長鏈非編碼RNA AFAP1—AS1的過表達對胃癌細胞增殖和遷移的影響

李周驍 唐薇薇 丁志麗

[摘要]目的 探討長鏈非編碼RNA AFAP1-AS1的過表達對胃癌細胞增殖和遷移的影響。方法 采用定量逆轉錄聚合酶鏈式反應（qRT-PCR）檢測52例胃癌及癌旁標本（2015年5月～2017年1月在南京醫科大學附屬南京第一醫院收集）和6例胃癌細胞株中lncRNA AFAP1-AS1的表達水平。小干擾RNA（siRNA）用于抑制胃癌細胞系中的AFAP1-AS1表達。結果 胃癌組織中的AFAP1-AS1水平顯著高于相應的癌旁組織，差異有統計學意義（P<0.01）。胃癌細胞系AGS、SGC7901、MGC803和BGC8231的表達量顯著高于正常胃黏膜細胞系GES-1，差異有統計學意義（P<0.05或P<0.01）。AFAP1-AS1的表達水平與胃癌患者臨床分期（χ2=7.137，P=0.008）和淋巴結轉移（χ2=6.656，P=0.010）有關。CCK8和克隆集落形成實驗顯示，用siRNA敲降AFAP1-AS1的表達后，胃癌細胞系BGC823和MGC803的增殖速率顯著降低，差異有統計學意義（P<0.01或P<0.001）。細胞劃痕實驗顯示，用siRNA敲降AFAP1-AS1的表達后，胃癌細胞系BGC823和MGC803的增殖速率顯著降低，差異有統計學意義（P<0.05）。結論 AFAP1-AS1是一種參與胃癌進展的新型生物標志物，可能為治療性干預提供潛在的預后生物標志物和潛在靶點。

[關鍵詞]長鏈非編碼RNA AFAP1-AS1；胃癌；腫瘤發生；增殖；遷移

[中圖分類號] R735.2 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2019）5（a）-0004-05

Influence of overexpression of LncRNA AFAP1-AS1 on proliferation and migration of gastric cancer cells

LI Zhou-xiao1 TANG Wei-wei1 DING Zhi-li2 DONG Chao-xi1 RONG Da-wei1 CAO Hong-yong1▲

1. Department of General Surgery， Nanjing Hospital Affiliated to Nanjing Medical University （Nanjing First Hospital）， Jiangsu Province， Nanjing 210001， China； 2. Department of Pediatric ICU， Children′s Hospital of Changzhou City in Jiangsu Province， Changzhou 213003， China

[Abstract] Objective To explore the influence of overexpression of LncRNA AFAP1-AS1 on proliferation and migration of gastric cancer cells. Methods The expression levels of lncRNA AFAP1-AS1 in 52 cases of gastric cancer and paracancerous tissues which were collected from May 2015 to January 2017 and 6 gastric cancer cell lines were evaluated by quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction （qRT-PCR）. Small interfering RNA （siRNA） was used to suppress AFAP1-AS1 expression in gastric cancer cell lines. Results The level of AFAP1-AS1 in gastric cancer tissues was significantly higher than that in adjacent adjacent tissues， with significant difference （P<0.01）. The expression levels of AGS， SGC7901， MGC803 and BGC8231 in gastric cancer cell lines were significantly higher than those of normal gastric mucosal cell line GES-1， the difference was statistically significant （P<0.05 or P<0.01）. The expression level of AFAP1-AS1 was related to clinical stage （χ2=7.137， P=0.008） and lymph node metastasis （χ2=6.656 P=0.010）. CCK8 and colony colony formation experiments confirmed that the proliferation rate of gastric cancer cell lines BGC823 and MGC803 significantly decreased after knockdown of AFAP1-AS1 expression which induced by siRNA， the differences were statistically significant （P<0.01 or P<0.001）. Cell scratch assay confirmed that the proliferation rate of gastric cancer cell lines BGC823 and MGC803 significantly decreased after siRNA knockdown of AFAP1-AS1 expression， the difference was statistically significant （P<0.05）. Conclusion AFAP1-AS1 is a novel biomarker involved in gastric cancer progression， which may provide a potential prognostic biomarker and a prospective target for therapeutic intervention.

