人參皂苷Rb3聯合β-細辛醚對血管性癡呆模型小鼠的改善作用及其機制研究

鄧敏貞 鐘曉琴 高志杰 孫一凡 黃麗平

摘 要 目的：研究人參皂苷Rb3聯合β-細辛醚對血管性癡呆（VD）模型小鼠的改善作用及其機制。方法：將ICR小鼠隨機分為模型組、人參皂苷Rb3組（10 mg/kg）、β-細辛醚組（10 mg/kg）、聯合用藥組（人參皂苷Rb3 10 mg/kg +β-細辛醚10 mg/kg）、陽性對照組（鹽酸多奈哌齊1 mg/kg）和蛋白激酶B（Akt）抑制劑組（LY294002，1 mg/kg），并設假手術組，每組10只。除假手術組外，其余各組小鼠均按四血管阻斷法復制VD模型。造模后，假手術組和模型組小鼠灌胃等體積生理鹽水，Akt抑制劑組腹腔注射相應藥物，其余各組均灌胃相應藥物，每日2次，連續30 d。末次給藥后，采用避暗實驗檢測各組小鼠的學習記憶能力，酶聯免疫吸附測定法檢測其海馬組織中4-羥基壬烯酸（4-HNE）、 8-羥基脫氧鳥苷（8-OHdG）、活性氧（ROS）含量，實時熒光定量聚合酶鏈式反應技術檢測海馬組織中B細胞淋巴瘤2（Bcl-2）及其X蛋白（Bax） mRNA的表達，免疫熒光法檢測皮質中Bcl-2蛋白的表達，Western blotting法檢測海馬組織中Bcl-2、Bax蛋白的表達。結果：與假手術組比較，模型組小鼠的避暗潛伏期顯著縮短，錯誤次數顯著增多，4-HNE、8-OHdG、ROS含量以及Bax mRNA、蛋白的表達水平均顯著升高，Bcl-2 mRNA、蛋白的表達水平均顯著降低（P<0.01）。與模型組比較，人參皂苷Rb3組、β-細辛醚組、聯合用藥組和陽性對照組小鼠的避暗潛伏期均顯著延長，錯誤次數均顯著減少，4-HNE、8-OHdG、ROS含量以及Bax mRNA、蛋白的表達水平均顯著降低，Bcl-2 mRNA、蛋白的表達水平均顯著升高，且聯合用藥組的效果最為顯著（P<0.05或P<0.01）;而Akt抑制劑組小鼠的避暗潛伏期顯著縮短，錯誤次數顯著增多，4-HNE、8-OHdG、ROS含量以及Bax mRNA、蛋白的表達水平均顯著升高，Bcl-2 mRNA、蛋白的表達水平均顯著降低（P<0.05）。結論：人參皂苷Rb3聯合β-細辛醚對VD模型小鼠學習記憶能力具有一定改善作用，且效果優于各化合物單用。這種作用可能與抗氧化應激、抗海馬組織凋亡有關。

關鍵詞 人參皂苷Rb3;β-細辛醚;血管性癡呆;氧化應激;凋亡;小鼠

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To study the improvement effects of ginsenoside Rb3 combined with β-asarone on vascular dementia （VD） model mice and its mechanism. METHODS： ICR mice were randomly divided into model group， ginsenoside Rb3 group （10 mg/kg）， β-asarone group （10 mg/kg）， drug combination group （ginsenoside Rb3 10 mg/kg+β-asarone 10 mg/kg）， positive control group （donepezil hydrochloride 1 mg/kg） and Akt inhibitor group （LY294002， 1 mg/kg）， and sham operation group was set up， with 10 mice in each group. Except for sham operation group， VD model was induced by four vessel occlusion method in other groups. After modeling， sham operation group and model group were given constant volume of normal saline， Akt inhibitor group was given relevant medicine intraperitoneally， and other groups were given relevant medicine intragastrically， twice a day， for consecutive 30 d. After last administration， the learning and memory ability of mice was detected by avoiding darkness test. The contents of 4-hydroxydecenoic acid （4-HNE）， 8-hydroxydeoxyguanosine （8-OHdG） and reactive oxygen species （ROS） in hippocampus was detected by ELISA. RT-PCR assay was used to detect the mRNA expression of Bcl-2 and Bax in hippocampus. The protein expression of Bcl-2 in cortex was detected by immunofluorescence method. Western blotting assay was used to detect the protein expression of Bcl-2 and Bax in hippocampus. RESULTS： Compared with sham operation group， the incubation period of avoiding darkness test in model group was shortened significantly; and the number of errors was increased significantly; 4-HNE， 8-OHdG and ROS contents， mRNA and protein expression of Bax were increased significantly， and mRNA and protein expression of Bcl-2 was decreased significantly （P<0.01）. Compared with model group， the incubation period of avoiding darkness test was prolonged significantly in ginsenoside Rb3 group， β-asarone group， drug combination group and positive control group， the number of errors was decreased significantly; 4-HNE， 8-OHdG， ROS contents， mRNA and protein expression of Bax were decreased significantly， and mRNA and protein expression of Bcl-2 were increased significantly， especially in drug combination group （P<0.05 or P<0.01）. But the incubation period of avoiding darkness test was shortened significantly in Akt inhibitor group， and the number of errors was increased significantly; 4-HNE， 8-OHdG， ROS contents， mRNA and protein expression of Bax were increased significantly， and mRNA and protein expression of Bcl-2 were decreased significantly （P<0.05）. CONCLUSIONS： Ginsenoside Rb3 combined with β-asarone has a protective effect on VD model mice， and the effect was better than that of each compound alone. The mechanism of which may be associated with anti-oxidative stress and anti-apoptosis of hippocampus.

