反應擠出與酶法聯合制備多孔淀粉工藝的優化

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(1.江南大學食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇無錫 214122；2.江南大學食品學院，江蘇無錫 214122)

多孔淀粉是一種新型改性淀粉,與天然淀粉相比具有多孔海綿狀結構和較大比表面積。因為這一結構特性,多孔淀粉具備許多優于天然淀粉的性能,如良好的吸附性能[1]。多孔淀粉作為淀粉的高附加值產品,可作為風味物質載體、止血劑、重金屬離子吸附劑、脂肪替代物等,具有獨特的優勢[2-4],在食品、農業、醫藥、農業和化妝品等領域得到了廣泛的應用[5-6]。

常見的多孔淀粉制備法有物理、化學和生物法[7-8]。其中,生物法是指通過酶作用淀粉的無定形區,在淀粉顆粒上形成連接淀粉中心的孔洞的方法,被認為是一種簡便、安全、工業化的方法[9]。生物法制備多孔淀粉常用的酶有α-淀粉酶和糖化酶,它們的協同作用能夠有效提高多孔淀粉的制備效率。然而,天然淀粉由于其顆粒特性,如低比表面積和高比例的結晶區域,通常酶水解緩慢且效果不佳[10]。為了提高復合酶與淀粉的反應效率,常采用前處理輔助天然淀粉的酶解。目前濕熱法、超聲波等前處理方法已被廣泛研究[11]。

反應擠出是一種特殊的擠出加工技術,指在擠壓過程中各種物料于擠出機內,在螺桿轉動下實現的物理、化學、生物反應的過程。在擠壓過程中引入酶可在擠壓過程中加強酶對底物的作用。先前的研究表明,引入酶的反應擠出技術可以產生多孔結構[12-13]。反應擠出可以增加淀粉的糊化度,使淀粉顆粒表面粗糙,增加淀粉對酶的敏感度,進而提高酶解效率[14]。然而,關于擠壓預處理反應擠出聯合酶作用制備多孔淀粉的文獻資料較少。因此,研究反應擠出與酶聯合對多孔淀粉制備的影響很有必要。

因此,本文采用反應擠出作為前處理,聯合復合酶水解制備多孔淀粉,采用Placket-Burman Design(PBD)實驗、最陡爬坡實驗和Box-Benhnken Design(BBD)試驗優化反應擠出復合酶法聯合制備多孔淀粉工藝,使用掃描電鏡觀察四種不同類型的淀粉樣品,為優化多孔淀粉制備工藝及多孔淀粉質量提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

玉米淀粉 諸城興貿玉米開發有限公司;糖化酶(酶活81916 U/g，最適溫度60 ℃,最適pH4.0～4.5)、中溫α-淀粉酶(酶活2879 U/g，最適溫度50～70 ℃,最適pH5.5～7.5) 北京奧博星生物技術有限責任公司;大豆油 嘉里糧油(中國)有限公司;檸檬酸、磷酸氫二鈉、氫氧化鈉、鹽酸等試劑 均為分析純。

FMHE36-24型雙螺桿擠壓機 螺桿直徑36 mm,長徑比24∶1，湖南富馬科食品工程技術有限公司;AL104型分析天平 梅特勒-托利多儀器有限公司;EMS-30型恒溫水浴攪拌器 上海百典儀器設備有限公司;TDL-5A型離心機 無錫市瑞江分析儀器有限公司;DHG-9123A型電熱恒溫鼓風干燥箱 上海柏欣儀器設備廠;SU-1510掃描電子顯微鏡 日本日立株式會社;SCIENTZ-10N冷凍干燥機 寧波新芝生物科技股份有限公司;SHB-Ⅲ型循環水式真空泵 長沙明杰儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 反應擠出淀粉擠出物的制備 將玉米淀粉與中溫α-淀粉酶按照一定比例均勻混合30 min,置入喂料斗,擠壓過程中通過調節雙螺桿擠壓機的溫度、螺桿轉速、喂水量收集擠出物。擠出物經冷凍干燥后,粉碎待用。

