ABC轉運蛋白及其在合成生物學中的應用

曲俊澤，陳天華，姚明東，王穎，肖文海，李炳志

1 天津大學 系統生物工程教育部重點實驗室 教育部合成生物學前沿科學中心，天津 300072

2 天津大學 前沿技術研究院，天津 301700

ABC轉運蛋白作為最大最古老的膜蛋白家族之一廣泛存在于各種生物體中。由于它能夠利用ATP水解產生的能量進而將與其結合的諸如烷烴、氨基酸、抗生素等各種物質進行跨膜轉運，所以無論在原核生物還是高等動植物中，ABC轉運蛋白均發揮著重要的生理作用。早在20世紀70年代，在細菌對營養物質吸收的研究中首次發現了這類轉運蛋白[1]。隨后，由于其可將外源物質以逆濃度梯度的方式排出細胞外所產生的多藥耐藥性 (Multidrug resistance，MDR) 而被醫學工作者在臨床治療領域進行了更進一步的研究[2]。目前，研究發現的ABC轉運蛋白已經超過了100種，并被證實在各個領域 (如生物燃料、生物醫藥等)中均發揮著重要作用[3]。

1 ABC轉運蛋白

1.1 ABC轉運蛋白的研究進程

20世紀70年代，ABC轉運蛋白首次出現于細菌對營養成分吸收的研究中，研究發現該蛋白依賴于ATP水解直接激發底物與結合蛋白(Substrate-binding protein，SBP) 結合，進而達到轉運的目的[1]。20世紀80年代早期，研究人員克隆了幾個編碼這種轉運蛋白的基因，其中包括編碼鼠傷寒沙門氏菌Salmonella typhimurium組氨酸滲透酶和大腸桿菌Escherichia coli麥芽糖滲透酶的基因。他們在這些蛋白的氨基酸序列間發現了較強的同源性，并觀察到這些蛋白的轉運有時也會依賴于結合蛋白與轉運底物的結合[4-5]。與此同時，醫學研究者也注意到了P-糖蛋白(Permeabilityglycoprotein，P-gp) 在臨床治療上的影響，正是源于它的存在使細胞具有藥物抗 性[6]。1985年，研究人員成功克隆了不同來源編碼這類蛋白的基因，并通過表征發現了其顯著的保守性特征[7]。研究人員利用cDNA揭示了哺乳動物轉運蛋白和細菌轉運蛋白之間的保守性體現在高度保守的核苷酸結合區域 (Nucleotide-binding domains，NBDs)[8]，這也揭示了這些ABC轉運蛋白可能具有共同的進化起源 (進化關系如圖1所示)。1986年，人們鑒別了這些ATP結合的亞基，并依據這些亞基定義了這一轉運蛋白超級家族[9-12]。然而，直到1990年這些蛋白才被正式命名為ABC轉運蛋白[13]。其可利用ATP水解產生的能量將與其結合的物質逆濃度地排出胞外的功能賦予了細胞多藥耐藥性，因此在腫瘤治療相關領域中受到了研究者的廣泛關注[2]。近些年來，隨著生物技術的不斷發展，關于ABC轉運蛋白的研究也逐漸深入，科學家們利用其獨特的轉運功能將它廣泛應用于生物醫藥、生物燃料、微生物工業生產等領域中[14]。ABC轉運蛋白的研究進程時間線見表1。

表1 ABC轉運蛋白的研究進程Table 1 The research process of ABC transporters

圖1 不同來源不同亞族的ABC轉運蛋白系統進化分析Fig.1 Phylogeny of ABC transporters of different subfamilies from different species.Different species:Gc:Grosmannia clavigera;Yl:Yarrowia lipolytica;Pp:Pan paniscus;Pa:Pongo abelii;Nl: Nomascus leucogenys;Gg:Gorilla gorilla;Mm:Macaca mulatta (ABCA7),Mus musculus (ABCB12);Pt:Pan troglodytes;Cj: Callithrix jacchus;Mf:Macaca fascicularis;Xl:Xenopus laevis;Oc:Oryctolagus cuniculus;Lv: Lipotes vexillifer;Po:Paralichthys olivaceus;Tr:Takifugu rubripes;Hs:Homo sapiens;Sm: Selaginella moellendorffii;Sp:Strongylocentrotus purpuratus;Fa:Ficedula albicollis;Ph:Pseudopodoces humilis;At: Arabidopsis thaliana;Rb:Rhinopithecus bieti;Rr:Rhinopithecus roxellana;Sb:Saimiri boliviensis;Mu:Meriones unguiculatus;Oo:Orcinus orca;Ps:Pelodiscus sinensis;Bt:Bos Taurus;Cf:Canis familiaris;Tg:Taeniopygia guttata;Cg:Cricetulus griseus;Tg: Toxoplasma gondii.

