基于酸敏感的雙響應抗癌藥物載體的研究進展

祿秀娟，郭鑫昊，萬冬，潘杰

天津工業大學 化學與化工學院，天津 300387

目前，腫瘤治療的主要方法是手術切除、放療、化療和免疫治療[1]。其中化療是當前應用最廣泛的治療方法，但是傳統的化療藥物具有溶解度差、穩定性低、毒副作用大、易產生耐藥性以及無法通過體內長循環到達腫瘤部位等一系列局限性[2]，將化療藥物負載到具有響應的智能納米載體中，可以顯著提高化療藥物的療效。近年來，刺激響應性聚合物已被廣泛應用到抗癌納米藥物載體中。然而，關于刺激響應性聚合物的研究中仍然存在許多不足，如在腫瘤部位滲透性差、對腫瘤細胞的靶向性差以及在時間和空間上很難有效地控制藥物釋放[3]，這進一步阻礙了抗癌藥物載體的開發和應用。

與正常組織相比，腫瘤組織有著諸多顯著的區別，例如：腫瘤細胞內外的pH值比正常細胞的要低；谷胱甘肽 (GSH)、溫度甚至一些酶也比正常組織的要偏高[4]。結合腫瘤內部這些特有的微環境，設計出具有雙重或多重刺激響應性的智能納米藥物載體，可以有效克服傳統化療藥物的溶解度低、毒副作用大、穩定性差、體內半衰期短、耐藥性等局限性，從而達到更好的治療效果。并且這些雙重刺激響應性納米粒，可以在不同部位受到不同的刺激后順序釋放，因此與單響應納米載體相比，可以更好地實現化療藥物的控制和釋放。

本文主要概述了近幾年內基于酸敏感雙重刺激響應的不同類型聚合物，作為抗癌藥物載體所具有的優勢以及最新研究進展，進而分析了目前該類載體的優缺點，為抗癌藥物載體的進一步開發和應用提供參考。

1 酸-溫度雙重刺激響應性聚合物

酸和溫度是比較常見的用于腫瘤微環境刺激響應性信號，這主要是因為腫瘤細胞微環境的pH、溫度和正常細胞存在一定的差異性。通常在正常組織pH保持在7.4左右，但是在腫瘤組織的pH在6.5–6.8之間，在腫瘤細胞內的溶酶體及內涵體中甚至更低，pH在4.5–6.0之間[5]。正常組織、細胞的生理溫度在37 ℃ 左右，有研究表明腫瘤組織間的溫度比正常組織間高出2–5 ℃ 左右[6]。研究人員利用這一特點合成了一系列具有pH和溫度雙重刺激響應的聚合物，這種pH/溫度雙響應聚合物能夠有效地控制抗癌藥物在特定環境中釋放。因此對pH/溫度雙響應聚合物的研究是非常有必要的。

目前，主要將pH和溫度敏感聚合物通過化學鍵偶聯，合成雙響應聚合物；或者分別對pH和溫度敏感聚合物進行修飾，最后通過自組裝形成雙響應膠束；或者將具有pH和溫度敏感的材料負載在無機材料或包埋在囊泡里；通過進一步改善顯著提高了抗癌藥物在復雜的腫瘤微環境中實現更好的藥物控釋作用。Lin等[7]根據L-谷氨酸 (GA) 是具有生物相容性的人體必需氨基酸，并且還具有兩個或多個與金屬中心配位的官能團，將沒有毒性的金屬陽離子Zn2+通過配位官能團構建出了多孔的MOF材料Zn-GA。選擇了抗癌藥物氨甲蝶呤 (MTX)，通過原位合成被加載到Zn-GA中。實驗結果表明，包封MTX后，Zn-GA的晶體結構不被破壞，并且載藥量達到12.85%。在pH 5.0、溫度42 ℃的條件下6 h內藥物釋放量達到68%，表明在特定環境刺激下有快速釋放的效果。并通過MTT法對比了不載藥和載藥的Zn-GA對細胞的毒性，發現不載藥時細胞存活率高達96%，可以基本忽略材料的毒副作用，但是載藥后的結果可以發現，相同條件下細胞存活率只有12%，此結果進一步顯示了該雙響應載體能夠有效提高癌癥治療效果。值得我們借鑒的是該雙響應抗癌納米藥物是通過一鍋法合成，直接將MTX (20 mg)、GA (15 mg) 和Zn(NO3)2·6H2O(24 mg)溶解在DMF/H2O (8 mL，V︰V=3︰1) 的混合溶液中，在80 ℃的條件下加熱6 d，最后冷卻至室溫，進而獲得載藥的Zn-GA黃色結晶?？梢钥闯鲈摵铣蛇^程非常簡單，并充分利用材料具有的獨特性質，使得該藥物載體具有很好的生物相容性、極低的毒性、良好的裝載能力和雙響應性，是一種高效控制藥物緩慢釋放的載體。表1中總結了一些現階段合成的pH和溫度雙響應聚合物的優缺點。

