外泌體：病毒與宿主博弈的另一“角斗場”

朱依凡，于少雄，仇華吉，王翀

1 華南農業大學 動物科學學院 國家生豬種業工程技術研究中心 廣東省農業動物基因組學與分子育種重點實驗室，廣東 廣州 510642

2 中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所 獸醫生物技術國家重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150069

外泌體是一類絕大多數細胞皆可分泌的小型細胞外囊泡[1]。20世紀90年代，美國華盛頓大學的研究團隊和加拿大麥吉爾大學的研究團隊相繼發現，在哺乳動物細胞的胞外環境中存在囊泡[2-3]。二十多年后，匈牙利科學家Gy?rgy將所有在細胞外部且具有脂質雙層膜封閉結構的物質定義為“細胞外囊泡 (Extracellular vesicles，EVs)”[4]。EVs有兩種不同的亞型，它們的形成途徑和直徑大小有所不同[5]。一種是由質膜向外擠壓出芽產生的微囊泡(Microvesicles，MVs)，其直徑范圍在100–1 000 nm[6]；另一種是在1987年被Johnstone正式命名為“外泌體 (Exosomes)”，其直徑為40–150 nm[7]。外泌體的形成涉及多泡體(Multivesicular bodies，MVBs) 與質膜的融合 (圖1)。最初細胞內體向內凹陷形成腔內囊泡 (Intralumenal vesicles，ILVs)，ILVs接著聚集成為MVBs，最終MVBs與質膜融合通過胞吐作用將ILVs釋放到細胞外空間，這些被釋放的囊泡即為外泌體[8-9]。

起初外泌體被發現時并未引起人們的重視，它僅僅被看作細胞垃圾的“搬運工”[2-3]。然而在過去的幾十年里，隨著研究的深入，隱藏在外泌體背后的重要功能被逐步揭開。由于具有脂質雙層膜結構，外泌體被細胞釋放后能夠穩定存在于細胞外環境中，并且可以包裹蛋白質、脂質、核酸等生物活性分子，跟隨體液循環到達機體各處。外泌體是發揮信息傳遞的重要載體[10-12]。

病毒是嚴格的細胞內寄生物，必須在細胞內才能完成復制周期從而產生新的感染性病毒粒子。病毒復制周期指病毒入侵宿主細胞在其內部完成增殖的全過程，主要涵蓋病毒的入侵、病毒蛋白的翻譯合成、基因組的復制、病毒粒子的組裝和釋放。病毒粒子的組裝以及ILVs分選進入MVBs都需要胞內囊泡的參與，此后新合成的病毒粒子和MVBs可以通過胞吐作用釋放至細胞外(圖1)。這些共用胞內囊泡的方式，為病毒“挾持”外泌體提供了可能性。早在2003年就有學者提出，逆轉錄病毒可以利用外泌體形成與分泌的既有途徑合成新的感染性病毒粒子[13]；2013年發表在Nature上的一項研究報道顯示，甲型肝炎病毒(Hepatitis A virus，HAV) 本身不具有囊膜結構，但它可以在復制時通過類似途徑合成具有膜結構的病毒顆?！坝心夷さ腍AV”(Enveloped HAV，eHAV)[14]。以上研究表明，外泌體參與病毒的復制過程。

圖1 病毒復制與外泌體產生 (改編自參考文獻[8-9,15])Fig.1 The virus life cycle and formation of exosomes (adapted from references [8-9,15]).ER:endoplasmic reticulum;ILVs:intralumenal vesicles;MVBs:multivesicular bodies.