[Key words] lncRNA AFAP1-AS1； Gastric cancer； Tumorigenesis； Proliferation； Migration

胃癌是一種涉及多基因組改變的遺傳性疾病，在發展中國家一直是嚴重影響人們身心健康乃至危及生命的主要疾病之一，并且近年來其發病率不斷增加[1-2]。盡管目前胃癌的診斷和治療技術不斷發展，然而大多數患者仍然在晚期才得到確診，因此預后較差[3-5]。目前，改進胃癌的早期診斷和靶向治療是降低其死亡率的主要策略。

在過去的幾十年中，大量研究聚焦于蛋白質編碼RNA在癌癥中的異常表達，這為癌癥診斷和治療提供了一種有前景的手段。然而，隨著近年來高分辨率微陣列和全基因組測序技術的進步，越來越多從基因組學和轉錄組學研究中得到的證據顯示，長鏈非編碼RNA（lncRNA）可以作為癌癥檢測的新型生物標志物和癌癥治療的分子靶標[6-9]。其中，lncRNA肌動蛋白絲相關蛋白1反義RNA 1（AFAP1-AS1）被發現在卵巢癌、膽囊癌、食管鱗狀細胞癌、胰腺導管腺癌、結直腸癌等腫瘤中異常高表達[10-14]，然而AFAP1-AS1是否參與了胃癌的發生和發展，目前仍不明了。本研究旨在探討AFAP1-AS1在胃癌中的臨床意義和生物學功能。

1資料與方法

1.1臨床資料與手術標本

選取2015年5月～2017年1月于南京醫科大學附屬南京第一醫院接受手術的52例胃癌患者的胃癌組織及相應癌旁組織標本。所有患者手術前均未接受放療或化療，標本離體后立即儲存在-80℃冰箱中。本研究經南京醫科大學附屬南京醫院醫學倫理委員會批準，所有患者在參與研究前均簽署書面知情同意書。

1.2 RNA提取和逆轉錄以及qRT-PCR

用Trizol試劑（Invitrogen）從癌組織及對應癌旁組織中提取總RNA，操作按照說明書進行；測量總RNA濃度，用Prime-ScriptTM qRT-PCR試劑盒（Takara，中國）逆轉錄cDNA。然后以該cDNA為模板，PCR儀中擴增提取的RNA進行反轉錄，采用SYBR Green染料法行實時熒光定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）。使用三步法進行qRT-PCR，反應條件為：使用95℃反應10 min預變性，繼續10 s變性，57℃ 20 s退火，72℃ 15 s延伸。每個待測樣本設置3個平行樣。通過以下引物序列的qRT-PCR檢測AFAP1-AS1表達量：5′-TCGCTCAATGGAGTGACGGCA-3′（正向）；5′-CGGCTGAGACCGCTGAGAACTT-3′（反向）。結果用GAPDH作為內參物，正向5′-GTCAACGGATTTGGTCTGTATT-3′和反向5′-AGTCTTCTGGGTGGCAGTGAT-3′。用ABI7500系統和SYBR Green PCR Master Mix進行qRT-PCR反應。采用2-△△CT法分析AFAP1-AS1在胃癌組織及相應的癌旁組織，分析靶基因的倍數變化。

1.3細胞培養

人胃癌細胞系MKN-28、MKN-45、BGC-823、SGC-7901、MGC-803和AGS購自上海細胞生物學研究所（上海）。使用RPMI-1640培養基加10%胎牛血清和青霉素（100 U/ml）、鏈霉素（100 U/ml）混合培養基培養細胞。培養條件：37℃恒溫培養箱，5% CO2。

1.4 SiRNA的制備和轉染

將細胞接種過夜，并使用Li-pofectamine Reagent（Invitrogen）在Opti-MEM培養基（Invitrogen）中用10 nM siRNA和無siRNA的空白對照（Invitrogen）轉染。AFAP1-AS1靶向siRNA的序列如下（表1）。細胞生長后10～12 h進行轉染實驗。初始檢測可以設置為多個濃度梯度來檢測不同濃度的干擾效率。以10 nmol（1.2 μl）干擾濃度為例，每管加入100 μl Opti-MEM，加入1.2 μl陰性對照/干擾試劑，最后加入12 μl Hiperfect，其中本實驗干擾效率終濃度為10 nmol。48 h后，收集細胞并使用qRT-PCR檢測干擾效率。