2 酸-磁雙重刺激響應性聚合物

磁性納米粒由于具有獨特的靶向性、成像性和熱療性[12]，以及具有定向、定量、高效、安全等特點[13]，因而被生物醫學界廣泛關注。Fe3O4是常見的磁性顆粒，但是缺乏載藥能力，只有對其進行改性才能獲得理想的具有載藥能力的磁性納米粒。近幾年研究人員利用pH敏感聚合物對磁性納米粒進行了修飾，并將抗癌藥物負載到納米粒中，從而形成既有pH響應又有磁響應的雙重刺激響應載藥納米粒。表2中總結了一些常見的pH-磁雙重刺激響應聚合物。

Hu等[14]通過接枝法用4-戊烯酸 (PA) 和N-羥乙基丙烯酰胺 (HEAA) 對一種新型生物多聚糖β-1,3葡聚糖進行修飾，制備了具有酸敏感的接枝共聚物Salecan-g-poly (PA-co-HEAA) (PPH)。再通過Fe3O4@SiO2納米粒子中羥基與PPH鏈上的羰基或氨基之間的強氫鍵作用得到了一種新型的pH-磁雙響應水凝膠Salecan-g-PPH/Fe3O4@SiO2。通過實驗證明，pH 4.5時藥物釋放量高達76%±2.6%，在細胞毒實驗中測得IC50為8 μg/mL，不載藥的材料孵育細胞48 h存活率高達90%，這進一步表明材料的安全性。這種水凝膠具有很好的生物相容性，可以有效避免體內免疫系統的排異反應，為注劑的發展奠定了一定的基礎。Pourjavadi等[15]以簡便、通用的方法合成了一種載有阿霉素(DOX)，同時具有pH-磁雙響應的納米抗癌藥物載體Fe3O4@PGMA-Hy@DOX。該納米材料的主要優點是以Fe3O4為基礎的靶向給藥，可以有效使載藥納米粒靶向于特定的腫瘤細胞，消除常規化療的副作用。實驗驗證Fe3O4@PGMA-Hy@ DOX納米顆粒在pH 5.4時24 h 內藥物的釋放量高達60%左右。細胞毒性實驗表明，Fe3O4@PGMA-Hy孵育細胞24 h后存活率高達90%，并且具有良好生物相容性。既達到了載藥又達到控制藥物釋放的目的，還具有良好生物相容性以及靶向性，唯一不足的一點是對于材料在體內的生物降解性還有待進一步證明。表2中總結了一些常見pH和磁雙重刺激響應聚合物的優缺點。

表1 一些常見的pH和溫度雙重刺激響應聚合物的優缺點Table 1 Advantages and disadvantages of some common pH and temperature dual stimulus-responsive polymers

表2 一些常見的pH和磁雙重刺激響應聚合物優缺點Table 2 Advantages and disadvantages of some common pH and magnetic dual stimulus-responsive polymers