1.2 ABC轉運蛋白的結構與分類原則

近些年來，研究人員通過基因組測序確定了一些編碼ABC轉運蛋白的基因。并且，隨著生物大分子結構解析技術的不斷進步，幾種ABC轉運蛋白的晶體結構也已被成功解析，例如：金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus的Sav1866多藥向外轉運蛋白、閃爍古生球菌Archaeoglobus fulgidus的ModBC-A MoO4/WO4向內轉運蛋白以及大腸桿菌的BtuCD維他命B12向內轉運蛋白等[30]?；谶@些已被解析清楚的晶體結構，研究者確定了ABC轉運蛋白的基礎結構，其核心是兩個核苷酸結合域和兩個跨膜結構域 (Transmembrane domains，TMDs)。此外，一些ABC轉運蛋白通常還帶有其他的輔助結構域 (圖2)。這些結構域在原核生物中表現為單個亞基并通過將這些亞基組裝到一起的方式發揮作用；而在真核生物中，它們則被表達為全轉運子“full-transporters”(含有兩個核苷酸結合域和兩個跨膜結構域) 或半轉運子“half-transporters”(只含一個核苷酸結合域和一個跨膜結構域)[31]。

圖2 ABC轉運蛋白經典結構模型Fig.2 Structure model of ABC transporter.*:not all ABC transporters have SBP.

研究發現，ABC轉運蛋白的跨膜轉運過程依賴于保守的耦聯機制[32]。核苷酸結合域作為ABC轉運蛋白家族的保守結構域，能夠促使跨膜結構域發揮作用。它又包含了兩個亞結構域，其中一個是結構類似于RecA的亞結構域，另一個則被稱為“螺旋亞結構域”。而在核苷酸結合域中存在的一些保守序列基序具有特定的功能，其中最重要的就是位于類RecA亞結構域的P環 (Walker-A motifs) 和位于螺旋亞結構域的LSGGQ基序 (氨基酸序列)。在整個運輸過程中，兩個核苷酸結合域組裝在一起，使這些保守基序以首尾相接的方式暴露。首尾相接的排列方式會在一個核苷酸結合域的P環和另一個核苷酸結合域間產生兩個ATP結合和水解位點。在沒有ATP結合的情況下，核苷酸結合域間的接口存在間隙，水能夠進入ATP結合位點。ATP結合后，接口關閉，使ATP被夾在核苷酸結合域之間。研究人員通過研究幾種ABC轉運蛋白轉運過程中共有的ATP水解反應發現，一次轉運過程會消耗兩分子的ATP[33]。

有關ABC轉運蛋白的分類原則，目前最常見的是根據真核ABC轉運蛋白結構域的同源性和蛋白系統進化關系，將其大致分為7個亞族(A–G)[2]，但也有人認為可以分為8個亞族 (A–H，H族為暫無歸類的ABC轉運蛋白)[14]。亦有報道將這些亞族分別命名為多藥耐藥性蛋白、多向耐藥性蛋白 (Pleiotropic drug resistance，PDR)、多藥耐藥性相關蛋白 (Multidrug resistance-associated protein，MRP)、腎上腺腦白質營養不良蛋白(Adrenoleukodystrophy protein，ALDp)、延伸因子3(Elongation factor-3，EF-3) 以及RNase L抑制因子 (RNase L inhibitor，RLI) 等[34-35]。其他分類方法包括：根據功能區域和亞基排列方式的不同，將ABC轉運蛋白分為由一個或兩個“核苷酸結合域-跨膜結構域”形式存在的獨立肽鏈和4個功能區域混合在一起形成的完整肽鏈兩大類；以及根據核苷酸結合域和跨膜結構域數量的不同，將ABC轉運蛋白分為全轉運子和半轉運子[36]。值得注意的是，半轉運子只有與另一個半轉運子形成同源或異源的二聚體時才能發揮轉運作用[21]。

