異常血流動力對TLR4/NF—κB信號傳導通路及其下游炎癥因子的影響

朱曄斌+朱曄君+李淑珍

[摘 要] 目的 研究異常血流應力或壓力單獨作用對人臍靜脈內皮細胞（Human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）Toll樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）/NF-κB信號傳導通路及下游炎癥因子：血凝素樣氧化低密度脂蛋白受體-1（lectin-like oxidized low-density lipoprotein receptor-1，LOX-1）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、細胞間粘附分子-1（ICAM-1）及血管細胞粘附分子-1（VCAM-1）等的影響，探討異常血流動力導致動脈粥樣硬化的機制。方法 將生長良好的HUVECs以1×105個/ml密度接種于細胞綜合應力刺激實驗系統（型號BIO-CCS13）中進行干預。將HUVECs按所受的應力不同分成應力組、壓力組和正常組。在各組應力作用下培養一天后收集細胞備用，用qPCR方法測定TLR4、髓樣分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）、腫瘤壞死因子受體相關因子-6（tumor necrosis factor receptor-associated factor-6，TRAF-6）、血凝素樣氧化低密度酯蛋白受體-1（LOX-1）、核因子-κB（NF-κB）、TNF-α、ICAM-1及VCAM-1因子的基因表達，用蛋白質印跡方法測定TLR4、NF-κB、LOX-1、TNF-α、ICAM-1及VCAM-1因子的蛋白表達。結果 與正常組比較，應力組和壓力組TLR4、MyD88、TRAF-6、LOX-1、NF-κB、TNF-α、ICAM-1及VCAM-1mRNA表達水平顯著升高（P<0.01），TLR4、LOX-1、NF-κB、TNF-α、ICAM-1及VCAM-1蛋白表達顯著升高，差異有統計學意義（P<0.01）。結論 異常血流動力導致動脈粥樣硬化的機制可能與激活TLR4/NF-κB信號傳導通路和增強下游炎癥因子：LOX-1、TNF-α、ICAM-1及VCAM-1等的表達有關。

[關鍵詞] Toll樣受體4；壁面壓力；張應力；壁面切應力；動脈粥樣硬化

中圖分類號：R331 文獻標識碼：A 文章編號：1009-816X（2016）06-0415-04

[Abstract] Objective To study the effect of abnormal blood flow stress or pressure solely on expressions of Toll-like receptor 4 （TLR4）/NF-κB signaling pathway and downstream inflammatory factors in human umbilical vein endothelial cells （HUVECs）， namely lectin-like oxidized low-density lipoprotein receptor-1 （LOX-1）， tumor necrosis factor-α （TNF-α）， intercellular cell adhesion molecule-1 （ICAM-1）， vascular cell adhesion molecule-1 （VCAM-1）， as well as its possible mechanisms leading to atherosclerosis. Methods The HUVECs were divided into stress group， pressure group and normal group according to the different stresses. The 4th， 5th generation of HUVECs were inoculated in the cell synthetic stress stimulation test system （model bio-ccs13） at 1×105 cells/ml. The cells were collected respectively 24 hours after the stress of each group. The gene expressions of TLR4， myeloid differentiation factor 88 （MyD88）， tumor necrosis factor receptor-associated factor-6 （TRAF-6）， LOX-1， NF-κB， TNF-α， VCAM-1 and ICAM-1 were detected by qPCR， and the protein expressions of TLR4， NF-κB， LOX-1， TNF-α， ICAM-1 and VCAM-1 by Western blot. Results Compared with the normal group， mRNA expressions of TLR4， MyD88， TRAF-6， LOX-1， NF-κB， TNF-α， VCAM-1 and ICAM-1 increased significantly （P<0.01） in the stress group and pressure group； protein expressions of TLR4， NF-κB， LOX-1， TNF-α， VCAM-1 and ICAM-1 also increased significantly （P<0.01）. The difference was statistically significant. Conclusions The mechanism of abnormal blood flow stress or pressure leading to atherosclerosis might be associated with the activation of TLR4/NF-κB signal transduction pathway and the enhancement of its downstream inflammatory factors， such as the expressions of LOX-1， TNF-α， VCAM-1 and ICAM-1.

