中藥血竭UPLC指紋圖譜與主成分分析研究

魏荷琳 肖隆祥 封家福 吳亮

【摘要】血揭是傳統中藥，有進口血竭和國產血揭之分，但兩者外觀相似。為了準確鑒定兩種血竭，以保證用藥安全，本研究采用超高效液相色譜（UPLC）方法對5批進口血竭樣品和5批國產血竭樣品進行了分析，計算共有峰的相對保留時間（RRT）和相對峰面積（EPA）。通過中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統對色譜數據進行相似度和主成分分析。結果證明，該UPLC方法具有良好的準確度、重現性和穩定性。進口血竭RRT的相對標準偏差（RSD）小于0.17%，國產血竭RRT的RSD小于0.06%，證明UPLC指紋圖譜方法準確。進口血竭EPA的RSD為32.78-70.43%，國產血竭RPA的RSD為22.30-60.31%，說明血竭的化學成分的含量差異較大。相似度分析的結果顯示，相同產地血竭的相似度較高，不同產地血竭的指紋圖譜有明顯差異;主成分分析能明顯區分兩種不同產地的血竭。本研究有助于不同來源血竭的準確鑒定，并為其質量評價與安全用藥提供實驗依據。

【關鍵詞】血竭 超高效液相色譜 指紋圖譜 主成分分析

血竭為傳統中醫活血化瘀名貴藥，《本草綱目》以“麒鱗竭”為其正名?！毒V目》云：“騏麟竭，木之脂液，如人之膏血，其味甘咸而走血;血竭除血痛，為活血之圣藥是矣?！??！吨袊幍洹罚?015年版，1部）記載，血竭具有活由定痛，化疲生肌之功效，內服主要用于心腹瘀痛，外用主治跌打損傷等病癥。目前，中國市售血竭有進口血竭和國產血竭兩種：進口血竭來源于棕櫚科黃藤屬植物麒麟竭（Dae-monorops draco，RDD）果實滲出的樹脂，國產血竭來源于百合科龍血樹屬植物劍葉龍血樹（Dracaena cochinchinensis，RDC）莖干提取的樹脂[。很顯然，進口血竭和國產血竭的植物來源不同，兩者化學組成是否具有差異，以及能否相互替代使用目前也還有諸多疑問。

中藥指紋圖譜技術是評價中藥優劣、鑒別真偽、區分物種和確保其一致性和穩定性的有效方法。中藥指紋圖譜技術的理論體系和方法是解析中藥的主導技術和實現中藥現代化的核心力量，該體系理論和技術的成熟及完善可為現代中藥創制提供強有力的理論和日支術支撐。隨著現代分析技術的發展，中藥指紋圖譜技術在研究中藥有效成分、控制中藥質量以及鑒別方面越來越成熟，已得到國際上廣泛的認可。

為明確區分兩種不同植物來源的血竭，探索其活性成分，本研究應用超高效液相色譜（UPLC）對進口血竭及國產血竭的指紋圖譜技術，通過中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統對色譜數據對進口血竭和國產血竭進行相似度評價和主成分分析。

1 材料與方法

1.1 藥材與試劑

5批進口血竭和5批國產血竭為市場收集，經樂山師范學院陳封政教授鑒定為麒麟竭Daemonorops draco果實以及劍葉龍血樹Dracaena cochinchinensis莖干的樹脂。

乙腈，甲醇和甲酸從Lab-scan （Bangkok，Thailand）購得，去離子水由Milli-Q水凈化系統（Millipore，Bedford，MA，USA）獲得。

1.2 儀器

1875HTAG TRU-SWEEP型超聲波清洗機（Crest，New York，USA）、5810離心機（Eppendorf，Hamburg，Germany）、粉碎機（RT-04，Fargo，Taiwan）和Adventurer電子秤（OHAUS，USA）。 Waters AcquityUPLC超高效液相色譜儀配備真空脫氣器、四級泵、自動取樣器、柱溫箱和紫外檢測器。EPOWER PRO色譜工作站用于數據采集和處理。BEH C18柱（2.1mm×100mm，1.8μm）用于樣品分離。

