中藥腦心同治藥理學研究平臺構建及丹紅注射液腦心同治機制研究

趙筱萍+余韞如+李雪+邵青+王益民+趙濤+趙超+趙步長+王躍飛+王毅

[摘要] 腦心同治理論是基于中醫傳統理論并結合臨床實踐發展而來，該文提出了在腦心同治理論基礎上，構建中藥腦心同治藥理學研究平臺的思路，包括腦心同治網絡建模、藥效物質發現、作用機制研究以及腦心同治方藥體內過程研究等。該文以腦心同治網絡建模為例，采用數據庫以及文獻搜索收集疾病相關基因，并通過網絡構建與模塊分析，最終發現心、腦血管疾病相關的關鍵生物過程包括氧化應激、代謝、炎癥等，其中GSK3B，NOTCH1，CDK4等基因占據網絡子簇中關鍵節點。運用該研究平臺，獲得了丹紅注射液主要成分調控的生物分子網絡模型，從而發掘其治療心腦血管疾病的共有靶點與作用途徑。其中，GSK3B在網絡中與丹紅注射液成分相關性最多，且其所在的子簇涉及到的生物功能有細胞氧化應激。根據分析結果，在氧化損傷心肌細胞與神經細胞模型上驗證了丹紅注射液可顯著提高氧化損傷后心肌細胞與神經細胞的存活率，其保護機制與提高GSK3β蛋白磷酸化水平有關，且丹參與紅花配伍具有協同效應。以上結果顯示，采用網絡建模等方法，可研究揭示丹紅注射液等腦心同治方藥治療心腦血管疾病的作用機制。該研究提出的中藥腦心同治藥理學研究平臺框架，為綜合運用現代科技手段科學揭示“腦心同治”的機制提供了可行途徑。

[關鍵詞] 腦心同治； 丹紅注射液； 網絡藥理學； 氧化應激

[Abstract] The Concurrent treatment of the brain and heart （CTBH） theory is proposed based on traditional Chinese medical theory and clinical practice. In this study， a framework for the pharmacological research platform was established to investigate the principles of concurrent treatment of the brain and heart. The platform for CTBH includes several key techniques for network modeling， discovery of active substances， dissecting mechanism of action and investigation of pharmacokinetic property of TCM. Taking network modeling of CTBH as an example， using database search， literature mining， network construction and module analysis， the that network modules closely associated with the pathological progress of cardiovascular and cerebrovascular diseases were identified， while further functional enrichment analysis of these modules indicated that the key biological processes included oxidative stress， metabolism and inflammation. GSK3B， NOTCH1， CDK4 were identified as key nodes in these network modules. The above-mentioned platform was applied to construct component-biomolecules network of Danhong injection for the identification of common targets and pathways. Among them， GSK3B had the highest correlation with the composition of Danhong injection in the network， and the biological function of whose cluster was related to cell oxidative stress. Based upon results of network analysis， validation experiments suggested that Danhong injection significantly improved the survival rate of oxidative injured myocardial cells and nerve cells， and the protective effect was related to the increase of phosphorylated GSK3β protein expression. Moreover， extracts of Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma and Carthami Flos exerted the synergisticcytoprotective effect. The results indicated that the mechanism of treatment of cardiovascular and cerebrovascular diseases of Danhong injection could be studied through network modeling and other methods. In summary， the proposed pharmacological platform provided a feasible way for revealing the mechanism of CTBH by using modern scientific methods.endprint

[Key words] Concurrent treatment of the brain and heart； Danhong injection； network pharmacology； oxidative stress

“腦心同治”理論是基于中醫異病同治理念和中醫整體觀并結合臨床實踐發展而來[1]。中醫典籍記載，“心者，君主之寶”；“腦為元神之府”。臟腑陰陽失調，導致心之脈絡受損、氣血逆亂，出現痰熱壅阻、瘀血內阻等證候，臨床表現為胸痹、中風[2]。近代中醫學家結合醫學發展，總結前人經驗，提出心腦共主神明，為腦心同治奠定了基礎。盡管心腦血管疾病的病因病機較為復雜，但本虛標實是其共有特征，心腎陽氣虧虛為本，痰濁、瘀血阻滯為標，均可歸為氣虛血瘀證。以益氣活血、化瘀通絡之法可實現腦心同治[3]?，F代醫學研究表明，心、腦血管疾病主要是血管動脈粥樣硬化或血栓形成引發心、腦等器官缺血事件，動脈粥樣硬化是導致冠狀動脈、腦動脈以及外周動脈疾病的主要病理過程[4]。因此，臨床常采用控制血壓、調血脂、抗血小板聚集、抗血栓等多種類型藥物進行綜合防治。盡管心、腦血管疾病具有共同的病理學基礎，然而由于其涉及病理環節較為復雜，如何開展中藥腦心同治的藥理機制研究尚缺乏較完整的方法體系。