病毒在宿主細胞內建立有效感染，產生新的子代顆粒。與此同時，宿主細胞被病毒感染后，固有的穩態被打破，外泌體遭病毒“挾持”。只有重新控制外泌體并將病毒清除，宿主細胞才能恢復至正常的生理狀態。在這場雙方的博弈中，病毒是如何通過“挾持”宿主外泌體傳播感染？而宿主又是如何利用外泌體抵抗病毒感染？本文將討論病毒操縱外泌體與宿主抗病毒機制斗爭的動態過程。

1 病毒“挾持”外泌體

與正常細胞的外泌體相比，由病毒感染的細胞釋放出的外泌體包含許多宿主不具備的病毒成分，包括病毒的蛋白質、基因組及其他遺傳物質。例如由人類免疫缺陷病毒 (Human immunodeficiency virus，HIV) 感染的細胞釋放的外泌體中包含病毒Nef和Tat蛋白[16-17]。在Ⅰ型單純皰疹病毒 (Herpes simplex virus 1，HSV-1) 感染的細胞中也存在類似的現象，被HSV-1感染的細胞釋放的外泌體裝載著病毒gB糖蛋白與人白細胞抗原DR (Human leukocyte antigen DR，HLA-DR) 復合物[18]。又如細胞被丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus，HCV) 感染后，會分泌包裹病毒胞膜蛋白E1和E2、病毒RNA及病毒IgG的外泌體[19-21]。除此之外，病毒的其他遺傳物質如卡波氏肉瘤相關皰疹病毒 (KS-associated herpesvirus，KSHV) 編碼的microRNA也可以富集于感染細胞的外泌體[22]。通過“挾持”外泌體并將自身成分裝入其中，病毒可以逃避宿主的免疫應答，促進其在細胞間的傳播。

1.1 “逃逸”中和抗體

中和抗體 (Neutralizing antibodies，NAbs) 能夠阻斷病毒感染，是常用的抗體治療手段。由于被“挾持”的外泌體能夠在一定程度上替代病毒抵抗NAbs的中和作用，從而導致中和抗體保護力不足。例如，經質譜和逆轉錄PCR技術鑒定分析，口蹄疫病毒 (Foot-and-mouth disease virus，FMDV) 感染的PK-15細胞所分泌的外泌體包含除L、2A和3B外的所有病毒蛋白以及除UTR外的基因組RNA。由于外泌體將大部分的病毒蛋白和病毒基因組從感染細胞運送至其他細胞，所以即使游離的FMDV經過特異性NAbs的處理后不再具有感染性，被FMDV感染的PK-15仍可通過釋放外泌體促進FMDV在細胞間的傳播[23]。外泌體也在豬繁殖與呼吸綜合征病毒 (Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV) 逃逸宿主免疫反應的過程中發揮重要的功能。在PRRSV感染的PK-15CD163細胞產生的外泌體中，同樣存在M、N及GP5這3個病毒結構蛋白以及病毒的基因組RNA，并且感染細胞的外泌體可介導PRRSV在未感染的易感細胞甚至非易感細胞中的感染，同樣這種傳遞方式不被NAbs阻斷[24]。此外，E2蛋白是HCV的重要囊膜糖蛋白，在其入侵及復制過程中發揮核心作用。E2蛋白的特異性抗體可以阻斷游離HCV粒子的感染，但不影響含有病毒基因組RNA的外泌體介導HCV在細胞間的感染；與之相對應的是，E2蛋白包被的外泌體與HCV在細胞內平行組裝、被釋放至胞外，E2包被的外泌體可隔離NAbs對HCV的中和作用，使HCV保持感染性[25-26]。

1.2 傳遞免疫抑制因子

病毒“挾持”外泌體后通過多種方式抑制宿主的免疫應答反應。被“挾持”的外泌體可以抑制宿主細胞抗病毒基因的表達。分離被新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV) 感染的細胞所分泌的外泌體，并將其與未感染細胞共孵育，導致未感染細胞中的白介素1β (Interleukin 1β，IL-1β)、腫瘤壞死因子α (Tumor necrosis factor α，TNF-α)、干擾素β (Interferon β，IFN-β) 等抗病毒細胞因子的mRNA水平顯著下降[27]。當B細胞被愛潑斯坦-巴爾病毒 (Epstein-Barr virus，EBV) 感染，其釋放的外泌體包裹著病毒的miR-BART15，被未感染細胞內化后，miR-BART15靶向結合核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3 (NLR family pyrin domain containing 3，NLRP3) mRNA的區，抑制NLRP3的轉錄和翻譯。由于NLRP3炎性小體的減少，宿主的抗病毒活性也隨之降低[1,28]。此外，為削弱宿主的免疫防御，病毒憑借“挾持”的外泌體誘導宿主免疫細胞發生大量凋亡。如裝載埃博拉病毒(Ebola virus，EBOV) VP40蛋白的外泌體進入免疫細胞后，通過下調細胞中RNA誘導沉默復合體(RNA-induced silencing complex，RISC) 的Dicer、Drosha、Ago 1等蛋白的表達，解除miRNA對基因的沉默作用，誘導單核細胞、巨噬細胞和T細胞凋亡[29-30]。與之類似的是，HIV的Nef蛋白能夠刺激T細胞分泌外泌體誘導旁觀者T細胞凋亡。因此，除了病毒對感染細胞直接的細胞毒性作用外，外泌體引發的未感染的旁觀者T細胞凋亡也可能是T細胞耗竭的原因之一[31]。