KEYWORDS? ?Ginsenoside Rb3; β-asarone; Vascular dementia; Oxidative stress; Apoptosis; Mice

血管性癡呆（Vascular dementia，VD）是一種由缺血性腦血管疾病所致腦組織局部腦血流量減少、缺氧等因素所造成的中樞神經功能障礙性疾病，主要臨床表現為認知功能障礙[1]。研究發現，VD和散發性阿爾茨海默病的共同始動環節是慢性腦組織血液供應不足[2]。目前，臨床尚無理想的防治認知功能障礙的藥物。中藥復方由于具有多途徑、多靶點的作用特點，對癡呆疾病的預防和治療具有一定的優勢[3]，故有潛在的開發價值。

人參發揮藥效的主要物質基礎是人參總皂苷，其中人參皂苷Rb類成分的含量較高。有研究發現，人參總皂苷具有提高學習記憶的能力[4]。石菖蒲臨床廣泛用于中風后遺癥、健忘等神經系統疾病的治療[5]。β-細辛醚作為石菖蒲揮發油的主要活性成分，具有保護心血管、易透過血腦屏障等特點，在心腦血管疾病的防治中具有重要價值[6]。人參和石草蒲都是益智古方定志小丸的主要成分[7]。本課題組前期研究發現，人參總皂苷聯合石菖蒲揮發油可有效改善癡呆模型小鼠的學習記憶能力[8];此外有研究證實，β-細辛醚可減緩癡呆模型小鼠的認知功能障礙[9-10]，人參皂苷Rb3對心臟血管再灌注和大腦缺血再灌注損傷有一定的保護作用[11-12]。在上述研究的基礎上，本文主要探索人參皂苷Rb3與β-細辛醚聯用對VD模型小鼠的改善作用，并初步研究其作用機制，以期為治療VD的新藥開發提供試驗依據。

1 材料

1.1 儀器

SBA-2 型小鼠避暗儀（中國醫學科學院藥物研究所）;IKA T10基礎型分散機（德國IKA公司）;5804R型高速冷凍離心機（德國Eppendorf公司）;ME403型電子天平[梅特勒-托利多國際貿易（上海）有限公司];Biotek-EON型酶標儀（美國Bio Tek公司）;CFX96型熒光定量聚合酶鏈式反應（PCR）儀（美國Bio Rad公司）;TI2-E型全自動倒置熒光顯微鏡（日本Nikon公司）。

1.2 藥品與試劑

人參皂苷Rb3對照品、β-細辛醚對照品（四川維克奇生物技術有限公司，批號：wkq18020701、wkq18042602，純度均大于98%）;鹽酸多奈哌齊片[衛材（中國）藥業有限公司，批號：1706077，規格：5 mg];LY294002[蛋白激酶B（Akt）抑制劑，美國Med Chem Express公司，批號：154447-36-6];水合氯醛（國藥集團化學試劑有限公司，批號：20170414）;4-羥基壬烯酸（4-HNE）酶聯免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，批號：UK92FFJBWN）;8-羥基脫氧鳥苷（8-OHdG）ELISA試劑盒（武漢華美生物工程有限公司，批號：C22013999）;活性氧（ROS）ELISA試劑盒（南京草本源生物科技有限公司，批號：07/2019）;Trizol試劑（美國Invitrogen公司，批號：191012）;PrimeScriptTM RT Reagent Kit、SYBR? Premix Ex Taq Ⅱ[寶生物工程（大連）有限公司，批號：RR037A、RR820A];B細胞淋巴瘤2（Bcl-2）及其X蛋白（Bax）、β-肌動蛋白（β-actin）基因引物由上海英濰捷基貿易有限公司合成;4%多聚甲醛（廣州晶欣生物科技有限公司，批號：JX0100）;兔源Bcl-2克隆抗體（批號：ab182858和#3498S）、兔源Bax抗體（批號：#2772S）多克隆、兔源GAPDH單克隆抗體（批號：5174S）、辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗兔IgG二抗（批號：7074S）均購自美國CST公司;SABC-FITC免疫組化試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司，批號：SA1062）;生理鹽水（辰欣藥業股份有限公司，批號：1910242706）;蛋白裂解液（上海碧云天生物技術有限公司，批號：P0013B）;其余試劑均為分析純，水為純凈水。