丹紅注射液是由丹參、紅花提取而成，具有活血化瘀、通脈舒絡等作用，用于瘀血閉阻所致的胸痹及中風，證見：胸痛，胸悶，心悸，口眼歪斜，言語蹇澀，肢體麻木，活動不利等癥；冠心病、心絞痛、心肌梗塞，瘀血型肺心病，缺血性腦病、腦血栓。臨床上，丹紅注射液對腦梗死、冠心病、心絞痛、心肌梗死的治療具有顯著效果[5-8]。藥理學研究表明，丹紅注射液具有抑制血小板聚集、抗炎癥損傷、保護血管內皮、抗細胞凋亡等多方面藥理作用[9]。

本文提出了中藥腦心同治藥理學研究平臺的框架，以丹紅注射液為例，運用該平臺獲得了丹紅注射液主要成分調控的生物分子網絡，從而發掘其治療心、腦血管疾病的共有靶點與作用途徑。根據網絡分析結果，在氧化損傷心肌細胞與神經細胞模型上驗證了丹紅注射液可提高氧化損傷心肌細胞與神經細胞的存活率，并以實驗證實丹紅注射液能調控網絡中關鍵節點GSK3β蛋白的表達與磷酸化水平。

1 中藥腦心同治藥理學研究平臺框架

中醫治病講究辨證論治，注重從整體把握病因、病機以及病癥的系統變化，以對機體功能狀態做出綜合判斷。腦心同治理論將心、腦血管疾病防治的基礎與臨床，綜合與分析，宏觀與微觀，實體本體與關系本體鏈接起來，突出臨床、重在實用，體現了腦心同治方藥多成分、多靶點調控機體生物分子網絡的作用特點。因此，中藥腦心同治藥理學研究平臺著重研究揭示中藥作用于心腦血管系統的過程與機制，包括了腦心同治網絡構建、藥效物質的篩選發現、藥效物質對機體的作用機制研究以及機體對藥效物質的處置過程，從而闡明腦心同治的科學原理，指導中藥臨床應用。據此，中藥腦心同治藥理學研究平臺包括腦心同治生物分子網絡建模、腦心同治藥效物質發現、腦心同治作用機制研究以及體內過程研究等4項關鍵技術，見圖1。

1.1 腦心同治生物分子網絡構建技術 網絡醫學研究可通過網絡建模與網絡分析等方法來系統認識疾病發生發展過程中機體生物分子網絡的變化規律[10]。網絡醫學的默認假設為網絡拓撲結構與節點連接度的變化與疾病進程有關。運用網絡醫學研究方法，可系統地發現疾病影響的關鍵生物分子模塊以及關鍵蛋白，從而為疾病預防、治療、預后以及藥物靶點發現提供了新的研究思路。

運用這一國際前沿研究手段，筆者采用網絡藥理學研究方法，通過數據庫搜索和文獻挖掘，獲得心腦血管疾病相關的基因、蛋白等生物分子信息，并依據蛋白質相互關系可構建出腦心同治相關生物分子網絡。通過對該網絡進行子簇分析與功能富集，找出與心腦血管疾病發生發展密切相關的網絡模塊與關鍵節點。運用于丹紅注射液作用機制研究時，獲取丹紅注射液中主要化學成分調控的關鍵蛋白，并進一步構建丹紅注射液成分-生物分子網絡模型。此外，依據網絡分析結果，實驗驗證丹參提取物、紅花提取物、丹紅注射液對氧化應激損傷的心肌細胞和神經細胞的保護效應。本文后續將詳細介紹腦心同治生物分子網絡建模與網絡分析的研究方法與結果。

