具產電性能光合細菌DH-3的分離及其對多種底物污水處理能力的評價*

于士翔 王文靜 劉 峰 劉芳華

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具產電性能光合細菌DH-3的分離及其對多種底物污水處理能力的評價*

于士翔1, 2王文靜1劉 峰2①劉芳華1②

(1. 中國科學院煙臺海岸帶研究所 海岸帶生物學與生物資源利用重點實驗室, 煙臺 264003; 2. 中國農業大學煙臺研究院 海洋學院水產養殖學系, 煙臺 264670)

本文通過傳統微生物分離培養方法從富營養化環境中分離培養出可高效處理多種底物的污水并具備胞外電子傳遞能力和產電潛力的兼性厭氧光合細菌。在光照培養條件下, 利用改良的能夠將光合細菌富集/分離的培養基分離培養光合細菌, 從形態學和16S rDNA的分子生物學角度鑒定菌株。運用多個指標檢測光合細菌處理不同底物的污水培養基的能力, 如化學需氧量(chemical oxygen demand, COD)、總氮(total nitrogen, TN)、總磷(total phosphate, TP), 并在電化學工作站檢測光合細菌的產電能力。結果表明, 獲取的光合細菌菌株DH-3與光合細菌類球紅細菌()有97%的相似性。該菌株擁有在多種底物的污水培養基中生長的能力, 其中在以乙酸為底物的培養基中生長最好。通過檢測發現該菌株對污水的COD、TN和TP均具有較高的去除率。電化學工作站檢測結果表明, 菌株DH-3的最大產電流量能達到7.5mA/m2, 最大功率密度達到0.056W/m2。由此可見, 光合細菌DH-3在污水處理及資源再循環利用等方面具有十分重要的應用潛力。

光合細菌; 產電性能; 化學需氧量; 污水處理; 有機物降解

光合細菌(photosynthetic bacteria, PSB)是地球上出現最早, 自然界中普遍存在并具有原始光能合成體系, 以光為能源、二氧化碳和有機物作為光合作用供氫體兼底物的不產氧兼性厭氧原核微生物(宋志文等, 2003; 李福枝等, 2008)。光合細菌菌體能夠提供環境生物體所必需的營養, 含有氨基酸、生物必需維生素、抗病毒活性因子、輔酶Q及多種生理活性物質; 還可通過光合作用, 維持物質循環, 降解廢棄有毒物質, 凈化水質和改善環境(Nath and Das, 2009; Chitapornpan et al., 2012)。光照厭氧條件下, 絕大多數光合細菌可利用硫化物、單質硫、硫代硫化物、分子氫或有機物作為電子供體(謝磊等, 2000; Li et al., 2016), 通過光合磷酸化過程獲得能量。光合細菌能耐受高濃度有機物, 具有去除和分解有機物的能力(何萍等, 2002; 何劍丹, 2005), 如紅螺菌科(Rhodospirillaceae)的菌株能夠在厭氧光照、好氧黑暗條件下迅速利用小分子有機物(毛雪慧, 2009)。同時, 有大量研究表明, 部分光合細菌在進行代謝的同時伴隨著產電現象, 通過光合細菌在光微生物燃料電池領域中的應用與發展, 可實現其在降解污水的同時產生大量的電能, 這極大程度地提升了電能的利用。因此光合細菌在水產養殖業、環境治理、新能源開發利用、醫藥開發等領域均具有廣闊的應用前景(周佳等, 2006)。

雙室微生物燃料電池是一種利用產電微生物的代謝生長產生電能的裝置。該裝置由陽極室、陰極室和離子交換膜組成。光合細菌可在陽極通過自身的光合作用或者呼吸作用產生電子或質子, 電子通過導線傳遞給陰極受體, 質子則是通過離子交換膜進入陰極室內, 這樣就形成了一個可以產電的閉合回路。通過將光合細菌與雙室微生物燃料電池相結合, 可以使污水資源化, 但是常見的光合細菌只能高效降解污水污染物而無法產電, 或者是能產電但降解污水污染物的能力很弱。本文研究的一株光合細菌可以兩者兼具, 在降解污水污染物的同時產生電能, 在應用于可持續發展的新技術研發中具有可行性。并且, 目前在光合細菌處理污水的多數相關研究中, 污水是單一底物, 而實際生活中污水含有多種可供給光合細菌利用的底物, 本文就多種底物進行了相應的研究, 發現該株光合細菌在同時處理多種底物污水方面同樣具有很大潛力。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