1.3 色譜條件

以0.1甲酸水溶液（A）和1%甲酸乙腈（B）為流動相，用UPLC梯度洗脫分離。流速為0.3mL/min;柱溫設定為40oC，檢測波民為280nm，進樣量為1μL。梯度洗脫條件如下：0-8min，15-20% B;8-30min，20-68% B;30-30.5min，100% B;30.5-35min，100% B;35-35.5min，100-15% B;35.5-40min，15% B。

1.4 供試品溶液的制備

粉碎10批血竭樣品，將粉末通過20目篩，在室溫下真空干燥至恒重。取樣品0.1g，精密稱定置25mL離心管中，精密加入100%甲醇10mL，擰緊瓶蓋混勻，在室溫下超聲萃?。üβ?70kw，頻率40k Hz）30分鐘，放冷，轉移至離心機，于3500r/min條件下離心10min，冷卻后，將上清液過濾轉移到25mL容量瓶中，藥渣再加10mL100%甲醇按上述重復萃取1次，兩次得到的上清液用100%甲醇定容至25mL，搖勻靜置30min。提取液用孔徑為0.22μm的濾膜過濾后，進行UPLC分析。

1.5 方法學考察

1.5.1 精密度試驗

分別取進口血竭和國產血竭供試品各一批，按“1.4”項下方法制備供試品溶液，按“1.3”項下色譜條件進樣分析6次，記錄色譜圖，將數據導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012版）”，以各自活險成分為參照峰，計算各共有峰陽對峰面積的RSD和相對保留時間的RSD。

1.5.2 重復性試驗

分別取進口血竭和國產血竭供試品各一批，按“1.4”項下方法平行制備6份供試品溶液，按“1.3”項下色譜條件進樣分析，記錄色譜圖，以各自活勝成分為參照峰，計算各共有峰相對峰面積的RSD和相對保留時間的RSD。

1.5.3 穩定性試驗

分別取進口血竭和國產血竭供試品各一批，按“1.4”項下方法制備供試品溶液，在0、2、4、8、16、24 h按“1.3”項下色譜條件進樣分析，記錄色譜圖，以各自活性成分為參照峰，計算各共有峰相對峰面積的RSD和相對保留時間的RSDo

1.6 指紋圖譜建立及相似度評價

1.6.1 共有峰及參照峰的選擇

根據5批進口血竭和5批國產血竭的UPLC色譜圖，進口血竭發現9個共有峰，選擇，號峰作為參照峰。國產血竭發現7個共有峰，選擇7號峰作為參照峰，構建進口血竭和國產血竭UPLC色譜圖特征指紋圖譜，以此作為它們鑒別的依據。

1.6.2 相似度計算及對照指紋圖譜的生成

經UPLC檢測得到5批進口血竭和5批國產血竭指紋圖譜，見圖1。將5批進口血竭和5批國產血竭樣品指紋圖譜分別導入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統，分別設置樣品RDD-1、RDC-1圖譜為參照圖譜，對照圖譜生成方法采用中位數法，時間窗寬度為0.1，自動匹配，生成對照指紋圖譜，與5批進口血竭和5批國產血竭圖譜進行比較，進行相似度計算。

1.7 聚類分析和主成分分析

將標準化的數據聚類分析和主成分分析前將。選擇第一和第二個主分量繪制主成分分析的散點圖。聚類分析采用組間平均連接方法，用平方歐式距離來測量觀測距離矩陣。使用SPSS軟件（IBM SPSS Statistics 25，Armonk，USA！對所有樣本進行聚類分析和主成分分析。

2 結果

2.1 檢測波長的選擇

紫外波長掃描用光電二極管陣列（PDA）探測器在280nm波長下對目標峰具有較高的信噪比，選擇其作為檢測波長。

2.2 流動相的選擇

本研究采用0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸水溶液作為流動相，具有良好的分辨率、適中的停留時間和平滑的基線。