1.3 ABC轉運蛋白的轉運機制與生理功能

ABC轉運蛋白參與生物體中多種重要的轉運過程，其轉運功能需要核苷酸結合域和跨膜結構域的共同參與。ABC轉運蛋白家族的轉運功能分為向外和向內兩種轉運方式。研究人員[37]詳細闡述了ABC轉運蛋白轉運過程中依靠構象改變的轉運機制。如圖3A所示，在向內轉運過程中，首先，ABC轉運蛋白處于向內構象(Inwardlyfacing conformation) 的“休息狀態”，此時兩個核苷酸結合域在跨膜結構域的帶動下保持開放狀態。當底物進入轉運蛋白時，ATP與核苷酸結合域結合，跨膜結構域構象改變以從結合蛋白中接收底物，此時ABC轉運蛋白變為向外構象 (Outwardfacing conformation)。隨后，ATP水解成ADP和磷酸基團 (Pi)，核苷酸結合域二聚體打開，底物被釋放到細胞質中，ABC轉運蛋白再次回到“休息狀態”。

而向外轉運過程，如圖3B所示，轉運首先從底物與ABC轉運蛋白的結合開始，此時轉運蛋白依然是向內構象的，但核苷酸結合域是打開的。隨后ATP與核苷酸結合域結合并使其關閉，轉運蛋白變為向外構象使底物暴露并被釋放到細胞外。最后，ATP水解，核苷酸結合域再次打開，ABC轉運蛋白恢復到初始構象。由此便完成了利用ATP水解產生的能量使底物從膜的一側向另一側的轉運過程。另外有報道[38]從結構層面更為細致地解析了ABC轉運蛋白的轉運機制。僅以向外轉運蛋白為例，在向外轉運的過程中，底物分子由核苷酸結合域傳遞到跨膜結構域?？缒そY構域中存在一些結構保守的α螺旋，這些α螺旋會像通道一樣耦合在一起，進而與核苷酸結合域中兩個亞結構域的邊界形成凹槽并相互作用。當ATP結合時，核苷酸結合域接口關閉，使耦合螺旋更加緊密，從而導致跨膜結構域從內向外翻轉。ABC轉運蛋白利用這一機制，將跨膜結構域中的結合和外排位點暴露在膜的另一側，從而使底物單向移動通過磷脂雙分子層。

圖3 ABC轉運蛋白轉運機制示意圖Fig.3 Transport mechanism of ABC transporter.(A) Import mechanism.(B) Export mechanism.

ABC轉運蛋白能夠實現多種物質的跨膜運輸，因此無論在原核生物還是真核生物中都發揮著重要的生理功能。一些向內轉運蛋白可以促進氨基酸、糖類等營養物質從胞外環境中轉運進入胞內基質，從而促進細胞生長。最初科研工作者是在研究細菌對營養物質的吸收中發現了向內轉運蛋白[1]，并且在此后很長一段時間內，人們普遍認為向內轉運蛋白只存在于原核生物中。直到2003年，植物中ABC向內轉運蛋白的發現才改變了這一觀點[14]。因此，向內轉運蛋白不僅存在于原核生物中也存在于真核生物中。而向外轉運蛋白同向內轉運蛋白一樣，共同存在于原核生物和真核生物中，它們具有“排毒”的功能，可將抗生素、脂肪酸等不利于細胞生長的物質排出胞外，有助于在細胞內將非必需的外源物質或次級代謝產物保持在較低的濃度范圍，進而減輕了細胞的生長壓力，維持了細胞的正常生長，極大地提升了細胞的存活率。ABC轉運蛋白其他的生理功能還包括：參與真核生物中的信號轉導、蛋白質的分泌以及抗原遞呈等[3]?；谶@些生理功能，科學家們受到了啟發，使得ABC轉運蛋白在各個領域中均得到了廣泛的應用。

