利用特異性抗體建立金黃色葡萄球菌腸毒素B快速檢測方法

周劉忠，胡乃靜，張丁木，王志宏，吳佳果，羅龍龍，石艷春

1.內蒙古醫科大學，內蒙古自治區分子生物學重點實驗室，內蒙古 呼和浩特 010058；

2.軍事醫學研究院 毒物藥物研究所，重大疫情應急防控藥物研究室，北京 100850

金黃色葡萄球菌（金葡菌）已經與人類共同生存了一萬多年[1]，是一種進化得非常成功的革蘭陽性病原體，在自然界中廣泛存在[2]。人體感染金葡菌主要有2種途徑，即食源性感染與院內感染。近年來有證據顯示，在新鮮食物和即食食品中，金葡菌是主要的食源性病原體之一，并且在世界各國均報道過中毒案例[3]。美國每年約有20萬金葡菌感染病例[4]；在中國的食物中毒事件中，微生物中毒占53.7%，其中多數為金葡菌感染所致。金葡菌對食品的污染非常廣泛，例如雞、魚、乳制品、肉類、壽司和生魚片等[5-10]，極大地威脅消費者的健康。在金葡菌所致的食物中毒中，90%以上與金黃色葡萄球菌腸毒素（staphylococcal enterotoxin，SE）有關。據報道，金葡菌能夠產生23種血清型的腸毒素[11]，SEA～SEE被認為是引起中毒的主要毒素，其中SEB的毒性大且穩定性強，被認為是最強效的毒素之一[12]。

SEB為一條單鏈多肽，相對分子質量約28.5×103，包含2個結構域。結構域1在N端1～120位殘基，包括2個β片層和3個α螺旋；結構域2位于C端127～239殘基，含2個α螺旋、2個短β折疊和2個β片層[13]。SEB是一種超抗原，其主要作用方式是通過橋聯抗原遞呈細胞表面的主要組織相容性復合體（major histocompatibility complex，MHC）Ⅱ類分子與T細胞受體（T cell receptor，TCR）β鏈V區，形成MHCⅡ-SEB-TCR復合物，直接刺激T細胞活化與增殖，釋放細胞因子，最終導致細胞死亡[14]。SEB中毒后會引起一系列中毒反應甚至產生中毒性休克綜合征，臨床表現為高熱、低血壓、紅疹、體重減輕、多器官功能衰竭甚至死亡，病死率可達50%[15]。人體接觸SEB后潛伏期僅4～6 h[16]。SEB熱穩定性強，100℃煮沸30 min仍然不能使其失活[12]，且毒素致死劑量低，據估計，SEB在人體半數致死劑量可能為0.02 μg/kg。因此，開發有效檢測SEB的方法對臨床診斷具有重要意義。

我們以3株具有自主知識產權的高親和力抗SEB抗體LXY8、LXY9、LXY10為研究對象，探索不同抗體的配對組合在SEB檢測中的潛在應用。首先，利用大腸桿菌原核表達系統制備SEB抗原，并借助哺乳動物細胞表達系統制備3株抗SEB抗體；然后，擬優化建立一種特異、靈敏的定量檢測SEB的雙夾心ELISA方法，通過抗體配伍試驗獲得檢測靈敏度最低的配對抗體；最后，基于最佳配對的抗體開發膠體金檢測試紙條，用于體外SEB的快速檢測。

1 材料與方法

1.1 材料

SEB抗原和抗體LXY8、LXY9和LXY10由本實驗室制備并保存；羊抗人IgG-HRP購自北京索萊寶科技有限公司；辣根過氧化物酶標記的鏈霉素（Streptavidin-HRP）購自安捷倫科技有限公司；TMB顯色液購自Invitrogen公司；包被液（0.1 mol/L碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液，pH9.6）、PBS購自Gibco公司；蛋白互作運行緩沖液或ELISA洗滌液PBST溶液（0.1%吐溫20溶于PBS）和1.5%酪蛋白封閉液購自Sigma公司。

1.2 生物膜干涉法測定抗體親和力

將聯機電腦和Fortebio儀器打開，待指示燈停止閃爍，溫度穩定后，打開軟件連接系統。將3株抗體分別固定到Anti-Human IgG Fc Capture（AHC）芯片上，SEB用運行緩沖溶液梯度稀釋為64.8、32.4、16.2、8.1、4.05、2.03、1.01 nmol/L，設置結合時間為300 s，解離時間為600 s。測試完成后將芯片用10 mmol/L甘氨酸-鹽酸（pH1.7）溶液脈沖5 s，運行緩沖液再生5 s，重復3次。將原始數據導入分析軟件進行動力學方法分析，計算結合解離常數并繪制動力學曲線。

