Ⅳ期非小細胞肺癌患者外周血CD4+CD25+FOXP3+細胞分析

鐘運超，黃靜靜，張騫予，張康廣西梧州市人民醫院腫瘤科，廣西梧州543000

Ⅳ期非小細胞肺癌患者外周血CD4+CD25+FOXP3+細胞分析

鐘運超，黃靜靜，張騫予，張康
廣西梧州市人民醫院腫瘤科，廣西梧州543000

目的探討Ⅳ期非小細胞肺癌患者外周血CD4+CD25+FOXP3+Treg（Treg）細胞的百分比情況。方法選擇本院腫瘤科收治的33例Ⅳ期非小細胞肺癌患者和16例健康對照組人群，均在接受治療前空腹抽取外周血樣本并在流式細胞儀上做Treg細胞的測定。結果Ⅳ期非小細胞肺癌患者外周血Treg細胞百分比水平為（10.16±7.43）%，健康對照組為（11.93±4.78）%，兩者比較無明顯差異（P＞0.05）；若以患者的Treg細胞百分比平均值10%為基線，發現全組病例只有39.39%（13/33）的患者外周血Treg細胞百分比高于基線水平。結論Ⅳ期非小細胞肺癌患者外周血Treg細胞整體水平并不高于健康人群；但部分病例存在百分比增高現象?？蔀榕R床提供資料。

非小細胞肺癌；外周血；CD4+CD25+FOXP3+Treg細胞；Ⅳ期

肺癌的發生，發展與機體免疫平衡有關，其中T淋巴細胞為主的細胞免疫在其中起重要作用；而T淋巴細胞亞群中CD4+CD25+FOXP3+調節性T細胞是一群具有免疫抑制活性細胞，參與肺癌微環境中抑制機體免疫應答作用。據文獻報道［1-2］肺癌患者外周血的CD4+ CD25+FOXP3+細胞數量明顯增多，且隨腫瘤進展及分期升高而逐漸升高，導致腫瘤免疫逃逸。但也有不同的文獻報道［3］肺癌患者外周血的Treg細胞數量雖然增多，但肺癌Ⅰ期-Ⅳ期間沒有明顯差異。為了深入了解這種情況，本文就Ⅳ期非小細胞肺癌患者外周血CD4+ CD25+FOXP3+細胞的分布問題也作研究。擬為臨床提供資料。

1　資料與方法

1.1一般資料

取2013年1月～2014年12月在我院腫瘤科住院的Ⅳ期（TNM分期）非小細胞肺癌患者33例。男27例，女6例。中位年齡53歲。全部病例均取得病理診斷，其中鱗癌29例，腺癌3例。其他1例。每1病例均在首次治療前空腹抽外周血6 mL送檢。同時收集16例正常人群空腹抽外周血6 mL作為對照組。

1.2方法

1.2.1試劑和儀器CD4 percp（BD Bioscences），CD25 FITC（BD Bioscences），FOXP3（BD Bioscences），FACSTMPermeabilizing Solution2（10×）（BD Bioscences），BD FACSTMlysing Solution（10×）（BD Bioscences），PBS由博士德生物工程有限公司生產，臺式離心機Labofuge 400R Thermo Fisher產品；BD FACSCalibur流式細胞儀（BECTON DICKNSON），漩渦混均儀（VORTEX-GENIE）。

1.2.2檢測方法依據實驗Panel為樣本管編號，將待用抗體置于冰盒上備用。在試管中按Panel加入試劑規格要求的膜表面抗；根據細胞計數結果加入適量的樣本量；低速混勻3 s，室溫孵育20 min；向每個試管中加入紅細胞裂解液2 mL，混勻，在室溫避光10 min；溫育后立即在室溫離心1500 r/min，5 min；棄上清，加2 mLPBS重懸，低速混勻3 s，室溫離心1500 r/min，5 min，倒掉上清；加入1 mL破膜劑室溫避光10 min，室溫離心1500 r/ min，5 min，棄上清；加2 mL PBS洗滌，低速混勻3 s，室溫離心1500 r/min，5 min，棄上清；加入細胞內標記抗體，低速混勻3 s，室溫孵育30 min；向試管中加2 mLPBS重懸，低速混勻3 s，室溫離心1000 r/min，5 min，倒掉上清；最后加入0.5 mL含1%多聚甲醛PBS重懸，上機檢測。