3 酸-氧化還原雙重刺激響應性聚合物

目前，研究者們對pH和氧化還原雙重刺激響應聚合物的研究也比較廣泛，其中基于谷胱甘肽(GSH) 結合pH的研究是最為常見的。GSH是動物細胞中含量最多的生物硫醇，也是主要的氧化還原偶聯物[17]。但是GSH在腫瘤細胞內的濃度為0.5–10 mmol/L，在細胞外的濃度為2–10 μmol/L，是正常細胞中含量的4–10倍[5]。因此，研究人員利用這一特點將具有還原響應的聚合物與pH響應的聚合物結合得到了pH-氧化還原雙重刺激響應的抗癌藥物載體。表3中總結出一些常見的pH和氧化還原雙重刺激響應聚合物的優缺點。

Shang等[18]合成了一種同時具有pH/氧化還原雙重反應和主動靶向功能的納米藥物載體BTES-PDEAEMA-S-S-PEG-Fas。該載體中間用二硫鍵鏈接聚[2-(二乙基氨基)-甲基丙烯酸乙酯](PDEAEMA)和聚乙二醇 (PEG) 及每個末端由4個葉酸 (FA) 封端的星形共聚物。通過實驗測得臨界膠束濃度為1.03–2.51 mg/L，這反映了膠束的穩定性，并且該膠束的載藥量高達32.3%。體外釋放表明，在pH 5.0+10 mmol/L GSH條件下，前24 h DOX的累積釋放率68%，當時間延長到180 h時，DOX的釋放率超過90%，證明了該材料在特定腫瘤微環境中具有高效的藥物釋放能力。通過共聚焦觀察證實了末端葉酸功能化促進了細胞的內吞，細胞毒實驗測得IC50為2.62 mg/L，這進一步證明該材料具有主動靶向性、高載藥能力以及良好的生物相容性，是一種高效的抗腫瘤藥物載體。Zhang等[19]也制備了一種新型的同時包埋DOX和塞來昔布 (CXB) 的核殼結構納米顆粒 (HPPDC)。該核殼納米粒最大的特點是用透明質酸 (HA) 進行表面修飾，不僅延長了在血液中的循環而且還可以介導特異性癌細胞的內吞作用，有效避免了P-糖蛋白 (P-gp) 的外排效應。在酸性及高GSH濃度下，二硫鍵斷裂，使包裹的DOX和CXB釋放，顯著提高了對癌細胞的毒性。像這種同時裝載了兩種抗癌藥物的聚合物，不僅提高了腫瘤的治療效果，而且還具有很好地克服腫瘤細胞單一耐藥性的特點。然而這種同時裝載兩種治療效果的核殼納米粒在臨床方面的應用反而不常見，這為今后的研究指明方向。

4 酸-酶雙重刺激響應性聚合物

眾所周知，腫瘤微環境是一種非常豐富的環境，在腫瘤微環境中多種酶過度表達，腫瘤細胞外及腫瘤細胞內過度表達的酶如基質金屬蛋白酶(MMP2和MMP9)、酯酶、α-淀粉酶、組織蛋白酶B(CaB) 等[23]，pH值也低于正常細胞環境，并且腫瘤部位新生血管也多于正常部位，這些都是腫瘤組織的主要特征。表4中總結了腫瘤部位各種表達異常的酶及其藥物遞送系統中的應用。Ni等[24]開發出了一種多藥耐藥性 (MDR) 的多肽前藥 (mPEG–peptide–DOX，MSNPs)。其中mPEG延長了體內循環時間，一旦納米藥物到達腫瘤部位，會在高MMP2酶的作用下脫去mPEG，暴露出特異性靶向多肽T10 (CGGHAIYPRH)，通過受體介導的內吞作用將DOX傳遞到細胞中。最后，DOX與T10肽之間的腙鍵在酸性條件下被裂解，活性的DOX被釋放出來摧毀腫瘤細胞。實驗結果證明pH 7.4時DOX在48 h釋放了30%，當pH 5.5時DOX在相同時間內釋放90%，證實了胞內的快速響應。MSNPs在MCF-7/ADR細胞中表現出很好的細胞毒性，IC50值為34.33 mmol/L。共聚焦觀測到MSNPs對癌細胞的DNA損傷程度是MISNP和DOX處理的1.5倍和1.7倍。動物實驗中也進一步證實MSNPs的腫瘤抑制率 (TIR) 為72.09%，分別比游離DOX、T10-DOX和MISNP高2.38、1.35和1.19倍。Cun等[25]利用氯沙坦可以降低腫瘤部位的膠原蛋白，設計出了結合氯沙坦的雙響應抗癌納米顆粒DOX-AuNPs-GNPs。該納米粒的最大特點是聯合使用DOX-AuNPs-GNPs和氯沙坦來消耗腫瘤細胞外膠原蛋白，進一步提高了抗癌納米藥物在腫瘤部位的滲透性。并且在腫瘤部位高表達的MMP2及酸性條件觸發下，納米?？蓮?17.8 nm以上縮小到50.0 nm 以下，并釋放DOX，尺寸的變小更有利于向腫瘤細胞內擴散，進而達到更好的抗腫瘤效果。Zhang等[26]設計了一種一體化的熒光成像引導化療和光熱療法 (PTT) 結合近紅外光 (NIR) 能有效殺死腫瘤細胞的共軛納米粒子 (IR820-PTX)，其載藥量高達95.7%。該納米粒經過腫瘤細胞內化后，在pH和酶的作用下酯鍵裂解，紫杉醇 (PTX) 和吲哚菁綠 (IR820) 同時釋放。此外，可通過NIR刺激IR820產生的熒光成像來指導聯合治療。因此，IR820-PTX能為有效的PTT、化療和成像組合提供一種“多合一”治療平臺。