1.3 間接ELSIA法測定抗體結合活性

用包被液稀釋SEB抗原至1 μg/mL，將SEB抗原加入聚丙烯酰胺酶聯板中（100 μL/孔），4℃包被過夜，用洗板機洗板3次；按200 μL/孔添加1.5%酪蛋白封閉液于酶聯板中，37℃封閉1 h，用洗板機洗板3次；用PBS緩沖液將生物素化抗體（LXY8-Biotin、LXY9-Biotin、LXY10-Biotin）起始濃度稀釋至5 μg/mL，并按1/3梯度稀釋至12個濃度，按100 μL/孔將不同濃度的生物素標記抗體加入酶聯板中，設置上下孔為復孔，37℃孵育1 h；用洗板機洗板3次，按1∶4000稀釋Streptavidin-HRP，100 μL/孔加入酶聯板，室溫放置 45 min；用洗板機洗板3次，每孔加入100 μL TMB顯色液，室溫避光放置2 min；每孔加入100 μL 1 mol/L的H2SO4終止液終止反應；用酶標儀測定D450nm值。應用Graphpad Prism 5軟件分析數據，以生物素化抗體濃度為橫坐標、D450nm值為縱坐標繪制四參數方程擬合曲線，方程為y=（A-D）/［1+（x/C）^B］+D，其中B為斜率，C為EC50。

1.4 競爭ELISA法鑒定抗體表位交叉情況

用包被液稀釋SEB抗原至1 μg/mL，按100 μL/孔將SEB抗原加入聚丙烯酰胺酶聯板中并于4℃包被過夜，然后將酶聯板用洗滌液洗滌3次；按200 μL/孔添加1.5%酪蛋白封閉液于酶聯板中，37℃封閉1 h，然后將酶聯板板用洗滌液洗滌3次；用PBS緩沖液分別稀釋3種生物素標記抗體至0.25 μg/mL，以上述固定濃度的生物素化抗體溶液為稀釋液，稀釋未標記生物素的裸抗體LXY8、LXY9和LXY10至 5 μg/mL，并進行 1/2梯度稀釋12個濃度，而生物素標記的抗體為固定濃度即0.25 μg/mL，將上述稀釋產物加入對應的酶聯板中并做好標記，設置上下孔為復孔，于37℃放置1 h；用洗板機洗板3次，按1∶4000稀釋Streptavidin-HRP，按 100 μL/孔加入酶聯板，室溫放置45 min；用洗板機洗板3次，每孔加入100 μL TMB顯色液，室溫避光放置2 min；每孔加入100 μL 1 mol/L 的 H2SO4終止液終止反應；酶標儀測定D450nm值。應用Graphpad Prism5軟件分析數據，以未標記的裸抗體濃度為橫坐標、D450nm值為縱坐標繪制四參數方程擬合曲線，方程為y=（A-D）/［1+（x/C）^B］+D，其中B為斜率，C為EC50。

1.5 雙夾心ELISA法檢測SEB抗原

用包被液稀釋抗體LXY8、LXY9或LXY10至2 μg/mL，按 100 μL/孔加入酶聯板中并于 4℃包被過夜，然后將酶聯板用洗滌液洗滌3次；按200 μL/孔添加1.5%酪蛋白封閉液于酶聯板中，37℃封閉 1 h，然后將酶聯板板用洗滌液洗滌3次；用PBS緩沖液將標準SEB抗原樣品稀釋至1 μg/mL，并進行1/2梯度稀釋12個濃度，按100 μL/孔加入對應的酶聯板中，設置上下孔為復孔，于37℃放置1 h；洗板機清洗酶聯板3次，按100 μL/孔加入5 μg/mL生物素標記的抗體，固相化的LXY8、LXY9或LXY10分別與生物素標記的抗體配對，共設置6種配伍方案，酶聯板在37℃放置1 h；用洗板機洗板3次，1∶4000稀釋Streptavidin-HRP，按 100 μL/孔 加 入 酶 聯 板 ，室 溫 放 置 45 min；用洗板機洗板3次，每孔加入100 μL TMB顯色液，室溫避光放置2 min；每孔加入100 μL 1 mol/L的H2SO4終止液終止反應；用酶標儀測定D450nm值。應用Graphpad Prism 5軟件分析數據，以標準SEB抗原濃度為橫坐標、D450nm值為縱坐標繪制四參數方程擬合曲線，方程為y=（A-D）/［1+（x/C）^B］+D，其中B為斜率，C為EC50。