1.3統計學方法

采用SPSS16.0統計學軟件進行處理。計數資料用百分比表示，計量資料用均數±標準差表示，組間用兩均數t檢驗比較，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

Ⅳ期非小細胞肺癌患者外周血CD4+CD25+ FOXP3+Treg占CD4+CD25+細胞百分比水平與健康對照組的無明顯差異（P＞0.05），兩組方差齊性分析：F= 1.176，P=0.284；說明兩組方差齊。檢測組與健康對照組比較，t=0.868，P=0.39，t檢驗95%區間為（-2.335，5.878）。若以檢測組Ⅳ期非小細胞肺癌患者外周血CD4+CD25+FOXP3+Treg占CD4+CD25+細胞平均值10%為基線，將全組病例細分為低于基線和高于基線水平兩組，結果顯示：全組病例外周血CD4+CD25+ FOXP3+Treg占CD4+CD25+細胞百分比低于基線占60.61%（20/33）；而高于基線水平占39.39%（13/33）。

3　討論

自身免疫性疾病是自身反應性T淋巴細胞在一定條件下針對自身組織所起的免疫反應，引起組織損傷的一組疾病。而腫瘤是正常組織在一定的條件下出現的細胞突變而成的。同時會表達一些腫瘤相關抗原，如CEA等。一般認為腫瘤相關抗原是機體的自身抗原成分，因此腫瘤免疫從某種程度上說是一種自身免疫。理論上腫瘤患者體內也存在自身反應性T細胞，它能識別這些相關抗原，并引起適宜的反應，消除這些腫瘤細胞。但實際上，臨床并沒有觀察到免疫排斥腫瘤組織的現象，而是促進腫瘤產生，增大和轉移等。增多的Treg細胞在腫瘤局部與CD8+T細胞之間相互作用抑制殺傷性T細胞的作用。因此雖然腫瘤患者體內有一定數量的CTL細胞存在，卻不能誘導有效的抗腫瘤免疫應答來抑制腫瘤生長［4］。說明在腫瘤生長過程中，Treg細胞增多總是伴隨抗腫瘤免疫的存在的［5］。肺癌患者外周血CD4+CD25+FOXP3+Treg細胞表面也表達CTLA-4標記，CTLA-4是Treg表面的免疫治療的靶點［6］。Ipilimumab單抗為針對CTLA-4人源化抗體，可以封閉CTLA-4信號通路，阻斷CTLA-4與APC表面的協調刺激分子B7結合介導的抑制性信號，從而激活T細胞，提高特異性抗腫瘤免疫反應［7］。肺癌患者外周血的CD4+ CD25+FOXP3+Treg細胞數量較正常人群明顯增多；且隨腫瘤進展逐漸升高，使Ⅳ期比Ⅰ期肺癌患者外周血的CD4+CD25+FOXP3+細胞數量明顯升高（P＜0.05）［1-2］。理論上，這些肺癌患者如果用Ipilimumab單抗封閉CD4+CD25+FOXP3+Treg細胞，就會提高機體抗腫瘤免疫反應，取得很好縮小腫瘤的效果。然而臨床上用Ipilimumab單抗免疫治療晚期惡性黑色素瘤患者，取得客觀有效率也只有10%～15%［8］。在肺癌方面，據2014 年ASCO年會數據顯示：聯合應用nivolumab和Ipilimumab治療非小細胞肺癌患者后，其客觀應答率也只有22%，疾病穩定率33%［9］。但大部分患者沒有取得客觀效果。原因值得研究。而本研究結果顯示：Ⅳ期非小細胞肺癌患者外周血CD4+CD25+FOXP3+Treg細胞的數量百分比并沒有比正常對照組人群的為高，沒有統計學差異（P＞0.05）。與相關文獻報道［10］相似。這可能與本研究病例數較少，或者可能與晚期腫瘤增大誘導血管內皮生長因子（VEGF）增多有關。據文獻報道［11-12］VEGF對CD34+造血干細胞向樹突狀細胞（DC）的分化具有強烈的抑制作用。不但可以抑制DC成熟，還可以阻斷DC的抗原遞呈作用，抑制DC等抗原遞呈細胞的分化，進一步影響細胞毒T細胞的擴增，活化及免疫殺傷作用。推測由于晚期腫瘤增大，VEGF也伴隨增多，對DC細胞活化受到抑制也會增強，DC細胞就沒有能力遞呈腫瘤抗原通過雙信號激活T細胞。沒有活化的T細胞，就不會伴隨負反饋的Treg細胞出現，可以部分解釋Ⅳ期非小細胞肺癌患者外周血CD4+CD25+FOXP3+ Treg細胞的數量百分比并沒有比正常對照組人群的高的現象。