1.5細胞增殖實驗

根據說明，使用細胞計數試劑盒-8（CCK8，Promega）測定法測定細胞增殖。將轉染的細胞接種在96孔板（3000個細胞/孔），每24小時監測1次。每孔中加入10 μl CCK8，在37℃細胞培養箱中孵育2 h，然后通過分光光度法在490 nm光度測量溶液，計算細胞活力。

1.6克隆集落形成實驗

用si-AFAP1-AS1抑制劑轉染細胞，在每個6孔板上用含有10%胎牛血清的培養基接種1×103個細胞，并于37℃、5% CO2條件下在細胞孵箱保存。轉染的細胞置于6孔板中并保存14 d，每3天更換1次培養基。然后用1 ml PBS洗滌細胞，用4%多聚甲醛固定15 min，用0.1%結晶紫染色20 min，最后用1 ml水洗滌3次。手動計數菌落數，并通過雙尾t檢驗評估差異，每個細胞系重復3次。

1.7劃痕實驗

在用si-AFAP1-AS1或si-NC轉染48 h后，使用200 μl無菌移液器尖端在貼壁細胞中劃痕。然后用PBS洗滌細胞3次以除去任何游離的細胞和碎片。加入不含血清的培養基，并在37℃、5%CO2條件下培養細胞。分別于轉染后0、12 h后觀察劃痕愈合情況并用數字顯微鏡拍照。實驗重復3次。

1.8統計學方法

采用SPSS 23.0統計軟件對數據進行分析，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，采用t檢驗，計數資料以率（%）表示，采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1 LncRNA AFAP1-AS1在胃癌組織中的表達

在AFAP1-AS1逆轉錄為cDNA完成后，使用qRT-PCR檢測52例胃癌組織中AFAP1-AS1的表達水平。結果顯示，胃癌組織中lncRNA AFAP1-AS1的表達水平明顯高于相應的癌旁組織，其在胃癌組織中的表達量約為癌旁組織中的2.8倍，差異有統計學意義（n=52，P<0.01）（圖1）。

2.2 LncRNA AFAP1-AS1的表達與患者臨床病理特征的關系

在兩組患者中，以LncRNA AFAP1-AS1在胃癌細胞中的表達水平與正常胃黏膜細胞的對比將其分為高表達組及低表達組。單因素分析LncRNA AFAP1-AS1的表達與患者臨床病理特征的關系，結果顯示，腫瘤組中LncRNA AFAP1-AS1的表達與患者的TNM分期（χ2=7.137，P=0.008）和淋巴結轉移（χ2=6.656，P=0.010）有關，與性別、年齡、腫瘤大小、腫瘤部位和胃癌患者的腫瘤分化程度無關（P>0.05）（表2）。

2.3 LncRNA AFAP1-AS1在胃癌細胞系中的表達

胃癌細胞系AGS、SGC7901、MGC803和BGC823中AFAP1-AS1的表達顯著高于正常細胞系GES-1（P<0.05），其中MGC803和BGC823的表達量最高，其相對表達量分別約為正常胃黏膜細胞GES-1的5.3倍與3.4倍。然而，在胃癌細胞系MKN28和MKN45中，AFAP1-AS1的表達與正常胃癌細胞比較，差異無統計學意義（P>0.05）（圖2）。

2.4 AFAP1-AS1促進胃癌細胞系MGC-803和BGC823的增殖

筆者設計了兩條干擾序列si-AFAP1-AS1-1和si-AFAP1-AS1-2抑制AFAP1-AS1的表達并在體外實驗中測試其生物學功能。選擇AFAP1-AS1表達最高的胃癌細胞系MGC803和BGC823以確定轉染效率，分別用陰性對照（NC）、si-1和si-2轉染MGC803和BGC823，36 h后，MGC803和BGC823中AFAP1-AS1的表達量顯著下降，qRT-PCR顯示si-1和si-2在胃癌細胞系MGC803和BGC823中對AFAP1-AS1的抑制效率良好（P<0.01）（圖3A）。CCK8實驗結果顯示敲降AFAP1-AS1顯著抑制了胃癌細胞MGC803和BGC823的增殖（P<0.001）（圖3B、圖3C）。此外，克隆集落實驗的結果也顯示敲降AFAP1-AS1抑制了胃癌細胞的增殖（P<0.01）（圖3D、圖3E）。