1.6 SEB檢測試紙條的試制

SEB檢測試紙條是基于LXY8和LXY10配對抗體制備的快速檢測試紙條，其結構如圖1所示。

圖1 試紙條結構示意圖

該試紙條的檢測原理為：當將待測樣本滴加到樣品墊上，待測樣品會向膠體金墊方向層析，如待測樣本中含有SEB抗原，當待測樣品層析至膠體金墊可與膠體金標記的抗體LXY8結合形成抗原-膠體金標記抗體復合物并繼續向測試線（T線）方向層析，當復合物經過T線時會與T線上固相的抗體LXY10結合，形成抗體-抗原-膠體金抗體復合物，當膠體金顆粒在測試線大量聚集時，形成肉眼可見的紅色或粉紅色斑點，以測試線顏色的有無及深淺來判定檢測結果，如形成紅色線條則結果呈陽性,反之則為陰性。在控制線（C線）處包被羊抗人IgG，會與膠體金標記的LXY8結合形成紅色條帶，以此對測試反應進行質控。

以不同的溶劑配置不同SEB濃度來測試膠體金檢測試紙條對不同溶劑中SEB的檢測靈敏度，陽性對照為100 μg/mL SEB，陰性對照為PBS溶液。只有控制線（C線）形成肉眼可見的紅色條帶記為陰性結果，而測試線（T線）和控制線（C線）均形成肉眼可見的紅色條帶記為陽性結果。

1.7 數據處理

分析所有數據，并采用GraphPad Prism 5軟件繪制圖表。數據表示為x±s。

2 結果

2.1 抗體親和力測定結果

利用生物膜干涉技術測定3株抗體的親和力。表1給出了3株抗體與SEB抗原的結合常數（kon）、解離常數（kdis）以及最終的親和力常數（KD）。結果表明，3株抗體均與SEB抗原具有較高的親和力。

表1 抗體LXY8、LXY9、LXY10與SEB的親和力

2.2 間接ELISA法測定抗體結合活性

利用間接ELISA法測定生物素標記的抗體LXY8-Biotin、LXY9-Biotin和LXY10-Biotin與SEB的結合活性，結果如圖2。3株抗體均與SEB抗原具有良好的結合活性，且抗體的結合具有一定的濃度依賴性。LXY8、LXY9、LXY10與SEB抗原結合 半數 有效 濃度（EC50）分 別 為 0.021、0.040、0.029 μg/mL，實驗結果與親和力測定的數值一致。選取四參數曲線上平臺最低飽和濃度，即LXY8-Biotin、LX9-Biotin和 LXY10-Biotin濃度約為0.25 μg/mL作為抗原表位競爭的最優濃度。

圖2 間接ELISA法測定抗體結合活性

2.3 競爭ELISA法鑒定3株單克隆抗體識別表位交叉情況

根據2.2摸索的生物素標記的抗體濃度（即0.25 μg/mL）開展3株抗體識別表位交叉研究。理論上，生物素標記的抗體與固相SEB抗原結合飽和后，如加入的未經標記的抗體與生物素標記的抗體結合表位完全重疊或部分交叉，則未標記的抗體可以將生物素標記的抗體競爭下來。結果如圖3。以圖3A為例，SEB與LXY8-Biotin結合飽和后，分別加入梯度稀釋的3種抗體，只有LXY8能夠與LXY8-Biotin競爭結合抗原，表現為反應孔的吸光度值降低，即只有識別同一表位的LXY8能阻斷SEB與LXY8-Biotin的結合，提示LXY9、LXY10與LXY8的抗原表位不重疊。類似結果如圖3B、C。因此，LXY8、LXY9、LXY10抗體與SEB結合的表位并不交叉。