[Key words] Toll like receptor 4；wall pressure；circumferential strain；wall shear stress；Atherosclerosis

動脈粥樣硬化（Atherosclerosis，AS）是一種常見的大中動脈發生粥樣病變性疾病。它的發病機制目前多數學者認為與內皮細胞損傷、慢性炎癥有密切的關系。實驗研究發現Toll樣受體4（Toll like receptor4，TLR4）能夠促進血管內皮細胞（EC）合成與釋放炎癥因子，引發炎癥反應。而動脈壁的多種細胞都能表達Toll樣受體（TLRs）如：內皮細胞、巨噬細胞及平滑肌細胞等，這些細胞的TLR4被激活后可引發炎癥反應。在內皮細胞損傷、慢性炎癥導致AS的發病機制中TLR4扮演著重要角色[1]。目前的研究表明：AS的發生和發展與EC的結構和功能變化有著密切的關系。EC在體內不斷地受到血流動力作用。這些力可分為由血管內流體靜力所產生的壁面壓力（WP），由EC間的聯接在血管舒縮運動過程中產生的張應力（CS），以及由血液流動所產生的壁面切應力（WSS）。適當的應力對于維持血管內皮細胞正常的生理功能必不可少，但如果應力和壓力變化超過域值（如應力大，壓力小或應力小，壓力大），內皮細胞會發生病變，導致AS[2]。

異常血流動力能否通過激活血管內皮細胞TLR4/核因子-κB（NF-κB）信號傳導通路，促進下游炎癥因子的生成，來影響AS炎癥反應的發展。目前，尚無這方面的相關報道[3]。本實驗通過觀察人臍靜脈內皮細胞在應力（為切應力和張應力之和）或壓力的單獨作用下，對血管內皮細胞TLR4/NF-κB信號傳導通路及下游的炎癥因子表達的影響，從血管內皮細胞所受作用力的角度探討AS的發病機制，為闡明異常血流動力導致AS的可能機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 細胞株：人臍靜脈內皮細胞株ECV304（上海豐壽生物科技有限公司）。

1.2 試劑及儀器：人臍靜脈內皮細胞完全培養基、胎牛血清購自上海素爾生物科技有限公司，PCR引物（上海生物工程技術有限公司），反轉錄試劑盒、qPCR試劑盒（大連寶生物工程有限公司），TLR4、NF-κB、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、血凝素樣氧化低密度脂蛋白受體-1（LOX-1）、細胞間粘附分子-1（ICAM-1）及血管細胞粘附分子-1（VCAM-1）因子一抗和羊抗兔抗體（二抗）購自上海碧云天生物技術有限公司。Hema9600基因擴增儀、GSG-2000核酸/蛋白凝膠圖像分析系統：珠海黑馬醫學儀器有限公司。細胞綜合應力刺激實驗系統（型號BIO-CCS13）：3Think公司。

1.3 HUVECs的培養與分組：將HUVECs株ECV-304于37℃、5%CO2的培養箱中用含10%FBS的改良型1640培養基培養傳代至4～5代，將細胞以1×105個/ml接種于細胞綜合應力刺激實驗系統（型號BIO-CCS13）中，待細胞生長良好時隨機將HUVECs按所受的應力和壓力不同分成應力組、壓力組和正常組，每組12孔。對應力組HUVECs施加20dyne/cm2的切應力和15%應變量的張應力。對壓力組HUVECs施加12.0kPa的壓應力。對正常組HUVECs施加20dyne/cm2的切應力、15%應變量的張應力和12.0kPa的壓應力（接近正常生理時血管內皮細胞所受的力）[4]。應力組、壓力組和正常組在各自應力的持續作用下，培養24h后收集細胞，以用于后續實驗。

1.4 TLR4、髓樣分化因子88（MyD88）、腫瘤壞死因子受體相關因子-6（TRAF-6）、NF-κB、TNF-α、LOX-1、ICAM-1及VCAM-1mRNA的檢測：采用qPCR的方法檢測其mRNA的表達。收集細胞，用Trizol提取總RNA后檢測純度和完整性，用逆轉錄試劑盒生成cDNA、PCR儀擴增目的基因觀察結果。循環參數：95℃預變性7min，30個循環（95℃、45s，57℃、30s，72℃、40s），72℃延伸3min。PCR引物使用Primer5.0引物設計軟件從Gene Bank獲得，以GAPDH為內參。由上海生物工程技術有限公司合成。引物序列見表1。電泳結束后由GSG-2000核酸凝膠圖像分析系統計算得出Ct值，用2-△△Ct方法計算和統計?！鳌鰿t（實驗對照組-空白對照組）=△Ct（實驗對照組）-△Ct（空白對照組）。