就腫瘤個體化精準醫學而言，可將本研究病例的外周血CD4+CD25+FOXP3+Treg占CD4+CD25+細胞平均值10%為基線分層分析，發現本研究組的39.39%的病例存在CD4+CD25+FOXP3+細胞的數量百分比增高的現象。那么這部分病例采用Ipilimumab單抗或其他方法抑制或清除CD4+CD25+FOXP3+Treg細胞就可以提高機體抗癌功能，通過恢復機體抗腫瘤免疫使肺癌患者腫瘤縮小，達到延長生存期的目的。因此這項研究結果可能為臨床選擇免疫治療合適的對象提供指導參考。值得進一步研究。

［1］郭凈，劉忠達，張尊敬.非小細胞肺癌患者外周血CD4+CD25+ FOXP3+調節性T細胞的研究［J］.中國基層醫藥，2015，22（4）:510-3.

［2］李莎，李巖，梁婧，等.非小細胞肺癌患者外周血FOXP3+調節T細胞和Th17的檢測與臨床意義［J］.中華微生物學和免疫學雜志，2012，32（7）:642-6.

［3］梁晶.肺癌患者外周血Treg細胞與IL-10，TGF-b檢測及其臨床意義［J］.臨床肺科雜志，2015，20（11）:1980-3.

［4］李京有，姜乃德，林樂勝.轉錄因子FOXP3在肺癌患者中的表達及其臨床意義［J］.臨床醫學工程，2010，17（1）:31-3.

［5］Prestwich RJ，Errington F，Hatfield P，et al.The immune system-is it relevant to Cancer development，progression and treatment［J］.Clin Oncol（R Coll Radiol），2008，20（2）:101-12.

［6］王平章，馬大龍.調節性T細胞免疫治療策略［J］.中國醫藥生物技術，2015，10（1）:53-8.

［7］Hodi FS，O'day SJ，Mcdermott DF，et al.Improved survival with ipilimumab in patients with metastatic melanoma［J］.N Engl J Med，2010，363（8）:711-23.

［8］任軍，黃紅艷.靶向免疫檢查點的腫瘤免疫現狀及趨勢［J］.中國腫瘤臨床，2014，41（7）:415-9.

［9］Johnson DB，Rioth MJ，Horn L.Immune checkpoint inhibitor in NSCLC［M］.New york:springer science+Bussiness media，2014.

［10］張康，鐘運超，黃靜靜.Ⅳ期惡性腫瘤患者外周血CD4+CD25+ FOXP3+Treg細胞的測定［J］.右江民族醫學院學報，2015，37（5）: 713-4.

［11］Jackson MW，Roberts JS，Heckford SE，et al.A potential autocrine role for vascular endothelial growth factor in prostate Cancer［J］. Cancer Res，2002，62（3）:854-9.

［12］Takahashi A，Kono K，Itakura J，et al.Correlation of vascular endothelial growth factor-C expression with tumor-infiltrating dendritic cells in gastric Cancer［J］.Oncology，2002，62（2）:121-7.

2016-03-11

鐘運超，主治醫師，本科，E-mail:214878684@qq.com

張康，主任醫師，碩士研究生，E-mail:zlk2827120@126.com