圖3 競爭ELISA法鑒定3株抗體識別的抗原表位不重疊

2.4 雙夾心ELISA法檢測SEB抗原

根據2.3實驗結果可判斷3株抗體與SEB結合表位不重疊，因此可以固定其中一種抗體捕獲SEB，同時用生物素標記的另一種抗體作為檢測抗體，實現對SEB的檢測。對3株抗體進行兩兩配對（配對方式見表2），結果如圖4，任意2株抗體的組合均能有效檢出SEB。同時，將大于本底2倍左右的吸光度值作為抗體對SEB的最低可檢濃度。以LXY8為固定相，LXY9-Biotin和LXY10-Biotin作為檢測抗體時最低檢測限分別約為1630、290 pg/mL；以LXY9為固定相，LXY8-Biotin和LXY10-Biotin檢測時最低檢測限分別約為600、440 pg/mL；以LXY10為固定相，LXY8-Biotin和LXY9-Biotin作為檢測抗體時最低檢測限分別約為240、460 pg/mL。綜合以上數據，LXY10（固定相）與LXY8-Biotin的配對相對最佳，可實現最低檢測限為240 pg/mL，為后續SEB檢測試劑的開發提供了有力支持。

表2 用于雙夾心ELISA法檢測SEB含量的抗體配對表

圖4 3株抗體兩兩配對SEB檢出圖

2.5 SEB膠體金檢測試紙條的試制

SEB膠體金檢測試紙條基于LXY8和LXY10配對抗體開發。首先，以PBS為溶劑配制不同濃度的SEB樣品測試膠體金檢測試紙條最低檢測限度，結果如圖5A，當SEB濃度大于2 ng/mL時，試紙條的測試線（T線）和控制（C線）均顯示條帶，表明膠體金檢測試紙條最低檢測限度為2 ng/mL。其次，考查了SEB存在于不同溶劑中對檢測結果的影響，溶劑與SEB的配置方法見表3，結果如圖5B，配制5 ng/mL的SEB所選擇的幾種溶劑均未影響試紙條的檢測限，測試線和控制線均出現紅色條帶。

圖5 初步驗證SEB膠體金試紙條的檢出限以及對待測樣品溶劑的耐受性

表3 用不同溶劑配制SEB濃度表

3 討論

目前，SEB檢測方法有分子生物學方法、儀器分析法、生物傳感法及免疫學方法[18]。分子生物學方法，如聚合酶鏈式擴增（PCR）[19]、核酸雜交[20]等可以直接檢測到金葡菌中SEB的基因序列。但這種檢測方法只能基于金葡菌存在的條件下檢測，且如果在核酸提取過程中受損會造成假陰性結果。儀器分析法主要是通過色譜法[21]或質譜法等精密儀器直接對SEB毒素分子進行檢測。生物傳感檢測方法能夠在原有檢測技術上運用新型檢測平臺及檢測原理有效提升SEB的檢測速度和靈敏度，Panneerseelan等[22]開發了免疫PCR信號放大方法,通過PCR擴增檢測毒素分子的DNA含量，該方法檢測限低至7.5 fg/mL。盡管儀器分析法和生物傳感檢測方法能夠更加精準靈敏地檢測SEB，但兩者對實驗操作和實驗環境的要求較高，不能滿足快速檢測的需求。

本研究以免疫檢測方法為基礎，首先通過抗體的表位競爭實驗確定3株候選識別SEB抗原表位不發生交叉?；诖诉M行抗體兩兩配伍試驗，以測試不同抗體配對的檢測靈敏度。在雙夾心酶聯免疫實驗中，將LXY10作為固定相捕獲SEB，LXY8作為檢測抗體是最優的一組配對，檢測限約為240 pg/mL。為了實現現場快速檢測，本研究基于酶聯免疫實驗結果，進一步開展了膠體金檢測試紙條的試制，同樣將LXY10作為固定相，以膠體金標記的抗體LXY8來抓取待測抗原。實驗結果表明，膠體金試紙條能夠在5～10 min內完成樣品的檢測，且檢測限約為2 ng/mL。國內外已報道的公開數據顯示，雙夾心ELISA檢測方法的檢測范圍為 0.078～10 μg/mL[23]，膠體金檢測試紙條能夠達到1 ng/mL[24]。本研究中這2種方法的檢測限也達到了相當的水平。

綜上所述，本研究建立了2種體外快速檢測SEB的方法，可以實現對SEB的快速檢測，2種方法均能開發成有效的檢測試劑，可用于食品安全檢測及生物安全防控。