1.5 TLR4、NF-κB、LOX-1、TNF-α、VCAM-1及ICAM-1蛋白表達檢測：采用Western blot法檢測目標蛋白的表達。以1×106個/ml濃度收集細胞，用含PMSF（100mM）的裂解液，于冰上裂解30min，離心取上清分裝置-70℃冰箱保存備用。用BCA法測定樣品蛋白濃度，以每泳道60μg樣品蛋白上樣，SDS-PAGE電泳后，將分離膠中樣品蛋白于電轉移槽中轉移至硝酸纖維素膜，加適當濃度一抗，室溫孵育1.5h，用TBST在脫色搖床上洗滌3次，加入辣根過氧化物酶標記的適當濃度的二抗，置室溫1h后用TBST洗滌2次，進行化學發光反應、顯影、定影，用凝膠圖象處理系統分析目標帶的凈光密度值。

1.6 統計學處理：全部實驗數據采用SPSS19.0版統計軟件進行分析，計量資料采用（x -±s）表示，資料服從正態分布，直接采用方差分析，組間兩兩比較用LSD檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 TLR4/NF-κB信號傳導通路各因子mRNA表達水平比較：見表2。與正常組比較，應力組和壓力組各因子mRNA表達顯著升高，差異有統計學意義（P<0.01）。

2.2 三組中TLR4、NF-κB、LOX-1、TNF-α、VCAM-1及ICAM-1蛋白表達水平比較：見表3。與正常組比較，壓力組和應力組TLR4、NF-κB、LOX-1、TNF-α、VCAM-1及ICAM-1蛋白表達水平明顯升高，差異有統計學意義（P<0.01）。

3 討論

TLRs屬于I型跨膜蛋白模式識別受體，可表達于多種人類體細胞表面，HUVECs高度表達TLR4。TLRs通過跨膜信號傳遞作用介導先天性免疫應答和炎癥反應，在細胞跨膜活化信號的轉導中起著非常重要作用。TLRs通過調節先天性免疫應答和獲得性免疫應答而將二者緊密聯系[5，6]，TLRs中，TLR4研究的最多且與AS的發生和發展關系最密切。

進一步研究表明激活EC和平滑肌細胞膜表面的TLR4/NF-κB信號傳導通路可以誘導其合成與釋放大量的與AS相關的炎癥因子，這些炎癥因子促進AS的發生，而且在AS斑塊中TLR4顯著高表達[7]。與此同時，TLR4還可以介導巨噬細胞向血管內膜下遷移，同時強烈增殖平滑肌細胞[8]，進入內膜的巨噬細胞吞噬脂質后就形成了泡沫細胞，平滑肌細胞過度增殖和泡沫細胞大量堆積導致AS的形成。Hayashi等[9]研究發現，TLR4缺乏組小鼠與對照組相比其AS斑塊面積明顯減小。

關于TLR4的研究表明，TLR4信號傳導通路包括MyD88依賴性途徑和MyD88非依賴性途徑，其中前者可激活NF-κB，活化后的NF-κB能夠促進其下游的炎癥因子（LOX-1、ICAM-1、VCAM-1及TNF-α）高表達。而這些炎癥因子均可促進AS的形成[10～12]。

本實驗結果表明，在正常生理條件下（正常組）血管內皮細胞同時受張應力、切應力、壓力的平衡作用，TLR4這一模式識別受體在平衡力作用下不被激活，MyD88依賴性信號傳導通路處于封閉狀態，下游LOX-1、TNF-α、VCAM-1及ICAM-1等AS標志性炎癥因子低水平表達，AS不發生。當血管內皮細胞單獨受應力（為張應力和切應力之和）或壓力作用時，血管內皮細胞所受應力和壓力不平衡（如應力不變，壓力小或應力小，壓力不變），TLR4在不平衡力作用下被激活，進而激活下游MyD88依賴性信號傳導通路，下游LOX-1、TNF-α、VCAM-1及ICAM-1等炎癥因子高表達，促進AS的發生和發展。因此，異常血流動力因素通過激活TLR4/NF-κB信號傳導通路和增強下游炎癥因子的表達，導致AS，這可能是AS發生的機制之一。

參考文獻

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（收稿日期：2016-9-3）