1.2.2 多孔淀粉的制備 實驗利用酶法制備多孔淀粉[1]。向250 mL錐形瓶中加入一定量的擠出物(或普通玉米淀粉——作為對照組)與磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液,混合均勻后加入糖化酶,在一定的溫度、pH、底物濃度、酶解時間下制備多孔淀粉。通過向體系中加入1 mL、4 mol/L的NaOH終止反應,15 min后加入1 mL、4 mol/L HCl平衡pH。將酶解液離心(4500 r/min,5 min),舍棄上清液并洗滌沉淀3次。將沉淀放入40 ℃烘箱中干燥24 h后研磨過100目篩,即得多孔淀粉。

1.2.3 Plackett-Burman試驗 根據前期單因素預實驗,設計實驗次數N=12的Plackett-Burman試驗[15],選取擠壓溫度(X1)、物料水分含量(X2)、螺桿轉速(X3)、α-淀粉酶添加量(X4)、酶解時間(X5)、糖化酶添加量(X6)、pH(X7)、酶解溫度(X8)、底物濃度(X9)為Plackett-Burman試驗設計因素。每個因素選取低、高兩個水平,高水平約為低水平的1.5倍。試驗因素與水平表見表1。

表1 Plackett-Burman試驗因素與水平表Table 1 Variables and assigned concentrations of Plackett-Burman test

1.2.4 最陡爬坡試驗 將由Plackett-Burman試驗確定的影響實驗結果的顯著因素,根據系數估計值確定爬坡方向,將正系數因素的值按照一定步長逐步增加,負系數因素的值逐步減小,按照一定步長設計最陡爬坡試驗,尋求最佳響應區域。

1.2.5 Box-Behnken響應面試驗 在最陡爬坡試驗確定的最大響應值區域內,以多孔淀粉吸油率為響應值,以多孔淀粉制備中的主要因素物料水分含量、α-淀粉酶添加量、酶解時間、糖化酶添加量為因素,設計Box-Behnken試驗。

表2 Box-Behnken響應面試驗因素與水平表Table 2 Factors and levels of Box-Behnken response surface test

1.3 指標測定

1.3.1 吸油率的測定 多孔淀粉對油的吸附屬于無選擇性吸附,可以通過吸油率來表征多孔淀粉的成孔情況[16-17]。將2 g淀粉樣品稱入50 mL燒杯中,與大豆油在室溫下不斷攪拌30 min。吸附后的大豆油和淀粉經布氏漏斗抽濾5 min保證分離完全。吸附速率計算公式如下:

式中:m為樣品重量,g;m1為濾紙重量,g;m2為濾紙和過濾后樣品總重量,g。

1.3.2 掃描電鏡分析 干燥后的淀粉樣品用導電膠帶均勻地分布在樣品臺上,鍍金后在掃描電子顯微鏡(Scanning Electron Microscope,SEM)內加壓觀察其微觀結構[18],放大倍數為2500倍。

1.4 數據處理

實驗采用Design-Expert 8.0進行方法設計,試驗數據采用SPSS 20.0軟件進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 Plackett-Burman篩選試驗

表3 Plackett-Burman試驗設計結果Table 3 Experimental design and result of Plackett-Burman design

表4 Plackett-Burman設計實驗結果方差分析及顯著性檢驗Table 4 Results of regression analysis of Plackett-Burman design

2.2 最陡爬坡試驗

最陡爬坡設計及結果如表5所示。隨著物料水分含量的減小,α-淀粉酶添加量、酶解時間及糖化酶添加量的增加,多孔淀粉的吸油率呈現出先增大后減小的趨勢。說明實驗號3比較接近最佳響應區域。因此,以物料水分含量36%、α-淀粉酶添加量0.5%、酶解時間8 h、糖化酶添加量1.7%為試驗中心點設計Box-Behnken響應面優化試驗。

表5 最陡爬坡實驗結果Table 5 Results of the steepest ascent design

2.3 Box-Behnken響應面優化試驗

2.3.1 Box-Behnken 試驗設計 通過Box-Behnken試驗設計對物料水分含量、α-淀粉酶添加量、酶解時間、糖化酶添加量4個因素進行分析,得到Box-Behnken響應面試驗設計及結果見表6,回歸方程顯著性檢驗及方差分析見表7。經多元回歸分析,建立各因素與吸油率(Y)之間的二次回歸方程:Y=68.55+0.22A+0.53B-0.86C+0.65D-1.24AB+0.38AC-1.63AD-0.28BC+0.05BD-0.67CD-2.16A2-1.71B2-2.02C2-1.76D2