2 宿主利用外泌體抵抗病毒感染

盡管外泌體介導的病毒成分轉移可能有利于傳播病毒感染，但是宿主也可憑借外泌體的運輸作用激發細胞建立抗病毒狀態。

2.1 誘導抗病毒因子的表達

病毒核酸通常會觸發感染細胞的先天免疫反應，而包裹病毒核酸的外泌體可在受體細胞中發揮相同的作用。HCV能夠在HCV亞基因組復制子(Subgenomic replicon，SGR) 細胞中復制但不產生具有感染性的病毒粒子。HCV SGR細胞被HCV感染后，分泌的外泌體攜帶病毒RNA成分并將其傳遞至未感染的漿細胞樣樹突狀細胞 (pDC)，激活pDC且誘導其表達干擾素α (Interferon α，IFN-α)，從而產生抗病毒反應[20]。呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus，RSV) 感染的細胞分泌的外泌體含有病毒RNA，載有RSV核酸的外泌體誘導人單核細胞和氣管上皮細胞釋放TNF-α、RANTES等細胞因子和趨化因子，激活細胞的先天免疫應答[32]。

2.2 遞送抗病毒因子

作為抵抗病毒感染的主要宿主防御系統，干擾素家族可誘導抗病毒基因的表達，啟動有效的抗病毒反應[33]。外泌體包裹干擾素刺激基因(Interferon-stimulated genes，ISGs) 在細胞間傳播，增強細胞的抗病毒反應。

干擾素誘導的跨膜蛋白3 (IFN inducible transmembrane protein 3，IFIM3) 是重要的抗病毒因子，能夠在病毒感染的早期抑制病毒侵入細胞[34]。細胞被登革熱病毒 (Dengue virus，DENV)感染后，胞內干擾素表達量增加，促進下游的IFIM3高表達來抵御病毒侵入。同時，細胞將IFIM3裝載進外泌體并釋放至胞外。外泌體在細胞間運輸IFITM3，將其從被DENV感染的細胞遞送至未感染的細胞，賦予未感染細胞同等的抵抗DENV侵入的能力[35]。

此外，IFN-α可誘導HepG2.2.15細胞表達人胞苷脫氨酶 (APOBEC3G，A3G) 抵抗乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV) 的感染[36]。通過熒光標記試驗發現，在IFN-α的刺激下，肝非實質細胞能夠通過釋放外泌體，將A3G遞送至被感染的肝實質細胞，恢復肝實質細胞的抗病毒能力[37]。A3G還是細胞固有免疫系統針對HIV-1和其他逆轉錄病毒的關鍵抗病毒蛋白。載有A3G的外泌體進入被HIV-1感染的細胞，可抑制HIV-1的反轉錄及病毒蛋白的合成，阻止HIV-1復制[38]。來自健康男性的精液外泌體被受體細胞內化后，釋放其內包裹的抗病毒因子APOBEC3來抑制HIV-1的RNA逆轉錄，阻礙其復制[39]。