2.5 AFAP1-AS1對胃癌細胞株MGC-803和BGC823遷移能力的影響

在胃癌細胞系MGC-803和BGC823中，在細胞干擾后0、12 h通過細胞劃痕拍攝細胞。如圖4所示，與陰性對照組相比，敲降AFAP1-AS1表達后，胃癌細胞系MGC-803和BGC823的遷移能力受到顯著抑制（P<0.05）。

3討論

胃癌是人類最常見的惡性腫瘤之一，對人體健康構成嚴重威脅。lncRNA是一類長度超過200個堿基對的核苷酸序列[15]。越來越多的證據顯示，lncRNA廣泛參與生物體各類重要生理過程，在轉錄、轉錄后表觀遺傳水平上對靶基因的表達進行調控，也參與調控細胞周期及腫瘤轉移發生[16]。研究顯示lncRNAs與腫瘤的發生、發展密切相關，近年來已成為臨床醫學研究的熱點之一。

以往研究發現，lncRNA AFAP1-AS1的上調與非小細胞肺癌患者的不良預后相關[17]。另有文獻報道，其表達上調與鼻咽癌的進展和預后不良有關[18]。然而，目前其在胃癌發生、發展中的生物學作用仍不清楚。本研究證實了AFAP1-AS1在胃癌中的表達，并評估了其與臨床因素的相關性，通過siRNA介導的敲降探索了AFAP1-AS1的潛在功能。

本研究結果顯示，AFAP1-AS1在患者胃癌組織中的表達量顯著增高（P<0.05），這與其他報道一致[19]。此外，AFAP1-AS1與臨床病理特征的關聯性揭示了AFAP1-AS1的過表達與胃癌患者的性別、年齡、腫瘤大小、腫瘤部位或分化程度無關（P>0.05），與臨床分期和淋巴結轉移有關（P<0.05），AFAP1-AS1表達量較高的胃癌患者更易發生淋巴結轉移。眾所周知，具有淋巴結轉移的胃癌比無淋巴結轉移的胃癌預后更差[20]，TNM分期也是預后經典評估標準，Ⅲ期和Ⅳ期患者的預后較TNM Ⅰ期和Ⅱ期更差[21]?？傊?，AFAP1-AS1可作為評估胃癌風險的潛在生物標志物，并且可以作為胃癌預后的生物標志物。

為了進一步了解AFAP1-AS1在胃癌細胞中的生物學功能，本研究進行了體外實驗。在細胞實驗中，與胃正常細胞系GES-1相比，胃癌細胞系MGC-803和BGC823的AFAP1-AS1表達量最高，因此選擇BGC823和MGC-803進行進一步研究，結果顯示，敲降AFAP1-AS1的表達后，MGC-803和BGC823細胞系的增殖速率受到顯著抑制。此外，本研究進行了劃痕實驗來證實AFAP1-AS1對胃癌細胞遷移能力的影響。實驗結果顯示，敲降AFAP1-AS1的表達后，胃癌細胞系MGC-803和BGC823的遷移能力受到顯著抑制（P<0.05）。

需要重視的是，這項研究仍存在一些不足之處。AFAP1-AS1可能促進胃癌的增殖和遷移的結論是基于人胃癌組織和胃癌細胞系的體外實驗和臨床樣本數據分析得出，還需要進行動物實驗深入驗證實驗結果，進一步進行基于基因敲除小鼠的實驗也可以提升實驗的可信度。此外，本研究尚未涉及特定的分子機制，在未來的研究中需要闡明AFAP1-AS1促進胃癌增殖的具體機制。

綜上所述，AFAP1-AS1在胃癌中高表達，提示AFAP1-AS1是一種胃癌特異性lncRNA。其可能在胃癌的發生、發展中起重要作用，敲降lncRNA AFAP1-AS1抑制MGC細胞中的細胞增殖和遷移。研究結果顯示，lncRNA可能在胃癌中發揮作用，有望成為胃癌診斷和治療靶點的新靶標。

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（收稿日期：2018-08-21 本文編輯：祁海文）