泉州地區2014—2017年活禽相關外環境禽流感病毒監測及遺傳進化特征

鄭友限 劉建忠 李鋒平 陳志揚 陳明春 吳小鳳

362000泉州市疾病預防控制中心

2013年以來我國多地相繼發現人感染H7N9禽流感病毒(avian influenza,AIV)病例,已經造成多人死亡[1]。2014年1月以來泉州地區相繼出現了12例病例,死亡2例[2-3]。AIV屬于甲型流感病毒,主要感染禽和鳥類,至今發現能直接感染人類的主要有 H5、H7和 H9等亞型。目前,我國人感染H7N9禽流感呈現高度散發,人感染禽流感主要是由于接觸感染病毒的禽鳥及其分泌物和排泄物。2016年10月,廣東、湖南等地又發現對禽高致病性病毒毒株[4]。為了解泉州地區外環境禽流感病毒的動態分布狀況,本研究自2014年開始,對本地區活禽養殖場、活禽交易和宰殺市場、農貿交易市場以及野生禽鳥棲息地等外環境標本進行監測,全面了解外環境中H5、H7和H9等亞型禽流感病毒分布情況,并從分子水平分析其基因特征和遺傳變異特點。

1 材料與方法

1.1 研究對象2014—2017年泉州地區的12個縣(市、區),于每月定期開展一次監測,采用隨機抽樣的方法選擇活禽批發市場、家禽屠宰加工點、家禽規模養殖場(戶)以及野生禽鳥棲息地等場所作為外環境監測點。采集禽類飲水、糞便、籠具表面拭子、清洗禽類污水、宰殺或擺放禽肉案板表面拭子以及野生禽鳥棲息地的糞便等標本共1 289份。在發生人禽流感疫情期間,則在疫點開展應急監測,相應擴大監測點,增加標本采樣量。

1.2 病毒核酸提取標本采集完成后,4℃保存送至泉州市疾病預防控制中心實驗室,采用江蘇碩世生物科技有限公司的病毒核酸提取試劑盒(磁珠法),用全自動核酸提取儀SSNP-2000 A對采集的標本進行病毒RNA提取,具體操作參照試劑盒和儀器使用說明書。

1.3 實時熒光定量逆轉錄PCR(Real-Time RTPCR)檢測甲型流感病毒及H5、H9和H7N9的檢測均采用深圳生科原生物技術有限公司的相應產品進行,具體操作參照產品說明書。檢測儀器為LightCycler 480 II實時熒光定量PCR儀。

1.4 H7N9禽流感病毒序列測定與同源性分析

選擇Real-Time RT-PCR檢測為H7N9陽性的樣本,利用Promega公司的逆轉錄試劑盒以及流感病毒通用引物uni12(agcaaaagcagg)進行逆轉錄合成cDNA。利用本實驗室設計的片段特異性引物和TaKaRa公司的Pyrobest DNA Polymerase進行擴增。擴增產物用QIAquick Gel Extraction Kit膠回收試劑盒回收后送上海生工公司測序。測序產物的拼接采用DNAstar Lasergene7.1軟件,先用MEGA7.0軟件的Clustal W法進行序列比對,再采用Neighbor-Joining法分別構建HA和NA基因的進化樹。本研究中其他人源、禽源H7N9禽流感病毒基因參考序列均來源于GeneBank和GISAID。

1.5 統計學方法采用SPSS16.0軟件進行數據分析,率的比較采用卡方檢驗,P值小于0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 2014—2017年外環境標本監測情況2014—2017年共采集1 289份外環境標本,檢出377份甲型流感病毒核酸陽性(377/1 289),其中172份H7N9核酸陽性,49份H5核酸陽性,155份H9核酸陽性,1份未能分型。各年度H7N9亞型陽性率差別較大,其中最高的為2017年的21.88%,其次為2015年的18.45%,2014年和2016年則相對較低,分別為7.56%和7.28%,見表1。

2.2 不同場所不同類型標本H7N9禽流感病毒監測情況來自4種不同涉禽監測場所標本中,活禽交易和宰殺市場H7N9禽流感病毒陽性標本數最多(141份),陽性率最高(16.95%),其次為農貿市場,陽性標本17份,陽性率為16.50%,而禽類養殖場所則相對較少(陽性標本14份,陽性率為4.40%),野生候鳥棲息地則未檢出H7N9亞型禽流感病毒。在任何監測場所,清洗禽類污水標本,陽性率最高為19.12%(52/272),其次為籠具表面擦拭標本H7N9禽流感病毒陽性率為14.58%(42/288),宰殺或擺放禽肉案板表面的擦拭標本以及糞便標本的 H7N9禽流感病毒陽性率,分別為12.10%(34/281)和10.16%(39/384),禽類飲水的H7N9禽流感病毒陽性率則相對較低,為7.69%(5/65),見表 2。