對Kim等(1999)所報道的研究中光合細菌分離方法進行改良優化后, 本實驗采用先富集后分離的方法對光合細菌進行分離。富集培養基: NH4Cl 1g/L, K2HPO40.2g/L, CH3COONa4g/L, MgSO4?7H2O 0.2g/L, NaCl 0.1g/L, NaHCO30.01mg/L, 維生素B1 0.001mg/L, 乙尼克丁酸0.1mg/L, 對氨基苯甲酸0.1mg/L, 生物素0.001mg/L, FeCl3?6H2O 5μg/L, CuSO4? 5H2O 0.05μg/L, H3BO40.05μg/L, MnCl2?4H2O 0.05μg/L, ZnSO4?7H2O 1mg, Co(NO3)2?6H2O 0.5μg/L; pH為7.0; 高壓滅菌鍋(型號LDZX- 50KBS, 上海申安醫療器械廠)進行高溫高壓滅菌(1×105Pa, 30min)。

分離培養基: NH4Cl 1g/L, MgCl20.2g/L, K2HPO40.5g/L, NaCl 2g/L, NaHCO30.1g/L, Na2S?9H2O 0.01g/L, 酵母膏0.1g/L, 瓊脂20g/L。高壓滅菌后, 倒入無菌的培養皿中。

取武漢東湖表層底泥沉積物接入裝有100mL無菌富集培養基的帶玻璃塞的厭氧磨口瓶中, 置于30°C、2000lux的全光照培養箱(型號GPX-250B, 上海百典儀器廠)中培養。富集后的微生物采用液體培養法和瓊脂平板涂布法相結合, 在厭氧操作箱(G4350A, Coy Laboratory, 美國)內反復挑取瓊脂固體培養上生長的單菌落進行培養, 多次純化后獲得純菌株, 命名為DH-3。

1.2 光合細菌的分子生物學鑒定

1.2.1 菌體DNA的提取 挑取瓊脂平板上的單個菌落DH-3, 放入37°C搖床中, 在自然光照條件下進行過夜培養, 利用細菌提取試劑盒(DP302, 北京天根生化科技有限公司)提取菌株DH-3的總基因組。

1.2.2 16S rRNA基因的PCR擴增及基因序列分析 以1.2.1中提取的細菌總DNA為模板, 進行16S rDNA擴增, 引物為16S rDNA通用引物(27F: 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTC AG-3′和1492R: 5′-TACGGCTACCTTGTTAC GACTT-3′), 由上海英濰捷基生物公司合成。PCR反應體系(25μL): 10×PCR Buffer 2.5μL, MgCl21.5μL, dNTP 2μL, 模板DNA 2~5μL, 引物27F/1492R各0.5μL, Taq酶(1U/μL)0.5μL, 無菌水 15.5μL。PCR反應條件: 95°C預變性6min; 94°C變性1min, 56°C退火1min, 72°C延伸2min, 擴增30個循環; 最后72°C延伸10min。PCR產物的回收: 對PCR產物進行1.5%的瓊脂糖凝膠電泳, 將目的條帶切下, 利用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(DP209, 北京天根生化科技有限公司)純化回收。測序: 將回收的目的產物送至上海英濰捷基生物公司完成測序。將菌株DH-3的16S rDNA序列在RDP(Ribosomal Database Project-II; http://rdp. cme.msu.edu/seqmatch/seqmatch_intro.jsp)數據庫中進行同源性檢索, 利用MEGA 5.0軟件的unweighted pair-group method with arithmetic方法對收集序列進行聚類分析。

1.3 光合細菌在污水培養基中的生長

1.3.1 人工污水培養基 人工污水培養基配方參照(Feng et al., 2011), 包括Glucose 4.125g/L, NH4Cl 0.78g/L, KH2PO40.18g/L, MgSO4?7H2O 0.13g/L, CaCl2?2H2O 0.43g/L, FeSO4?7H2O 0.05g/L, A5 solution 1mL/L (A5 solution: H3BO32.86g/L, MnCl2?4H2O 1.86g/L, ZnSO4?7H2O 0.22g/L, Na2MoO4?2H2O 0.39g/L, CuSO4?5H2O 0.08g/L, Co(NO3)2?6H2O 0.05g/L)。