1.3 動物

SPF級ICR小鼠70只，雄性，3月齡，體質量（25±2）g，由廣東省醫學動物實驗中心提供，動物生產許可證號為SCXK（粵）2014-0035。所有小鼠均適應性飼養3 d再進行后續實驗。本實驗方案通過廣東省中醫院實驗動物倫理委員會審核同意。

2 方法

2.1 造模

參考相關文獻[13]按四血管阻斷法復制VD模型。腹腔注射10%水合氯醛（350 mg/kg）進行麻醉，分離小鼠雙側頸總動脈，用動脈夾阻斷其血流30 min，松開動脈夾恢復血流10 min，重復3次。于第1次阻斷血流5 min后，斷尾放血約0.3 mL。于第3次缺血再灌注后30 min，觀察小鼠呼吸、心跳，待其恢復正常后即可縫合皮膚。

2.2 分組與給藥

根據前期預實驗結果設置給藥劑量。將60只VD模型小鼠隨機分為模型組、人參皂苷Rb3組（10 mg/kg）、β-細辛醚組（10 mg/kg）、聯合用藥組（人參皂苷Rb3 10 mg/kg+β-細辛醚10 mg/kg）、陽性對照組（鹽酸多奈哌齊，1 mg/kg）和Akt抑制劑組（LY294002，1 mg/kg），并另設假手術組（按“2.1”項下方法操作，但不行缺血再灌注），每組 10 只。模型組和假手術組小鼠灌胃等體積生理鹽水，Akt抑制劑組小鼠腹腔注射相應藥物，其余各組小鼠灌胃相應藥物，每日2次，連續30 d。

2.3 小鼠學習記憶能力評價

采用避暗實驗評價各組小鼠的學習記憶能力。第29天給藥結束后，將各組小鼠置于避暗儀中適應2 min 后，將其背對暗室的洞口放入明室。小鼠進入暗室，受到電擊后逃出暗室，如此訓練5 min。24 h后（即末次給藥后）正式檢測，將每只小鼠分別置于明室，記錄其從明室第1次進入暗室的時間（避暗潛伏期）和5 min內小鼠進入暗室的次數（錯誤次數）。

2.4 小鼠海馬組織中4-HNE、8-OHdG、ROS含量檢測

采用ELISA法檢測各組小鼠海馬組織中4-HNE、8-OHdG、ROS含量。避暗實驗結束后，頸椎脫臼處死各組小鼠，迅速取出其左側海馬組織，精密稱定質量后以生理鹽水制成10%海馬組織勻漿，于4 ℃、3 500 r/min條件下離心15 min，吸取上清液，使用酶標儀檢測各組小鼠海馬組織中4-HNE、8-OHdG、ROS含量。嚴格按照相應試劑盒說明書操作。

2.5 小鼠海馬組織中Bcl-2、Bax mRNA表達情況檢測

采用實時熒光定量PCR法檢測各組小鼠海馬組織中Bcl-2、Bax mRNA表達情況。取各組小鼠右側部分海馬組織，按照Trizol試劑盒操作提取總RNA，根據PrimeScriptTM RT Reagent Kit說明書操作逆轉錄得cDNA，置PCR儀中進行擴增。反應體系（共25 μL）：2×SYBR? Premix Ex TaqⅡ12.5 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各1 μL，DNA模板2 μL，ddH2O 8.5 μL。反應條件：95 ℃預變性3 min;95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，40次循環。以β-actin為內參，使用2-ΔΔCt法分析各組小鼠海馬組織中Bcl-2、Bax mRNA的表達水平。引物序列及產物長度見表1。