表1 2014—2017年泉州地區外環境標本禽流感病毒檢測結果Tab.1 Detection results of H7N9 avian influenza virus in environment samples in Quanzhou during 2014-2017

表2 不同場所不同類型標本H7N9禽流感病毒檢測情況比較Tab.2 Comparison of detection of H7N9 avian influenza virus in different places and different types of samples

2.3 H7N9禽流感病毒基因同源性與病毒毒力分析通過PCR擴增和測序分析,本研究獲得了福建省泉州地區4株H7N9病毒的HA和NA基因全長,分別來自外環境標本QZ1613、QZ1708和人感染H7N9禽流感病毒患者標本QZ10、QZ11。進化分析結果顯示,2株人源H7N9病毒的HA和NA基因都屬于長江三角洲譜系,而2株環境樣本來源的H7N9病毒的HA和NA基因都屬于珠江三角洲譜系,見圖1。對該4株H7N9病毒的HA、NA和PB2蛋白的關鍵位點的分析結果顯示,這4株病毒HA蛋白的裂解位點均為PKGR/G,沒有發生高致病性突變,屬于低致病性H7N9禽流感病毒；NA蛋白292位(N2編號)氨基酸都為R,沒有出現奧司他韋耐藥突變；PB2蛋白中,627位氨基酸從E突變為了K,526位和701位氨基酸沒有出現突變。

3 討論

本研究對福建省泉州地區2014—2017年活禽相關外環境禽流感毒監測情況及遺傳進化特性進行了分析比較。結果顯示泉州地區活禽相關外環境中禽流感病毒污染較為嚴重,尤其是H7N9禽流感病毒,陽性率為 13.34%,其中以 2017年為最高(21.88%),污染率高的場所主要為家禽宰殺加工場所、活禽交易市場,而野生候鳥棲息地未檢出H7N9,表明泉州地區活禽相關外環境是人感染H7N9病毒的高危場所,應加強監測。外環境標本檢出率由高到低依次為清洗禽類的污水、籠具表面擦拭標本、宰殺或擺放禽肉的擦拭標本、糞便標本、禽類飲用水,清洗禽類的污水和宰殺或擺放禽肉的案板表面的H7N9禽流感病毒檢出率相對較高,而糞便標本和禽類飲水的檢出率則相對較低,表明在禽類銷售、宰殺等環節中極易造成環境污染,尤其是宰殺環節中所用的水和案板等更容易被禽流感病毒污染,主要原因可能與不同類型標本受禽類交叉污染的嚴重程度不同有關[5]。對其中4株病毒的HA和NA基因序列進化分析,結果顯示2株人源和2株環境樣本來源H7N9病毒的HA和NA基因分別屬于長江三角洲譜系和珠江三角洲譜系。盡管這4株病毒都是第5次疫情期間分離,但是在遺傳進化上差別較大,提示這2個病例感染的病毒跟這兩個環境樣本中的病毒并沒有直接聯系。同時,這4株H7N9病毒毒株對禽類來說都是低致病性,NA蛋白都沒有出現耐藥突變,仍對奧司他韋敏感,但PB2蛋白都出現了與毒力相關的E627 K突變。

注：紅色三角代表本研究的4株病毒序列圖1 泉州市4株H7N9病毒HA(A)和NA(B)核酸序列遺傳進化分析Note：The red triangle represents the 4 virus sequences in the articleFig.1 A,Phylogenetic analysis of HA(A)and NA(B)gene

本地的活禽批發交易和屠宰市場的直接暴露可能是導致H7N9禽流感病毒感染的高危因素。因此接觸活禽或長期暴露在活禽相關外環境下均有可能導致人感染H7N9禽流感[6],建議相關部門在疫情暴發期間,加強源頭防控,規范活禽市場管理其得病后風險極大應推行“三個一”制度,做好活禽經營市場交易場所、設施和運輸工具的全面消毒清潔,以及個人防護等工作才是控制禽流感的長效措施[7]。每年9月到次年4月是人感染H7N9禽流感的高發期,應在秋季全面推進家禽H7N9疫苗免疫,進一步降低H7N9禽流感傳播的風險,保障人群的安全。同時積極開展外環境禽流感病毒監測,掌握外環境中H7N9禽流感病毒的分布和變異情況,為預測預警流感流行趨勢,及時采取預防控制措施提供科學依據。

利益沖突無