其他多種底物的培養基是在人工污水培養基的基礎上, 分別采用乙酸(acetic acid)、蘋果酸 (malic acid)、丙三醇 (glycerin)、乙醇(ethanol)等替換人工污水培養中的葡萄糖(glucose)。將西林瓶中的污水培養基進行厭氧無菌處理后, 在無菌操作臺內用無菌的一次性注射器轉接種光合細菌DH-3, 每個處理組設5個重復, 每日取樣測定光密度(optical density, OD)、化學需氧量(chemical oxygen demand, COD)、底物和總氮(total nitrogen, TN)的變化, 取樣后至測定前保存至–80°C。

1.3.2 不同指標的檢測方法 在采用人工污水培養基培養光合細菌DH-3過程中, 同時檢測以下與污水處理有關的指標及DH-3產電活性研究:

①OD值的測定: 紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司, TU-1810)在600nm波長下測定光合細菌的OD值。

②COD的測定: 使用杭州陸恒生物科技有限公司生產的COD快速測定檢測試劑盒測定COD, 通過與試劑盒內比色卡比對顏色, 得出COD值的大致范圍。所測的值越大, 表明液體中的COD濃度越高。將菌株DH-3培養于以乙酸為底物的污水培養基中, 每隔8小時取樣測定。

③有機底物的測定: 取0.3mL培養液在10000r/min下離心2min, 用移液槍吸取20μL上清液置于1.5mL離心管中, 加入980μL無菌水稀釋50倍。稀釋后的液體經0.22μm纖維素微孔徑濾膜(GSWP04700, Millipore, 美國)過濾到進樣瓶中, 利用高效液相色譜(Agilent 1260 Infinity, 美國)檢測。

④TN和TP的測定: 取人工污水培養基的菌液用0.22μm纖維素微孔濾膜(GSWP04700, Millipore, 美國)過濾后, 分別取10mL菌液, 利用國標測定法測定培養基中的TN和TP(Jin and Tu, 1990; Niu et al., 2011)。

⑤光合細菌的電化學活性研究: 采用玻璃材質的雙室微生物燃料電池檢測光合細菌DH-3的產電能力。培養條件為溫度30°C, 光照周期12h︰12h, 光照強度2000lux。陽極室與陰極室均為100mL。兩室之間采用陽離子交換膜(CMI7000, 美國)為隔膜, 石墨電極。石墨電極表面積為20.22cm2, 外加1000Ω電阻, 采用鈦絲連接外電路及電池。陽極室進行高溫消毒無菌處理, 在無菌操作臺組裝充氣, 加入菌落并確保是單菌落及厭氧環境, 陰極室為50mmol/L的鐵氰化鉀溶液(100mmol/L PBS配制, pH7.0), 接入電化學工作站, 利用數據采集系統(Model 2700, 購自美國吉時利儀器公司)采集數據。記錄輸出電壓, 根據外加電阻及電阻表面積, 計算電流密度, 利用origin 8.0分析數據并作圖。

2 結果與討論

2.1 光合細菌的鑒定

菌株DH-3在形態學上為紅色菌落, 菌落表面有光澤、不透明、有突起, 菌落邊緣整齊, 光學顯微鏡下細菌形態為桿狀, 革蘭氏染色為陰性, 所得光學顯微鏡照片如圖1所示。16S rDNA序列分析表明, DH-3與類球紅細菌()的相似度達到97%。從GenBank基因數據庫下載與DH-3相似性較高菌株的16S rDNA 序列并進行的聚類分析得圖2。從圖2中可看出DH-3與類球紅細菌的系統發生地位最為接近。將DH-3的16S rDNA序列提交至DDBJ(DNA Data Bank of Japan)數據庫, 序列號為LC198619。

圖1 DH-3菌落的光學顯微鏡照片(放大倍數為10*100)

圖2 基于16S rDNA的菌株DH-3和其他菌株的非加權組平均法基因序列聚類分析

2.2 菌株DH-3對不同底物的利用

在污水培養基的基礎上, 改變原有乙酸底物, 加入不同單一種類的底物后, 觀察DH-3對不同底物的利用情況, 其結果如圖3所示。在生長方面, 其生長分為四個時期, 分別為延滯期(數量維持接種時數量或略有下降)、指數生長期(數量呈現指數形式的增長)、穩定期(增長速度減慢數目基本維持不變)和衰退期(數量大幅度減少)。在對不同底物的利用方面, 底物種類對DH-3的生長具有顯著的影響: 在以乙酸為底物的培養基中, DH-3的生長狀況最好, 在實驗最初生長速度一直呈指數上升, 后期底物含量減少, DH-3生長速度減緩; 在葡萄糖和丙三醇培養基中, DH-3生長速度比較穩定, 表明它可快速利用以葡萄糖為底物的培養基; DH-3在以乙醇和蘋果酸為底物的培養基中同樣可以生長, 但是生長較為緩慢。通過光合細菌處理不同底物的污水培養基, 發現DH-3對不同的底物具有不同的利用效果, 它可以更好地利用以乙酸、葡萄糖和丙三醇為底物的培養基。DH-3將添加的乙酸等多種底物通過三羧酸循環進行代謝, 從中獲取能量和碳源是其去除廢水中有機污染物的基礎。