2 ABC轉運蛋白在合成生物學中的應用

諸如pH值、溫度、滲透壓、有毒代謝產物等壓力條件會對細胞生長產生不利影響并限制代謝產物的產生。因此，在外界壓力條件下維持細胞正常生長和提高目標產物產量是微生物工業生產中最重要的目標。而細胞膜作為將細胞質與外界環境分隔開的細胞保護屏障[39-40]，其在壓力條件下的穩定性和膜脂質與膜蛋白的相互作用極大地影響了工業菌株的性能[41-43]。雖然由于工業菌株代謝的復雜性，改變膜功能以提高其底物耐受性并不會必然導致目標產物產量的增加[44]，但也有一些代謝產物與膜功能之間存在良好的耦合關系[45-46]，增強生產這些物質的工業菌株的魯棒性將會提高目標產物的產量。因此，調節微生物膜功能以維持膜內穩態可能是一種提高微生物在工業生產中生產效率的有效方法。研究表明[47]，可以通過增強膜的完整性、調節膜的流動性和調節膜的通透性來維持膜的穩態。依靠合成生物學的概念和技術，并結合基因工程和代謝工程，研究者們開發出了越來越多的策略以達到這一目的。其中，調節膜的通透性是指通過調節離子、營養物質和有毒物質的跨膜運輸來調節細胞膜對它們的選擇透過性。目前主要有3種調節膜通透性的策略：(1) 調節脂質介導的膜通透性[48]；(2)調控膜蛋白功能[49-51]；(3) 調控細胞膜內能量系統[52-53]。而ABC轉運蛋白，作為一種利用細胞質中ATP水解產生的能量進而調控物質出膜/入膜的膜通道蛋白，能夠在膜蛋白功能和細胞膜內能量系統兩方面產生影響，因此可以對其進行修飾以調節膜的通透性。研究表明[47]，這一策略具有可以同時改善菌株生長、提高底物利用率和菌株生產力的潛力。

2.1 ABC轉運蛋白用于改善工業菌株性能

細胞膜的通透性主要體現在離子、營養物質和有毒物質通過膜孔或膜蛋白進入或離開細胞。據有關膜蛋白和膜通透性的研究指出，可以通過調控膜蛋白功能來調節膜的通透性[49-51]。而膜蛋白ABC轉運蛋白可以像“泵”一樣，將物質“泵入”或“泵出”細胞，是實現這一策略較優的研究對象。工程化的ABC轉運蛋白可在微生物工業生產中用于改善工業菌株的性能，增強菌株耐受性并提高目標產物產量。

利用微生物合成游離的脂肪酸使得將可再生糖轉化為油脂化學品具有良好的應用前景。然而，大腸桿菌作為這一途徑的主要宿主，游離脂肪酸的產生會對其細胞膜的完整性和細胞生長產生負面影響。在類似于抗生素等生長選擇性壓力條件下，合成游離脂肪酸的大腸桿菌會在傳代過程中被淘汰，以此來抵抗游離脂肪酸造成的這種負面影響，這也導致了工業生產中的遺傳不穩定性[44]。而大腸桿菌內源的ABC轉運蛋白AcrB與周質融合蛋白AcrA和膜通道蛋白TolC協同工作，形成一個跨膜復合物AcrAB-TolC (圖4)，復合物貫穿細胞膜并跨越周質形成橋，有助于游離脂肪酸的外排[54]。

圖4 AcrAB-TolC跨膜復合物Fig.4 Intermembrane AcrAB-TolC complex.(A) The resting state.(B) The transport-state.(A+B) Schematic of transport mechanism.(C) Structure of AcrAB-TolC[54].OM:outer membrane;IM:inner membrane.

Dunlop等[25]在大腸桿菌中分別表達了43個異源ABC轉運蛋白，并采用一種基于競爭機制的篩選策略，在分別外加7種物質的條件下進行培養。除了兩種化合物 (正丁醇和異戊醇) 沒有篩選到可以提高耐受的轉運蛋白外，其余5種均篩選到了對應的最優轉運蛋白。隨后，他們又在檸檬烯生產菌株中表達了其中一種篩選出來的泊庫島食烷菌Alcanivorax borkumensis來源的轉運蛋白 (這一轉運蛋白在當時還沒有被表征，后來被證實為ABC轉運蛋白AcrB)，最終使檸檬烯的耐受性提高了8%，產量提高了近60%。這一結果表明，ABC轉運蛋白可以在增強生產菌株耐受性的同時提高目標產物產量。Chen等[55]也通過在釀酒酵母中表達異源的ABC轉運蛋白 (解脂耶氏酵母Yarrowia lipolytica來源) 發現，通過把細胞內癸烷和十一烷的濃度維持在較低水平的方式，ABC轉運蛋白顯著提高了釀酒酵母對于癸烷和十一烷的耐受性。