2.3 抑制病毒傳播

外泌體通過阻礙病毒對宿主細胞的入侵來抑制病毒感染。陰道上皮細胞是HIV在性傳播途徑中最早接觸的細胞，HIV-1能夠通過胞吞作用進入其中，而精液來源的外泌體可引發這一過程的阻滯，進而降低HIV-1從陰道上皮細胞向靶細胞傳播的效率[40-41]。HIV還可通過結合細胞表面的受體進行入侵。樹突狀細胞特異性細胞間粘附分子3-結合非整合素 (Dendritic cell specific intercellularadhesion-molecule-3 grabbing nonintegrin，DCSIGN) 是樹突狀細胞重要的模式識別受體，可以與HIV-1結合，而來自健康女性乳汁的外泌體表面帶有DC-SIGN的配體——可溶性粘蛋白1(MUC1)，因此乳汁外泌體能夠在單核細胞來源的樹突狀細胞 (Monocyte-derived dendritic cells，MDDC) 上與HIV-1競爭性結合DC-SIGN受體，從而抑制HIV-1的復制并減少病毒向CD4+T細胞的傳播[42]。

3 總結與展望

外泌體是宿主重要的物質及信息傳遞工具，它本身是中立的存在，其內容物的包裹取決于它的供體細胞，而在它的受體細胞上則體現內容物的功能。當病毒感染宿主時，外泌體的功能表現出兩面性 (表1)。一方面，外泌體由于病毒的“挾持”而協助病毒逃逸中和抗體及抑制宿主的免疫應答。另一方面，外泌體也輔助宿主誘導產生和傳遞抗病毒因子，建立抗病毒的防御機制。外泌體功能的兩面性是病毒與宿主博弈的結果，但目前尚不明確病毒或宿主對外泌體控制權的具體因素，可能與病毒的感染時期、病毒的感染水平以及外泌體靶細胞的特性等有關。此外，病毒感染會引起宿主外泌體內容物的改變，最明顯的差異在于外泌體內出現了外源性的病毒成分，既有病毒基因組，也有病毒蛋白。不同的病毒其遺傳物質、形態結構、種屬特征迥異，外泌體對病毒成分的包裹是否具有傾向性還有待探討。

表1 外泌體在病毒感染和免疫應答中的作用Table 1 Various functions of exosomes in viral infections and immune responses

近年來研究外泌體的熱潮只增不減。然而迄今為止，有關外泌體調控病毒感染宿主細胞的機制研究占比較少，主要原因在于學者們面臨如何高效、便捷地將外泌體與病毒粒子分離開來并同時保留外泌體生物活性的技術瓶頸。由于病毒與外泌體的大小相近，通過超速離心法、聚合物沉降法、凝膠排阻法等分離未感染細胞的外泌體(后簡稱“未感染外泌體”) 的方法來分離感染細胞的外泌體 (后簡稱“感染外泌體”)，得到的產物往往是外泌體與病毒粒子摻雜在一起的混合物[43-44]?，F已證明，聯合使用密度梯度離心或免疫磁珠吸附的方法可以從混合物中純化出感染外泌體(表2)。密度梯度離心法的使用成本較低，但存在耗時久、介質洗脫困難等問題；而免疫磁珠由外泌體標記蛋白(CD63或CD81)的抗體包被，可以特異性吸附外泌體，因此通過該法獲得的外泌體的純度高，然而也存在抗體對于不同物種來源的外泌體可能不通用以及磁珠處理通量小等問題[44]。外泌體的純化方法有待進一步優化。目前，建立病毒感染細胞模型的技術已經十分成熟，純化外泌體有助于建立內化感染外泌體的細胞模型，以便開展病毒感染宿主細胞的機制研究，為探索阻斷病毒感染的防控機制奠定理論基礎。

表2 不同病毒感染細胞外泌體的純化方法Table 2 Methods for purifying exosomes released from virus-infected cells

病毒感染細胞引起細胞內核酸、蛋白質等生物活性分子的表達發生變化。外泌體包裹這些分子釋放至胞外，被未感染細胞內化后釋放包裹的分子發揮調控作用。外泌體不僅調節病毒感染的致病機制，還影響宿主的抗病毒免疫反應。研究外泌體有助于為抗擊病毒感染提供新的思路。