表3 一些常見的pH和氧化還原雙重刺激響應聚合物Table 3 Advantages and disadvantages of some common pH and redox dual stimuli-responsive polymers

5 酸-光雙重刺激響應性聚合物

近年來，基于pH-光雙重響應聚合物的研究步入了人們的視線，光刺激具有方便可控性，并且可以精確地控制藥代動力學，可以無害地滲透到腫瘤組織中[33]。目前常見的光敏性化合物主要有卟啉、酞菁、二氫卟酚和卟啉4種類型[34]，將可降解的光敏性化合物與pH刺激物相結合，可以實現光動力和化療聯合治療的效果。表5中總結了一些常見的光敏化合物。

Zhao等[35]設計了含有鄰硝基芐基 (NB) 光敏性基團的新型pH/光雙敏感兩親共聚物PEG43-b-P(AA76-co-NBA35-co-tBA9)。實驗證明，在酸介質中紫外照射20 min后6 d內，使得DOX累積釋放量高達74.70%，相反沒有紫外照射的對照組，6 d內的DOX累積釋放僅為3.69%，表現出藥物在光照條件下具有持續釋放能力。該材料的亮點在于其中PEG增加了藥物在體內的長循環，當到達腫瘤部位時在光照條件下鄰硝基丙烯酸酯 (NBA)中的芐基基團被裂解，轉化為水溶性基團有利于膠束解體，使負載的DOX通過靜電相互作用在腫瘤微環境中被釋放，可以有效地避免血液循環中藥物的過早釋放。Meng等[36]成功制備了具有pH/光響應性的雙交聯聚合物膠束 (CPM)，將疏水性光敏鄰硝基丁二酸芐酯 (NBS) 接到親水性乙二醇殼聚糖 (GC) 的主鏈上，然后與戊二醛(GA) 交聯來合成。通過體外釋放分析表明在pH 5.0有紫外照射的情況下，12 h內喜樹堿(CPT) 累積釋放量高達81.68%，載CPT的IC50低至2.3 μg/mL，接近游離CPT (1.5 μg/mL)。流式細胞術和共聚焦激光掃描顯微鏡共同證實MCF-7癌胞能有效地將負載CPT的CPM膠束內化，并在腫瘤細胞內釋放CPT，增強對細胞增殖的抑制作用。因此，這種具有良好生物相容性并具有雙響應的抗癌藥物載體，為構建腫瘤治療的智能響應抗癌藥物傳遞系統提供了良好的平臺。目前，可生物降解的具有pH和光響應聚合物納米粒，能夠用于臨床實驗的也是非常少的，這對于生物醫學應用仍然具有挑戰性。