1.2 中藥腦心同治藥效物質發現技術 研究發現腦心同治藥效物質，一方面可用現代語言解釋中藥防治心腦血管疾病的機制，另一方面也為詮釋腦心同治理論提供科學依據。由于心、腦血管疾病發生發展影響因素復雜，涉及細胞組織類型眾多，因此，需要采用多層次多途徑模型來篩選發現藥效物質。本研究前期采用模式生物、組織、細胞等多種藥理模型，辨識出丹紅注射液中丹參酚酸、紅花黃酮、有機酸等藥效物質[11]。運用轉基因斑馬魚血栓模型篩選發現迷迭香酸、對香豆酸等抗血栓活性成分[12]；在炎性刺激神經細胞模型與氧化損傷心肌細胞模型上發現丹參酚酸B等神經保護活性成分以及羥基紅花黃色素A等心肌保護活性成分[13]，從而為質控指標的合理選擇提供了科學依據。

1.3 腦心同治作用機制研究技術 天津中醫藥大學朱彥教授等針對心腦血管疾病發生發展中血管效應、血小板功能、氧化應激、炎癥反應、血管新生、細胞黏附等多個關鍵環節，揭示丹紅注射液依賴內皮COX/PGI2途徑舒張血管；上調缺血組織CXCR4基因表達促進血管新生，增加缺血區域毛細血管密度，恢復血流供應；抑制COX-2表達，減少PGE2合成及IL-6等炎癥因子分泌，減輕系統性炎癥反應[14]；多靶點調節G蛋白偶聯受體實現Ca2+動員和cAMP信號通路的協調抑制作用，抑制血栓形成；拮抗內質網應激損傷造成的神經元凋亡，抑制小膠質細胞激活發揮保護神經元等作用，從而整體性闡明了丹紅注射液腦心同治的分子機制與藥理作用特點[15-17]。

1.4 腦心同治方藥體內過程研究技術 中國科學院上海藥物研究所李川研究員課題組圍繞丹紅注射液中主要活性成分的體內過程開展系統研究，建立了腦心同治方藥體內過程研究技術，明確了丹紅注射液主要活性成分的體內暴露水平與清除機制，比較了小鼠、大鼠、犬等不同種屬的代謝差異，特別是在健康人體監測了丹紅注射液中主要活性成分的體內過程[18]，從而全面揭示丹紅注射液主要活性成分的體內分布、代謝與清除規律，為指導臨床合理用藥提供了依據。endprint

2 腦心同治生物分子網絡研究

2.1 數據來源及網絡建模方法 本研究所選擇的生物分子信息來源于數據庫與文獻，其中心血管疾病的相關基因來自CHD@ZJU V2.0[19]，并進行去重修改、基因名與基因ID校對。腦血管疾病的相關基因來自DisGeNET[20]，SIDD[21]，MALACards[22-23]，Diseases Database（http：//diseases.jensenlab.org/Search），Disease and Gene Annotations （DGA）[24]等數據庫，以“brain ischemia”，“brain infarction”，“stroke”等10個關鍵詞搜索后獲得。文獻來源的生物分子信息來源于PubMed數據庫，以“brain ischemia”等6個關鍵詞檢索出文獻，并經Pubtator[25]整理獲得相關基因，將數據庫與文獻信息整合為腦血管疾病相關基因。

將上述得到的心、腦血管疾病相關基因進行比對后得到共有基因列表，將其輸入到string V10.0[26]（http：//string-db.org/）中獲得相對應的蛋白以及整合后的蛋白-蛋白相互作用（PPI）關系，獲得共有基因間的相關關系，并采用Cytoscape v3.2.1[27]軟件構建網絡模型。為了進一步分析網絡中排名靠前的功能模塊，采用Cytoscape中的插件MCODE[28]獲得該網絡的子簇，并對每個子簇進行GO分析[29]（http：//geneontology.org/），選取P最小的第一級GO注釋以描述其涉及的生物功能。

