生長速率，以達到提高酵母生產效率的目的。

本文作者在前期研究中以SaccharomycescerevisiaeCGMCC 2.1423為出發菌株，采用低溫等離子體誘變結合定向馴化的手段，選育出了1株發酵能力強的抗凍酵母S.cerevisiaeAFY-1[15]。該酵母冷凍生胚的發酵力在-20 ℃條件下凍藏7 d時為冷凍前的93%，35 d以后一直穩定在冷凍前的86%，抗凍能力明顯優于其他市售酵母。本研究以抗凍酵母S.cerevisiaeAFY-1為實驗菌株，探究LR-μ-EF策略改善酵母生產效率的有效性。首先，采用該策略進行抗凍酵母S.cerevisiaeAFY-1的培養，以恒化培養動力學參數為依據計算指數補料培養中的生物量，并與實驗值比較；然后在此基礎上，以最終生物量、收率和生產速度為酵母生產效率的評價指標，討論補料速度和累計補料體積對酵母生產效率的影響。

1　指數補料培養數學模型

假設指數補料培養過程中酵母的比生長速率恒定，且補料速度等于消耗速度，則根據物料恒算可得如下補料方程[12]：

(1)

式中：F，補料速度，L/h；μ，酵母比生長速率(即單位質量的酵母在單位時間內的生長量)，h-1；V0，初始罐內培養基體積，L；CC0，初始罐內生物量，g/L；YC/S，酵母對葡萄糖的收率，%；CSF，流加培養基的葡萄糖濃度，g/L；CS，罐內葡萄糖濃度，g/L；tF，指數補料培養時間，h。

對式(1)進行積分，可得到累計補料體積VSF(L)的計算式：

(2)

此外，罐內生物量CC(g/L)隨指數補料培養時間的變化可用式(3)[11]表示：

(3)

式(1)～式(3)中，V0、CSF、CC0、μ、tF為操作參數，可根據實驗需要設定。酵母在無抑制的條件下生長時，μ和CS之間的關系符合Monod方程[16]。經過變換，CS與μ的關系可以表示為：

(4)

式中，KS，基質飽和常數，g/L；μmax，酵母最大比生長速率，h-1。

YC/S與μ的關系可以用式(5)[17]表示：

(5)

式中，QS，基質消耗速率，h-1；YG，酵母最大生長得率系數；mS，酵母生長維持系數，h-1。

本研究分別在稀釋率為0.006、0.01、0.03、0.05 h-1的條件下進行抗凍酵母S.cerevisiaeAFY-1的恒化培養，得到μmax=0.31 h-1；KS=0.81 g/L；YG=0.43；mS=0.002 4 h-1。因此在指數補料培養中，只要設定μ，即可分別根據式(4)和式(5)計算得到CS和YC/S[18]。

對于線性減小比生長速率的指數補料培養，本研究采用時間差分法計算補料速度、累計補料體積和罐內生物量。在充分小的時間間隔內，可以認為μ恒定不變，式(1)～式(3)成立。

2　材料與方法

2.1酵母菌種

以抗凍酵母S.cerevisiaeAFY-1為實驗菌株。該菌株采用斜面培養基(葡萄糖20 g/L，酵母浸粉10 g/L，蛋白胨20 g/L，瓊脂20 g/L)在4 ℃條件下保存。

2.2培養基

種子培養基：葡萄糖20 g/L，酵母浸粉10 g/L，蛋白胨20 g/L，自然pH，在121 ℃條件下滅菌20 min，冷卻至室溫。

擴大培養基：葡萄糖40 g/L，酵母浸粉8.9 g/L，無機離子母液(KH2PO460 g/L、MgSO420 g/L、CaCl20.2 g/L)3.6 mL/L，維生素母液(肌醇2 g/L、硫胺素0.5 g/L)3.6 mL/L，自然pH。其中，維生素母液采用0.22 μm微濾膜過濾除菌，其他溶液在121 ℃下滅菌30 min，冷卻至室溫后混合。

流加培養基：葡萄糖500 g/L，酵母浸粉111.46 g/L，無機離子母液(KH2PO460 g/L、MgSO420 g/L、CaCl20.2 g/L)45.3 mL/L，維生素母液(肌醇2 g/L、硫胺素0.5 g/L)45.3 mL/L，自然pH。滅菌方法與擴大培養基相同。

2.3種子培養

在250 mL三角瓶中裝入100 mL種子培養基，用接種環將酵母菌種從斜面培養基接種至種子培養基中，在180 r/min、30 ℃的搖床上培養21 h(對數期后期，細胞濃度為1.2×107個/mL)。