表6 Box-Behnken響應面試驗設計及結果Table 6 Experiment design and results of response surface methodology from Box-Behnken design

表7 回歸方程顯著性檢驗及方差分析Table 7 Significance test and variance analysis of regression equation

2.3.2 Box-Behnken響應面曲面交互作用分析 圖1為影響吸油率的各個因素之間的響應面曲面交互作用圖。通過判斷等高線的圓形程度和響應面的坡度,判斷各個因素之間的交互作用。響應面坡度越陡峭,等高線越密集,說明響應值對該條件的改變越敏感,該因素對吸油率的影響越大[20-21]。AB、AD之間存在極顯著交互作用,且響應值最優點均在試驗考察的區域范圍內。

圖1 物料水分含量、α-淀粉酶添加量、酶解時間、糖化酶添加量對多孔淀粉吸油率影響的響應面Fig.1 Response surface of the effects of water supply,α-amylase addition,enzymolysis time and glucoamylase addition on the oil absorption of porous starch

2.3.3 驗證試驗 通過對響應面圖的分析可以得出,吸油率Y存在最大值。利用Design-Expert可得對應因素物料水分含量取35.7%,α-淀粉酶添加量取0.52%,酶解時間7.7 h,糖化酶添加量取1.73%。此時吸油率達到最大值68.83%?？紤]到實驗條件的可操作性,將最優條件修正為:物料水分含量取36%,α-淀粉酶添加量取0.52%,酶解時間7.7 h,糖化酶添加量取1.73%。為了驗證模型的準確性,在修正條件下進行驗證,取三次重復試驗平均值,所得吸油率為68.49%,與預測值基本相符(相對誤差為0.58%),說明通過Design-Expert確定最大值是可靠的[21]。而采用復合酶水解得到的對照多孔淀粉的吸油率59.57%,試驗組的多孔淀粉吸油率提高了14.97%。

2.4 多孔淀粉微觀結構分析

圖2為不同方式處理得到的淀粉樣品的掃描電鏡圖片。天然玉米淀粉為一種表面光滑的球形和橢圓形顆粒,其粒徑在5～26 μm之間[22]。經過酶解處理后的多孔淀粉顆粒(圖2b)表面有較大孔洞,然而,這些孔洞分布數量較少且不均勻。經過反應擠出處理的淀粉(圖2c)表面形成小的、數量較多的孔,這些孔增大了淀粉的比表面積,且可成為酶易攻擊的位點[23-25]。圖2d為反應擠出聯合復合酶水解形成的多孔淀粉,可以看到孔的分布較均勻,孔數量增大,比表面積增加,導致吸油率升高。

圖2 多孔淀粉的掃描電鏡圖(2500×)Fig.2 Scanning electron micrography of native starch(2500×)注:a為普通玉米淀粉;b為由普通玉米淀粉水解制備的對照多孔淀粉;c為反應擠出玉米淀粉;d為反應擠出聯合酶水解法得到的多孔淀粉。

3 結論

本研究以玉米淀粉為原料,多孔淀粉吸油率為指標,利用Placket-Burman Design試驗、最陡爬坡試驗和Box-Benhnken Design試驗對反應擠出聯合復合酶法制備多孔淀粉工藝進行優化,最佳工藝參數為:物料水分含量36%、α-淀粉酶添加量0.52%、酶解時間7.7h、糖化酶添加量1.73%,擠壓溫度70 ℃、螺桿轉速120 r/min、pH5.0、酶解溫度50 ℃、底物濃度25%,此條件下制備的多孔淀粉吸油率達到最大值68.49%,較對照組提高了14.97%。反應擠出與酶l h作用方法有效提高了多孔淀粉的制備效率,產品在孔的數量、孔徑大小、分布均一性等方面,都較天然淀粉酶解法制備方法有了明顯的提升,且制備過程不涉及有機試劑,是一種對環境友好的多孔淀粉制備新方法。該研究為高效制備高品質多孔淀粉提供了一種新的途徑,可進一步為反應擠出與酶聯合制備多孔淀粉的工業化生產提供依據,可廣泛作為吸附劑和封裝劑應用于各種食品中。另外,反應擠出聯合復合酶法制備得到的多孔淀粉,其吸附解析等理化特性以及不同應用場合的具體問題還有待進一步研究。