圖3 光合細菌在不同底物培養基中的生長曲線

表1為接種96h之后所測得的底物濃度。結果表明, 培養基中的底物在DH-3生長過程中逐漸減少。目前大多有關光合細菌處理污水的研究集中于單一的底物污水(李瑞杰, 2004)。鄭偉華(2009)利用光合細菌法去除高濃度淀粉廢水COD時, COD的去除率能達到90%以上。張昊等(2014)研究光合細菌處理馬鈴薯淀粉廢水實驗也表明光合細菌對于COD具有很好的去除效果。與之前研究相比, 菌株DH-3可降解利用表1中所示的多種底物。綜上表明: 底物種類對光合細菌DH-3的生長具有顯著的影響, DH-3可降解利用多種底物, 對以乙酸為底物的污水培養基利用效率最高。針對光合細菌降解多種底物能力的研究對細菌處理復雜污水是非常必要的。

表1 光合細菌DH-3對多種底物的利用

2.3 污水培養基中COD的變化

如表2所示, COD快速測定試劑盒的檢測結果表明, 隨著菌株DH-3在培養基中生長時間的增加, COD值變小, 最終污水培養基的COD去除率達到90%以上, 表明DH-3在實驗中具有明顯去除污水培養基中COD的作用。

2.4 污水培養基中氮磷的變化

DH-3對人工污水培養中氮磷的消耗利用如圖4和圖5所示, 培養基內TN、TP的初始濃度分別為10.6mg和3.5mg。在加入DH-3后, 第1天TN含量在10.2mg左右, 10天后TN降低至約4mg。污水培養基中的磷也由接入DH-3后第2天的3.75mg降低至0.75mg(第9天)。實驗證實, DH-3對氮磷具有一定的利用和去除作用, 在以乙酸為底物的污水培養基中, DH-3對氮的去除率達到60.7%, 對磷的去除率達到80%。我們推測菌株DH-3在厭氧條件下, 通過反硝化作用將硝酸氮還原為氣態氮, 同時可直接吸收磷, 在菌體細胞內形成聚磷酸鹽內含物, 達到脫氮脫磷的效果。大多數光合細菌具有固氮、產氫的功能特點, 本實驗中利用氣相色譜儀并沒有檢測到DH-3培養管中氫氣的產生, 但該菌株是否可以利用其他底物產生氫氣, 有待進一步研究。

表2 基于COD快速測定試劑盒的方法測定COD濃度的變化

注: 三個處理組1, 2, 3為三個平行樣品。

圖4 污水培養基中總氮隨時間的變化

圖5 污水培養基中總磷隨時間的變化

2.5 光合細菌的電化學活性研究

菌株DH-3的產電能力如圖6所示: 接入微生物燃料電池后第1~3天, DH-3由于剛進入新環境, 需要一定的適應期, 所以電流變化相對紊亂, 但是逐漸趨于穩定, 最終電流輸出達到7.2mA/m2; 第4~5天, DH-3的電流穩定輸出, 并且呈現出與光照有關的電流輸出變化, 在光照期間, 電流輸出能達到7.4mA/m2, 黑暗期間, 電流逐漸下降到5.9mA/m2; 第6天后, 由于培養基內的有機物已經消耗殆盡, DH-3的細菌濃度有所下降, 因而其電流輸出開始下降; 培養至第10天, 光合細菌最低電流輸出為3.1mA/m2。菌株DH-3在處理以乙酸為底物的污水培養基的同時, 可產生電流, 因此可以推斷菌株DH-3實現了資源的循環再利用。

圖6 乙酸培養基中DH-3的電流密度隨時間的變化

3 結論

(1) 從武漢東湖分離到一株光合細菌DH-3, 通過菌落形態學和16S rDNA序列分析, 菌株DH-3與類球紅細菌的相似性最高, 可達到97%。

(2) 菌株DH-3在處理污水時不但可高效降解污水, 降低污水培養基中的氮磷濃度, 還可利用多種有機底物, 說明該菌株在高效降解多種有機底物的污水時具有較大的潛力。