2.4補料分批培養

酵母的補料分批培養分別采用恒定比生長速率指數補料(constant-μexponential feeding, C-μ-EF)和線性減小比生長速率指數補料(LR-μ-EF)的2種策略進行。其中，采用C-μ-EF策略的培養包括2個階段：無補料培養階段和C-μ-EF培養階段；采用LR-μ-EF策略的培養包括3個階段：無補料培養階段、C-μ-EF培養階段、以及LR-μ-EF培養階段。無補料培養的目的在于得到一定的酵母生長速度和生物量，使得指數補料培養順利進行[19]。

(1)無補料培養

在3 L發酵罐(BIOTECH-3BG，上海保興生物設備工程有限公司)中裝入1.0 L擴大培養基，接入50 mL種子液，進行無補料的培養。培養溫度和通氣量分別設定在30 ℃和200 L/h，罐內發酵液的溶氧量通過改變攪拌轉速(200～800 r/min)控制在30%以上，pH用濃度為2 mol/L的H2SO4溶液和1 mol/L的NaOH溶液控制在5.0左右。

(2)C-μ-EF培養

在無補料的培養進行到24 h時，罐內葡萄糖和乙醇完全消耗。從此開始，按照式(1)向罐內供給流加培養基，進行C-μ-EF培養。比生長速率(μ，h-1)設定為0.05[13]。

(3)LR-μ-EF培養

當無補料及C-μ-EF培養進行到40 h時，開始LR-μ-EF培養。μ與培養時間t(h)的關系可用式(6)表示：

μ=0.05-ω(t-40) (ω>0)

(6)

式中，ω，μ的減小速度，h-2。

(4)補料

采用蠕動泵(BT100-02-YZ1515，保定齊力恒流泵有限公司)向發酵罐內補給流加培養基，當累計補料體積達到設定值時結束培養。從理論上來說，補料速度按式(1)計算，但補料速度隨時間的變化難以在蠕動泵上實現。因此，本實驗采用時間差分法進行補料速度的計算和控制，時間間隔△t設定為1 h。在任意時刻t，根據式(2)計算出△t內的平均補料速度(L/h)，作為蠕動泵在△t內的操作值。以μ=0.05 h-1為例，補料速度的計算值和操作值如圖1所示。

圖1　補料分批培養中補料速度的計算值和蠕動泵操作值(μ=0.05 h-1)Fig.1　Calculated feeding rate and set values for peristaltic pump operation in the fed-batch culture

2.5測定

培養過程中，從發酵罐內取出發酵液試樣10 mL，測定生物量、乙醇和殘糖濃度。

(1)生物量測定

采用紫外分光光度計(752S，上海棱光技術有限公司)在600 nm處測定試樣的光密度(OD600)，并根據標準曲線方程計算出生物量(干重)。測定前，根據需要進行稀釋，以保證OD600在0.2～0.8范圍內。每個測定重復3次，取平均值。

(2)乙醇和殘糖濃度測定

試樣的乙醇和殘糖濃度采用生物傳感器(SBA-40E，山東省科學院生物研究所)進行測定。將試樣在4 ℃、3 000 r/min條件下離心10 min，取25 μL上清液進樣。每個測定重復3次，取平均值。

3　結果與討論

3.1培養過程特征

圖2表示C-μ-EF策略應用的1例。該實驗中，經過24 h的無補料培養，生物量(CC)達到12.3 g/L，罐內葡萄糖(CS)和乙醇(CE)消耗殆盡，溶氧(DO)也出現急劇上升。因此，在此時開始C-μ-EF培養，μ設定為0.05 h-1。在C-μ-EF培養階段，罐內葡萄糖濃度無上升，表明流加培養基的營養成分被全部利用。生物量的實驗值在52 h前與計算值基本一致，但在52 h后小于計算值，且隨著時間的延長，兩者差別增大。71 h時，累計補料體積達到560 mL，培養終了。此時，生物量的實驗值為61.2 g/L，遠小于計算值82.8 g/L。與生物量的變化相對應，乙醇濃度從52 h時開始逐漸增加，到71 h時達到16.7 g/L。溶氧也在52 h時開始從30%逐漸下降，71 h時下降至0。

Ⅰ:無補料培養階段；Ⅱ:C-μ-EF培養階段，μ=0.05 h-1圖2　C-μ-EF策略應用的一例Fig.2　An application example of C-μ-EF strategy

在C-μ-EF培養的中后期，生物量的實驗值小于計算值，表明部分葡萄糖消耗于酵母的乙醇發酵途徑，實際的μ小于其設定值0.05 h-1。該現象發生的主要原因是：隨著培養的進行，生物量增加，依靠提高攪拌轉速與通氣量已不能滿足酵母生長的需要，因而發酵液的溶氧下降，同時產生了克雷布特效應[2,7,20-21]。