2.6 小鼠皮質中Bcl-2蛋白表達情況檢測

采用免疫熒光法檢測各組小鼠皮質中Bcl-2蛋白表達情況。各組隨機取3只小鼠左側大腦皮質置于4%多聚甲醛中固定24 h，常規脫水，石蠟包埋、切片、脫蠟至水后，于3%雙氧水中浸泡30 min，用檸檬酸鈉進行抗原修復，恢復室溫后用組化筆劃圈，磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.0）漂洗3次，每次5 min，隨后滴加正常山羊血清，室溫下孵育30 min，不漂洗直接滴加Bcl-2一抗（稀釋比例為1 ∶ 50），37 ℃孵育2 h;PBS漂洗3次，每次5 min;滴加生物素（稀釋比例為1 ∶ 100），室溫孵育30 min;滴加SABC-FITC（稀釋比例為1 ∶ 200），室溫避光孵育30 min;PBS漂洗3次，每次5 min。用4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）室溫避光孵育5 min，PBS漂洗3次，每次5 min，最后用防熒光淬滅封片，在熒光顯微鏡下觀察Bcl-2熒光強度并以陽性細胞百分比表示其蛋白表達水平。

2.7 小鼠海馬組織中Bcl-2和Bax蛋白表達情況檢測

采用Western blotting法檢測各組小鼠海馬組織中Bcl-2和Bax蛋白表達情況。各組隨機取3只小鼠右側海馬組織，稱定質量，加入現配的含蛋白酶抑制劑的蛋白裂解液，冰上勻漿促其充分裂解，于4 ℃下12 000 r/min離心10 min，取其上清液以BCA法檢測蛋白質濃度。取煮沸變性后的蛋白樣本40 μg，以10%聚丙烯酰胺凝膠進行電泳分離，濕法轉膜，再以5%牛血清白蛋白室溫封閉1 h，加入Bcl-2、Bax、GAPDH一抗（稀釋比例均為1 ∶ 1 000），于4 ℃孵育過夜，再用TBST溶液清洗;加入HRP標記的山羊抗兔IgG二抗于室溫下孵育1 h，再用TBST溶液清洗。經ECL化學發光液顯影和定影后采用Image J 8.0軟件分析，以目標蛋白與內標（GAPDH）的灰度值比值表示該蛋白的表達水平。

2.8 統計學方法

采用SPSS 17.0軟件對數據進行統計分析。所有數據均以x±s表示，兩兩比較采用t檢驗。P<0.05表示差異有統計學意義。

3 結果

3.1 小鼠學習記憶能力

與假手術組比較，模型組小鼠的避暗潛伏期顯著縮短，錯誤次數顯著增多（P<0.01）。與模型組比較，人參皂苷Rb3組、β-細辛醚組、聯合用藥組和陽性對照組小鼠的避暗潛伏期均顯著延長，錯誤次數均顯著減少（P<0.05或P<0.01）;而Akt抑制劑組小鼠的避暗潛伏期顯著縮短，錯誤次數顯著增多（P<0.05）。與人參皂苷Rb3組、β-細辛醚組、Akt抑制劑組比較，聯合用藥組小鼠的避暗潛伏期顯著延長，錯誤次數顯著減少（P<0.05或P<0.01）。各組小鼠學習記憶能力的變化情況見表2。

3.2 小鼠海馬組織中4-HNE、8-OHdG和ROS含量

與假手術組比較，模型組小鼠海馬組織中4-HNE、8-OHdG、ROS含量均顯著升高（P<0.01）。與模型組比較，人參皂苷Rb3組、β-細辛醚組、聯合用藥組和陽性對照組小鼠海馬組織中4-HNE、8-OHdG、ROS含量均顯著降低（P<0.01）;而Akt抑制劑組小鼠海馬組織中4-HNE、8-OHdG、ROS含量均顯著升高（P<0.05或P<0.01）。與人參皂苷Rb3組、β-細辛醚組、Akt抑制劑組比較，聯合用藥組小鼠海馬組織中4-HNE、8-OHdG、ROS含量均顯著降低（P<0.05或P<0.01）。各組小鼠海馬組織中4-HNE、8-OHdG、ROS含量的檢測結果見表3。

3.3 小鼠海馬組織中Bcl-2、Bax mRNA表達水平

與假手術組比較，模型組小鼠海馬組織中Bcl-2 mRNA表達水平顯著降低，Bax mRNA表達水平顯著升高（P<0.01）。與模型組比較，人參皂苷Rb3組、β-細辛醚組、聯合用藥組和陽性對照組小鼠海馬組織中Bcl-2 mRNA表達水平均顯著升高，Bax mRNA表達水平均顯著降低（P<0.01）;而Akt抑制劑組小鼠海馬組織中Bcl-2 mRNA表達水平顯著降低，Bax mRNA表達水平顯著升高（P<0.05）。與人參皂苷Rb3組、β-細辛醚組、Akt抑制劑組比較，聯合用藥組小鼠海馬組織中Bcl-2 mRNA表達水平顯著升高，Bax mRNA表達水平顯著降低（P<0.05或P<0.01）。各組小鼠海馬組織中Bcl-2、Bax mRNA表達水平的檢測結果見表4。

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（收稿日期：2020-03-26 修回日期：2020-07-02）

（編輯：鄒麗娟）