表4 腫瘤部位各種表達異常的酶及其藥物遞送系統中的應用Table 4 Various abnormally expressed enzymes at tumor sites and their application in drug delivery systems

表5 一些常見的光敏化合物Table 5 Some common photoresponsive compounds

6 酸-超聲雙重刺激響應性聚合物

不同的刺激響應聚合物在抗腫瘤方面具有不同的優點。超聲相比其他物理刺激響應具有幾大突出優點，例如操作易控、成本低、侵犯性小、穿透深度大等，可應用于深部腫瘤的無創治療[41]。因此將超聲和pH結合使用，可有效提高抗癌藥物的療效。An等[42]設計了一種聯合一氧化氮(NO)治療的多功能仿生納米載體GSNO/Ce6@ZIF-8@細胞膜 (GCZ@M)。該納米載體由沸石咪唑骨架8與亞硝基谷胱甘肽 (GSNO) 和二氫卟酚e6 (Ce6) 包埋，再經同源腫瘤細胞膜包裹而成。采用4T1和231細胞評價SDT聯合NO氣體治療，結果發現，Ce6濃度達到200 μg/mL，4T1細胞的存活率為80.33%±5.84%，231細胞的也高達83.01%±4.39%，表明材料對細胞的副作用可忽略。采用MTT法觀測到，聯合治療組 (GCZ@M+US) 的細胞死亡率顯著增加至67.96%±2.28% (2 μg/mL Ce6和7.5 μg/mL GSNO)。該材料的作用原理利用超聲(US) 高穿透性引發GSNO釋放NO和Ce6生成活性氧，進而產生讓腫瘤更致命的過氧亞硝酸鹽(ONOO–) 分子和其他活性氮。該仿生納米載體具有良好的靶向性和生物相容性，為超聲聯合光動力治療提供了新的思路。Wang等[43]設計出了一種新型的能夠克服多藥耐藥性的多肽藥物納米復合物 (UPDNs)。該納米粒具有以下幾大優勢：①結構明確簡單，產率高，可放大生產；②延長體內循環，有效減少了非特異性細胞的吸收；③pH 和超聲的聯合增強了UPDNs在腫瘤部位的聚積和滲透；④具有主動靶向的能力，增強了腫瘤細胞的吸收；⑤藥物的可控釋放以及具有可生物降解性等。這使得UPDNs在治療腫瘤耐藥性方面的療效有了顯著提高。

7 結論及展望

基于酸敏感的雙重刺激響應抗癌藥物載體已是炙手可熱的研究領域，并且保持著迅猛發展的趨勢。在這些酸敏感雙響應抗癌藥物遞送系統的例子里，藥物載體研究已經初步克服了許多抗癌藥物遞送系統的屏障以及多藥耐藥性，表現出很好的療效。但是這些也僅僅處于初步的實驗階段，只有少數被應用于臨床治療。這主要是因為目前開發的大部分抗癌藥物載體結構復雜、可重復性差、在體內不可生物降解等，在一定程度上限制了其發展。為改變抗癌藥物的現有格局，在未來研究中應該結合多重刺激響應設計納米藥物載體，如pH/光/氧化還原、pH/溫度/光、pH/溫度/還原/磁等，這種多重刺激響應載體能夠結合腫瘤微環境作出相應的響應，進而克服多重生物屏障，達到臨床效果。但是多重刺激響應載體的設計存在結構復雜、可生物降解等諸多問題，因此研究者們應盡可能選擇一些殼聚糖、β-1,3葡聚糖等可生物降解的聚合物作為載體，然后用各種響應性分子對其修飾。也有研究表明，將各種靶向配體如多肽類、寡核酸配體、抗體片段等接枝在多重刺激響應納米藥物載體上，這樣既能使載體具有多重響應，還具有主動靶向性。在當今這個快速發展的社會里，相信隨著分子生物學以及高分子材料學等學科的不斷發展，能夠有效解決材料的諸多問題，使得多重刺激響應的納米顆粒藥物載體的研究在未來癌癥治療中發揮重要作用。