除了可以通過引入異源ABC轉運蛋白來改善工業菌株的性能，過表達內源的ABC轉運蛋白也可以達到這一目的。有研究發現，在釀酒酵母中，pdr18基因編碼的ABC轉運蛋白可以調節細胞質膜的通透性，影響胞內的乙醇濃度。研究人員利用強啟動子上調了pdr18的表達，使乙醇產量提高了6%，產率提高了17%[56]。因此，通過在乙醇發酵中增強釀酒酵母的乙醇耐受性和抑制質膜的滲透能力，pdr18基因的過表達能夠有效改善工業菌株的發酵性能。Nishida等構建了一株pdr1突變的釀酒酵母KK-211，該釀酒酵母中內源的4個ABC轉運蛋白 (Snq2、Yor1、Pdr10、Pdr15)的表達水平被上調。對這4個蛋白的功能進行研究，表明Pdr10和Snq2負責調控疏水性有機溶劑正癸烷和正十一烷的耐受性，而Snq2和Yor1則負責調控釀酒酵母對親水性有機溶劑的耐受性[57]。后續的應用研究結果顯示，相比于野生型釀酒酵母，過表達內源ABC轉運蛋白Snq2明顯提高了菌株對于外源癸烷的耐受性并促進了菌株生長[58]；過表達內源ABC轉運蛋白Yor1有助于釀酒酵母抵御多種抗生素[24]。

2.2 基于ABC轉運蛋白的負反饋調控系統

任何膜蛋白的過表達通常都會抑制細胞的正常生長，ABC轉運蛋白也不例外。因此，為了平衡過表達ABC轉運蛋白促進細胞毒素外排的同時又增加了細胞負荷所產生的正負影響，Boyarskiy等[29]在大腸桿菌中開發了一種自動反饋調控系統，調控機理見圖5。該系統利用了大腸桿菌本源的應激啟動子PgntK來負反饋調控轉運蛋白的表達水平。將這一負反饋調控系統導入大腸桿菌DH10B中，該系統可自主調控正丁醇ABC轉運蛋白突變體AcrBv2的表達水平，從而減輕了由于ABC轉運蛋白過表達所造成的細胞負擔，同時也促進了正丁醇的外排。最終，利用這一負反饋調控系統，Boyarskiy等將大腸桿菌的正丁醇耐受性提高了40%，產量提高了35%。因此，自動反饋調控系統在發揮ABC轉運蛋白解毒作用的同時又避免了由于其過表達所導致的細胞毒性，為改善菌株的生長和生產提供了一種兩全其美的手段。

圖5 負反饋調控系統機理Fig.5 Mechanism of negative-feedback system.

2.3 ABC轉運蛋白在調節胞內能量系統方面的應用

ATP作為細胞中最重要的能量來源，可通過改變其在細胞中的含量來調節微生物細胞內的能量系統。有報道稱[59]，ABC轉運蛋白能利用ATP水解產生的能量將脂質從質體轉移到內質網上，這有助于維持細胞膜脂質含量的穩定。并且通過參與細胞內膜和外膜的脂質翻轉，ABC轉運蛋白可以調節膜脂質的不對稱性，進而調節細胞膜的通透性[60]。此外，物質可以借助ABC轉運蛋白將其轉運活性與ATP水解耦聯，從而完成逆濃度梯度的轉運 (應用實例見圖6)。因此，通過ABC轉運蛋白調控ATP在胞內的含量也被認為是一種調節細胞膜對底物透過性的有效策略。

圖6 ABC轉運蛋白調節胞內能量系統的應用 (以革蘭氏陰性菌細胞表面脂多糖的轉運為例)Fig.6 Application of ABC transporter in tuning intracellular energy system (The transport of lipopolysaccharides on the cell surface of Gram-negative bacteria as an example).(A) Schematic of transport mechanism.(B) Structural overlay of LptB shows conformational changes upon ATP hydrolysis[26].(C) Structural observation of LptB implicates a key binding site[26].OM:outer membrane;IM:inner membrane;LPS:lipopolysaccharides;A:LptA;B:LptB;C:LptC;D:LptD;E:LptE;F:LptF;G:LptG.