為了解決這一問題，提高酵母生產效率，本研究提出了LR-μ-EF策略。圖3表示LR-μ-EF策略應用的1例。該培養策略包括3個階段：0～24 h的無補料培養階段、24～40 h的C-μ-EF培養階段、40～102 h的LR-μ-EF培養階段。在C-μ-EF培養階段，μ同樣設定為0.05 h-1；在LR-μ-EF培養階段，μ按式(6)線性減小，其中ω設定為0.000 8 h-2。在整個C-μ-EF和LR-μ-EF培養階段，罐內葡萄糖(CS)和乙醇(CE)濃度無上升，溶氧(DO)始終維持在30%以上，生物量(CC)的實驗值與計算值基本一致。102 h時，累計補料體積達到560 mL，培養終了。此時，生物量達到77.5 g/L，與C-μ-EF策略相比提高了26.7%。由此可見，采用LR-μ-EF策略，可避免發酵液溶氧不足、克雷布特效應等問題。

Ⅰ：無補料培養階段；Ⅱ：C-μ-EF培養階段，μ(h-1)=0.05；Ⅲ：LR-μ-EF培養階段，μ(h-1)=0.05-0.0008(t-40)圖3　LR-μ-EF策略應用的一例Fig.3　An application example of LR-μ-EF strategy

3.2μ減小速度對酵母生產效率的影響

酵母生產效率采用最終生物量(CCF，g/L)、收率(YC/S，%)和生產速度[RC，g/(L·h)]進行評價。其中，CCF表示培養結束時單位體積的發酵液所含的酵母質量，強調酵母培養能力；YC/S表示生產酵母質量與消耗葡萄糖質量的百分比，強調基質利用效率；RC表示整個培養過程中單位體積的發酵液在單位時間內的生產酵母質量，強調酵母生產強度。

μ的減小速度可用式(6)中的ω來表示。ω越大，則μ減小速度越大。將ω分別設定為0、0.000 3、0.000 6和0.000 8 h-2，進行酵母的指數補料培養，當累計補料體積達到560 mL時結束培養。ω對酵母生產效率的影響如圖4所示。在0～0.000 8 h-2的ω范圍內，最終生物量、酵母收率和生產速度的實驗值均小于計算值。在理論計算中，因為酵母收率和培養基消耗量均為定值，所以最終生物量和酵母收率的計算值與ω的大小無關，分別保持在82.6 g/L和40.1%。而在實際上，ω=0(即C-μ-EF策略)時，最終生物量和酵母收率的測定值分別僅為61.2 g/L和29.8%。最終生物量和酵母收率的測定值隨ω的增大而逐漸上升，當ω=0.000 8 h-2時分別上升到77.5 g/L和38.0%，比ω=0時分別增加了26.7%和27.5%。

圖4中，酵母生產速度的實驗值和計算值都隨ω的增大逐漸下降。但另一方面，實驗值和計算值的差別隨ω的增大逐漸縮小。其原因是酵母收率的實驗值隨ω的增大逐漸上升，酵母生產速度實驗值的下降幅度較小。酵母生產速度的實驗值和計算值在ω=0時分別為0.9和1.2g/(L·h)，在ω=0.000 8 h-2時均下降到0.8 g/(L·h)。

圖4　ω對酵母生產效率的影響Fig.4　Effect of ω on the yeast production efficiency

3.3累計補料體積對酵母生產效率的影響

累計補料體積表示指數補料培養的延續性。在式(6)中ω=0(即C-μ-EF策略)和ω=0.000 8 h-2(即LR-μ-EF策略)的條件下，將累計補料體積分別設定為200、300、400、560 mL，進行酵母培養。累計補料體積對酵母生產效率的影響如圖5所示。在2種不同策略的培養中，最終生物量(CCF)均隨累計補料體積的增大呈上升趨勢。當累計補料體積從200 mL增加到560 mL時，ω=0條件下的最終生物量從43.4 g/L上升到61.2 g/L，而ω=0.000 8 h-2條件下的最終生物量從46.7 g/L上升到77.5 g/L。與ω=0條件相比，ω=0.000 8 h-2條件下最終生物量的上升幅度較大。與最終生物量相反，酵母收率(YC/S)隨累計補料體積的增大呈下降趨勢。當累計補料體積從200 mL增加到560 mL時，ω=0條件下的酵母收率從36.2%下降到29.8%，而ω=0.000 8 h-2條件下的酵母收率從40.9%下降到38.0%。與ω=0條件相比，ω=0.000 8 h-2條件下酵母收率的下降幅度較小。

圖5中，酵母生產速度(RC)在ω=0和ω=0.000 8 h-2條件下與累計補料體積無關，基本保持在0.8 g/(L·h)。

由上述可見，在200～560 mL的累計補料體積范圍內，LR-μ-EF策略與C-μ-EF策略相比，可提高最終生物量和酵母收率，同時保持酵母生產速度基本不變。

圖5　累計補料體積對酵母生產效率的影響Fig.5　Effect of overall feeding volume on the yeast production efficiency