2.2 心、腦血管疾病共有生物分子網絡模型 本研究得到心血管疾病相關基因有1 059個，腦血管疾病相關基因有989個。心、腦血管疾病共有相關基因492個。將該492個基因對應的蛋白以及PPI關系提取出來，篩選出combined score≥0.95的PPI對，共計1 382對。通過Cytoscape軟件建立生物分子網絡模型后進行子簇分析，得到12個子簇（cluster），將節點數大于3的子簇可視化，見圖2。這些子簇中生物分子所涉及的主要生物功能包括生殖發育、Cdc42蛋白信號轉導、細胞增殖、細胞氧化應激、環氧合酶途徑等，見表1，提示心、腦血管疾病發生發展進程與炎癥、氧化應激、凋亡、代謝等密切相關。進一步對子簇中的關鍵節點按聚類系數以及連接度排序，結果見表2。排名前10的基因包括GSK3B，NOTCH1，CDK4，IL6，E2F1，CDKN2A，PTEN，MAPK3，CDKN1B，RAC1等。其中網絡中連接度最高的節點為子簇4中的GSK3B基因，提示GSK3B相對應的蛋白在心腦血管疾病發生發展中具有重要作用。

3 丹紅注射液腦心同治生物分子網絡研究

3.1 丹紅注射液主要化學成分-生物分子網絡模型 依據已知丹紅注射液主要成分研究的結果[11， 30]，其主要有8種成分：丹參素（DSS）、丹酚酸A（SAA）、丹酚酸B（SAB）、迷迭 香酸（RA）、原兒茶醛（PA）、羥基紅花黃色素A（HSYA）、紫丁香苷（syringin）、p-香豆酸（PCA）。在GoPubMed[31]中對丹紅注射液主要化學成分相關聯的蛋白相互作用網絡映射到子簇上，建立丹紅注射液主要化學成分-生物分子網絡模型，分析丹紅注射液對各個子簇的影響。

在所獲得的12個子簇中，成分相關基因有30個，根據每個基因與成分的連接數對基因節點大小進行排序，見圖3。丹紅注射液成分與子簇1、3、4、6、7有關聯。其中，丹紅注射液成分與子簇1和子簇4關聯最多，與子簇1和子簇4關聯的節點數≥3的丹紅注射液成分有丹參素、丹參酚酸B、羥基紅花黃色素等。子簇1功能主要與生殖發育相關；子簇4主要與細胞氧化應激相關。在所有子簇節點中，GSK3B、NFKB1所連接的丹紅注射液成分最多。鑒于共有網絡子簇中，GSK3B與其他基因連接度最高，說明GSK3B在該網絡結構中占據重要位置，提示丹紅注射液可能作用于GSK3B調控細胞氧化應激相關通路。

3.2 丹紅注射液對H2O2損傷H9c2，PC12細胞的保護作用研究 根據網絡分析結果，在過氧化氫損傷的H9c2心肌細胞以及PC12神經細胞模型上驗證丹紅注射液的抗氧化應激活性。驗證實驗設置對照組（control）、模型組（300 mmol·L-1H2O2，損傷1.5 h）、丹紅注射液組（10 mL·L-1）、丹參提取物組（10 mL·L-1）以及紅花提取物組（10 mL·L-1）。模型組加入含300 mmol·L-1的H2O2的培養液，置于細胞培養箱中孵育1.5 h。給藥組在給藥24 h后，按照模型組的方法進行處理。對照組細胞繼續用含10% FBS的高糖DMEM或1640培養液，培養于細胞培養箱。采用MTT法測定細胞活力，Western blot法檢測氧化應激相關蛋白表達。

結果顯示，與模型組存活率降低至65.80%相比，10 mL·L-1的紅花提取物、丹參提取物以及丹紅注射液預保護24 h可使氧化損傷后的心肌細胞存活率提高至82.30%，96.61%，118.67%，見圖4a，表明丹紅注射液具有顯著的抗氧化損傷活性，且丹參提取物與紅花提取物存在協同效應。

與之類似，丹參提取物、丹紅注射液也能顯著提高氧化損傷的神經細胞存活率，見圖4b。上述結果表明，抗氧化應激是丹紅注射液腦心同治的機制之一。

采用Western blot方法檢測網絡中關鍵節點GSK3β的表達及磷酸化水平，結果見圖5。雙氧水損傷使H9c2心肌細胞p-GSK3β/G-SK3β明顯降低，而丹紅注射液能夠顯著提高p-GSK3β/G-SK3β水平，且其活性優于丹參提取物與紅花提取物。在氧化損傷的神經細胞模型上，也發現丹紅注射液在一定程度上能恢復p-GSK3β/G-SK3β水平。該驗證結果證實了網絡建模與網絡分析的結果，即丹紅注射液通過調控GSK3B相關生物分子，產生抗細胞氧化應激活性，從而實現腦心同治的藥理作用。endprint