革蘭氏陰性菌細胞表面含有脂多糖。脂多糖是一種含有多個脂肪?；湹拇笮吞侵愇镔|，構成細胞膜外側的疏水區，正是由于它的存在使細胞膜可以作為屏障，阻止大部分抗生素進入細胞中。Sherman等[26]通過使在脂多糖裝配過程中負責將其轉運的ABC轉運蛋白失活，并利用生化實驗結合ABC轉運蛋白在ATP水解前后的高分辨率晶體結構進行表征，最終發現了在大腸桿菌中相關ABC轉運蛋白的失活會減緩ATP水解，從而降低了脂多糖從膜內向膜外的運輸效率，使細胞膜對抗生素的抵抗作用減弱。與此類似，May等[52]使用一種對于新生霉素 (Novobiocin) 敏感的細胞膜缺陷型大腸桿菌篩選到一株對新生霉素抗性增強的突變體。對這一突變體進行研究發現，抗性增強是由于細胞內負責脂多糖轉運的ATP酶，即ABC轉運蛋白發生了改變。共晶體結構、生化和遺傳數據表明，新生霉素會與這種ATP酶直接結合，但它并不結合在核苷酸結合域上，而是結合在核苷酸結合域與跨膜結構域之間的接口。這種相互作用增強了負責轉運脂多糖的ABC轉運蛋白的活性，進而改變了細胞膜的通透性。這一發現有助于人們理解ATP水解與脂多糖轉運之間的關系。此外，Causey等[61]發現，在大腸桿菌中同時缺失包括ABC轉運蛋白在內的一些與ATP產生相關的膜蛋白和其他與丙酮酸氧化有關的蛋白，導致了細胞膜對于葡萄糖的透過性增加，從而促進了葡萄糖的積累，同時降低了胞內ATP的含量，減弱了丙酮酸到乙酸的代謝，最終使丙酮酸的產量增加了2.1倍。這些實例證實了，ABC轉運蛋白具有通過調節細胞內能量系統來改善菌株性能的前景。

2.4 其他

除上述應用外，ABC轉運蛋白還因其可將腫瘤治療藥物從腫瘤細胞中排出胞外，而被作為多藥耐藥性抑制靶點被應用在腫瘤臨床治療中[2]；在新能源開發方面，工程化的ABC轉運蛋白可增強微生物對于生物燃料的耐受性，對于提高生物燃料的產量具有良好的應用前景[62]；ABC轉運蛋白還可以提高植物和真菌的重金屬耐性，因此在環境保護和改善環境方面也得到了相應的應用[36,63]。此外，ABC轉運蛋白還被應用于植物栽培、藥理研究以及農藥研發等的工作中[3,64]，在此不再一一贅述。

3 總結與展望

近些年來，隨著ABC轉運蛋白的相關研究逐漸增多，其結構信息和作用機制也越來越清晰，這大大加深了研究者們對ABC轉運蛋白構效關系的認知，豐富了ABC轉運蛋白在各個領域中的應用潛力。如今，ABC轉運蛋白不再只是作為降低惡性腫瘤耐藥性的靶點而被應用在生物醫學和毒理學領域的研究中。在微生物工業生產中，如何利用工程化的ABC轉運蛋白，來提高工業菌株的特定性能，進而提升目標產物產量等的研究也受到研究者們越來越廣泛的關注。但相比于ABC轉運蛋白的龐大家族，目前的研究還是遠遠不夠的。有關ABC轉運蛋白底物的研究有待補充，比如一種轉運蛋白是否具有底物特異性，是否可以同時轉運多種不同的底物。此外，有關ABC轉運蛋白的人工設計改造也相對較少。如何通過一些技術手段改造ABC轉運蛋白以提高它的轉運效率，如何增強它的底物轉運特異性從而實現ABC轉運蛋白的“定制化”還有待相關科研工作者們的進一步努力。隨著生物技術的快速發展和合成生物學的興起，將會有越來越多新的策略和新的技術用來研究ABC轉運蛋白和擴展其應用。ABC轉運蛋白也將在合成生物學領域發揮越來越重要的作用。