ATASOY等[2]認為，在面包酵母的培養中需要從基質和空氣供給速度的兩方面限制乙醇生成，提高生物量。他們將基質和空氣供給的動態方程轉換成非線性規劃問題，并建立了控制矢量的優化演算方法，為動態發酵操作提供了理論依據。CHOPDA等[6]采用基于TCP/IP協議的解耦幾何控制器(decoupled input-output linearizing controller，DIOLC)進行面包酵母培養中葡萄糖和溶氧的動態控制，使得最終生物量比采用PID控制器時提高了23%。DIOLC控制器對基質和溶氧控制更加精細，有助于生物量的最大化。與此相比，本研究提出的LR-μ-EF策略，顯示了操作方便、酵母生產效率高的特點。

酵母生產效率不僅與補料策略有關，而且受菌種、發酵罐等多種因素的影響。目前的酵母工業化生產中，通常根據培養液中葡萄糖和乙醇的濃度來進行補料速度的反饋控制?？梢酝茰y，采用本研究提出的補料策略，同時結合發酵液中葡萄糖、乙醇濃度等測定值實時監測培養系統狀態，調整補料速度，則可進一步提高酵母生產效率。

4　結論

提出一種新的LR-μ-EF策略，并采用該策略進行抗凍酵母S.cerevisiaeAFY-1的3 L發酵罐培養試驗。得到的結論如下：

(1)當C-μ-EF培養階段的μ為0.05 h-1、LR-μ-EF培養階段的μ減小速度為0.000 8 h-2時，罐內葡萄糖和乙醇濃度無上升，溶氧始終維持在30%以上，生物量的實驗值與計算值基本一致。

(2)在累計補料體積560 mL的條件下，最終生物量和酵母收率隨著μ減小速度的增大而逐漸上升。當μ減小速度為0.000 8 h-2時，最終生物量和酵母收率分別為77.5 g/L和38.0%，與μ減小速度為0(即C-μ-EF策略)時相比分別增加了26.7%和27.5%。酵母生產速度基本與μ減小速度無關，保持在0.8～0.9 g/(L·h)范圍。

(3)當累計補料體積從200 mL增加到560 mL時，最終生物量和酵母收率在μ減小速度0.000 8 h-2的條件下分別增加和減少30.8 g/L、2.9%，而在μ減小速度0的條件下分別增加和減少17.8 g/L、6.4%。酵母生產速度與累計補料體積無關。

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Improvement of yeast production efficiency by an exponential feeding strategy based on linear reducing specific-growth-rates

JI Meng1, MIAO Ye-lian1*, CHEN Jie Yu2, YOU Ye-bing1,LIU Fei-long1, XU Lin3

1(College of Food Science and Light Industrial Engineering, Nanjing Technology University, Nanjing 211800, China)2(Faculty of Bioresource Science, Akita Prefectural University, Akita 010-0195, Japan)3(College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering, Nanjing Technology University, Nanjing 211800, China)

The production efficiency and cost of yeasts depend greatly on culture modes. A novel strategy for exponential feeding based on linear reducing specific-growth-rate (LR-μ-EF strategy) was proposed according to their growth characteristics. Fed-batch culture of freeze-tolerant yeastSaccharomycescerevisiaeAFY-1 was carried out in a 3L stirred tank bioreactor with the feeding strategy. The experimental values of biomass during culture were compared with calculated values. Then, the effects of feeding rate and overall feeding volume on yeast production efficiency were discussed, where the yeast production efficiency was evaluated based on final biomass, yeast yield and production rate. When the specific-growth-rate (μ) was 0.05 h-1in constant-μexponential feeding (C-μ-EF) culture stage, and theμdecrease rate was 0.000 8 h-2in LR-μ-EF culture stage, the experimental values of biomass agreed well with the calculated values. Under the condition of an overall feeding volume at 560 mL, the biomass and the yeast yield increased with the increasing ofμdecrease rate, and reached 77.5 g/L and 38.0% at theμdecrease rate of 0.000 8 h-2, respectively, which respectively increased by 26.7% and 27.5% in comparison with those in the culture withμdecrease rate of 0 (i.e. C-μ-EF strategy). In addition, the yeast production rate had no significant relationship withμdecrease rate, and fluctuated in the range of 0.8-0.9 g/(L·h). The results demonstrated superior capability of LR-μ-EF strategy for the improvement of yeast production efficiency, and provide useful information for the industrial production of yeasts.

yeast; batch culture; feeding strategy; specific growth rate; production efficiency

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201609006

碩士研究生(繆冶煉教授為通訊作者,E-mail：ylmiao@njtech.edu.cn)。

國家重點基礎研究發展計劃(2011CBA00807)

2016-03-21，改回日期：2016-04-27