(3) 本研究分離的菌株DH-3表現出罕見并且良好的產電特性, 可以實現在降解污水的同時提供電能, 實現污染物資源化。所以菌株DH-3在未來污水處理實現資源回收再利用方面具有重要的應用潛力。

4 展望

光合細菌在環境中具有很強的適應性、兼性厭氧的特性。一方面, 光合細菌能以不同的醇類和有機酸等作為光合作用中所需的供氫體和底物(Inui et al., 1995; 宋志文等, 2003), 光合細菌如紅假單胞菌(Rhodopseudomonas)能將產氫、光能利用和有機物的去除三者有機地耦合在一起(Kobayashi and Tchan, 1973; Hülsen et al., 2016), 實現高效的能量利用過程。另一方面, 光合細菌可利用自身較強的去除和分解有機物的生理特性, 使其在污水發酵處理過程中占據重要角色(崔寶臣等, 2010)。光合細菌能夠承受高濃度的有機廢水并進行高效率處理(張全國等, 2012), 在處理過程中無有害物質的產生, 還產生如胡蘿卜素和蛋白等其他營養價值的副產物, 光合細菌進行水處理是一種更為環保節能的生物方法。除此之外, 已有研究表明, 光合細菌可實現CO2捕捉和光電轉換等多重功能(徐金球等, 2013)。

對于光合細菌在污水處理中的應用效果, 還存在著很多重要的影響因素, 如光照在污水處理中對光合細菌的生長、光能轉化成化學能的過程具有非常重要的作用(Schagerl and Müller, 2006; Zhou et al., 2014)。在特定的培養條件下, 光合細菌處理污水的效率及能量回收能力往往會受到光照強度的影響(Qu et al., 2011; Zhang et al., 2014)。其次, 高效處理污水的光合細菌菌株的培養和馴化, 在研究光合細菌處理污水過程中十分重要。目前雖然已有部分報道已分離到高效降解污水的光合細菌(周佳等, 2006; 周洪波等, 2006), 但是光合細菌在處理污水過程中如何適應復雜的污水環境, 在處理污水后如何將菌體進行有效安全的分離及光合細菌代謝產物的獲取提純, 實現污水的能量回收, 都將是未來研究的重點。

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Isolation and Application Potential of Photosynthetic Bacterium Strain DH -3 with Electricity Production in the Wastewater Treatment

YU Shi-Xiang1, 2WANG Wen-Jing1LIU Feng2*LIU Fang-Hua1*

(1. Key Laboratory of Coastal Biology and Biological Resources Utilization, Yantai Institute of Coastal Zone Research, Chinese Academy of Sciences, Yantai 264003, China; 2.China Agriculture University, School of Ocean, Yantai 264670, China)

In this study, from a eutrophic lake we enriched and separated photosynthetic bacteria, which can consume sewage as well as initiate extracellular electron transfer and thereby produce electricity. We isolated and purified photosynthetic bacteria from improved enriched media and isolated media and identified them using morphological and molecular methods. We used the national standard method and spectrophotometry to determine the chemical oxygen demand, total nitrogen, and total phosphate. To detect the electricity production of the photosynthetic bacteria, we used an electrochemical workstation. Our results show that the photosynthetic bacteria strain DH-3 has high similarity with. We found the removal rates of COD, TN, and TP to decrease in the wastewater medium. The electrochemical workstation detected that strain DH-3 produced maximum electricity at 7.5 mA/m2and maximum power at 0.056 W/m2. Our results indicate that strain DH-3 has potential application in future wastewater treatment and resource recovery technologies.

Photosynthetic bacteria; Electricity production; Chemical Oxygen Demand; Sewage treatment; Organic matter degradation

X703

10.12036/hykxjk20170705001

國家自然科學基金青年基金(31600370, 41401285); 國家自然科學基金面上項目(41371257, 41573071); 中國科學院“百人計劃”。于士翔, 男, 學士, 主要從事水產養殖研究, E-mail: 1441342189@qq.com

劉 峰, 男, 副教授, 從事水產養殖方面研究, E-mail: 869272328@qq.com

②共同通訊作者: 劉芳華, 男, 研究員, 從事微生物電子傳遞機制研究, E-mail: fhliu@yic.ac.cn

2017-07-05,

2017-08-01