4 討論

本研究提出了中藥腦心同治藥理學研究平臺的框架，構建了心、腦血管疾病共有相關生物分子網絡，并通過分析丹 紅注射液主要成分與子簇基因對應的蛋白之間的關聯，發現丹紅注射液可對網絡子簇1與子簇4的生物分子進行調控，且丹紅注射液中不同化學結構類型成分可調控多個網絡模塊中的生物分子，這表明了不同成分之間多靶點協同作用，出現多成分-多靶點作用的效應。

網絡分析發現，丹紅注射液主要對細胞增殖、細胞凋亡、發育、免疫、氧化應激、細胞遷移等方面進行調控。并推測出丹參素主要對細胞增殖、凋亡以及細胞遷移等進行影響，而丹酚酸B和迷迭香酸主要對細胞凋亡、發育、氧化應激等進行調控，羥基紅花黃色素A主要作用于氧化應激等生物過程。根據2張網絡的對比，推測GSK3β可能是在疾病發生發展過程以及丹紅注射液治療中比較關鍵的蛋白之一，并對此進行了初步的實驗驗證，與目前的文獻報道基本相符合[32-35]。GSK3β促進胚胎干細胞分化成心肌細胞，并可維持心肌細胞的增殖調節，失去對GSK3β的控制可導致機體死亡[35]。持續抑制GSK3β引起心肌代償性肥大，抑制凋亡和纖維化，并增加心肌收縮力[34]。同時，GSK3β參與代謝紊亂和腦缺血損傷的調節[32]。D′Angelo等報道，磷酸化的GSK3β與腦缺氧缺血的神經保護密切相關[33]。Kim等[34]曾報道，雙氧水對H9c2心肌細胞損傷后，減少了GSK3β的磷酸化。Nair等[36]也曾報道，雙氧水誘導的氧化應激損傷會引起GSK3β的去磷酸化。在氧化應激損傷下，對GSK3β磷酸化進行恢復，可能在“腦心同治”中具有重要意義。

除了丹紅注射液，腦心通、復方丹參滴丸等中成藥也常被用于治療心腦血管疾病。本文所提出的“腦心同治”藥理學研究平臺，可用于這類腦心同治方藥作用研究，通過網絡模塊分析，找出不同類型化學成分的作用靶點和主要調控的信號通路以及功能模塊，為進一步深入探討藥理作用機制、明確此類中成藥的臨床定位提供科學依據。

陳迪等[37-38]曾報道基于數據科學的“腦心同治”分子機制研究，采用網絡構建和有效化合物信息收集，對比2個疾病相關網絡的不同結果進行分析。本文采用了數據挖掘、網絡分析與實驗驗證相結合的方法，在2種不同細胞系上驗證了丹紅注射液對氧化損傷心肌細胞與神經細胞的保護作用。其中，丹紅注射液抗氧化損傷機制與GSK3β蛋白磷酸化的關系為首次發現。本文通過網絡分析得到GSK3β在丹紅注射液治療心、腦血管疾病中可能起到關鍵作用，為丹紅注射液“腦心同治”作用機制的研究提供科學依據。

氧化應激反映了機體活性氧的產生與抗氧化能力的失衡?；钚匝醢ǔ蹶庪x子自由基（O2-）、羥基（-OH）、過氧化氫（H2O2）[39]。已有研究表明，氧化應激可導致血管內皮功能障礙，與心、腦血管疾病均密切相關[40-41]。GSK3家族最初被鑒定為糖原合酶的負調節劑，而糖原合酶是糖原合成中的限速酶[42]。實驗表明，丹紅注射液對GSK3β蛋白磷酸化具有一定影響，可能通過恢復GSK3β的磷酸化以保護心肌細胞與神經細胞在H2O2刺激下的損傷。上述研究表明，丹紅注射液可通過抑制GSK3β介導的氧化應激損傷產生心肌細胞與神經細胞保護作用，這對于解釋丹紅注射液腦心同治的分子機制提供了科學證據。

中藥腦心同治藥理學研究平臺的建立，不僅對于明確腦心同治方藥的臨床作用特點、指導臨床定位和合理用藥具有重要意義，同時也為確定質控指標、設計優質中藥產品制造工藝提供了科學依據。

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[責任編輯 馬超一]endprint