2.3 精密度、重復性和穩定性

運用穩定性、精密度和重復性試驗，對本方法的進行綜合驗證，結果為表1和表2。通過在儀器中用相同樣品注射六次來評估該方法的精確度。相對保留時間RRT為單個峰的保留時間與參考峰的保留時間之比。相對峰面積（RPA）為單個峰的保留峰面積與參考峰的保留峰面積之比。進口血竭RRT的RSD小于0.10%;國產血竭RRT的RSD小于0.02%。該方法可認為是可靠的。對同一個樣品進行提取6次，來評估該方法的重復性。進口血竭RRT的RSD值小于0.09%，國產血竭RR丁的RSD值分別為小于0.07%，表明該方法具有較高的重現性。在24小時穩定性試驗中，將相同的樣品分別在0、2、4、8、16和24小時進行分析。進口血竭RRT的RSD值小于0.08%，國產血竭RRT的RSD值小于0.17%。結果表明，樣品溶液在24小時內穩定。這些數據表明UPLC方法適用于血竭的定性和定量分析。

2.4 相似度分析

采用所建立的方法對10批血竭樣品進行了分析，得到了U-PLC指紋圖譜。在所有分析的進口血竭樣品中發現9個共有峰，國產血竭樣品中發現7個共有峰。用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012年版）分別計算進口血竭9個共有峰和國產血竭7個共有峰的相對保留時間（RRT）和相對保留面積（RPA），結果總結在表3和表4。進口血竭RRT的RSD值略微波動在0.04-0.17%的范圍內，RSD值小于0.17%;而國產血竭RRT的RSD值略微波動在0.02-0.06%的范圍，RSD值小于0.06%，證明了兩者指紋圖譜分析的準確性。進口血竭RPA的RSD值在32.78-79.43%范圍，國產血竭RPA的RSD值在22.39-66.31%范圍，兩者波動均較大，說明不同產地的進口血竭樣品里面的化學成分含量相差較大，國產血喝亦然。

圖1為10批血竭樣品的指紋圖譜，表5是進口血竭和國產血竭的相似度分析。進口血竭5個樣本的相似度為0.919-0.987范圍內，國產血竭5個樣本的相似度為0.886-0.984范圍內，表明各批次進口血竭和國產血竭質量相對穩定。

2.5 主成分分析

將相似度評價系統計算的共有峰的相對峰面積代入主成分分析，進口血竭樣品和國產血竭樣品通過散點圖進行區分（圖2）。RDD-1、2、5和RDD-3、4各自分布得比較相近，而RDC-1、2、5和RDC-3、4各自分布得比較靠近，原因可能是不同來源的同種血竭的成分不同而導致的。

而且進口血竭主要分布在散點圖的左上相限區域（RDD-1～RDD-5），國產血竭主要分布在右下相限區域（RDC-1～RDC-5），因此可以明顯得出進口血蝎和國產血竭的成分具有明顯差異，分成兩組。

3 討論

5批進口血竭樣品和5批國產血竭樣品的相似度都比較相近，所以能分別體現出5批血竭是同種血竭。

而進口血竭和國產血竭的RRT的RSD值都比較小，能表現不同批次的同種血竭具有大部分相同的化學成分，它們的指紋圖譜均比較準確。進口血竭和國產血竭的RPA的RSD值分別的差異比較大，所以不同來源的同種血竭含有化學成分的含量明顯不同。因此，本研究提出的指紋圖譜方法適用于兩種藥物的種間鑒定和種內一致性評價。進口血竭和國產血竭具有的藥理作用有相同也有不同，而且對于相同的藥理作用藥效也有差異，況且它們的外觀相近，難以鑒別，所以開發一種中藥指紋圖譜方法來鑒定這兩種藥物不可或缺。中藥指紋圖譜技術是符合中醫理論及現狀的較好的質量控制技術，它以指標性成份峰作為標記，結臺非指標成份進行比對，用來綜合評價藥物質量，既符合中醫藥理論的整體觀點，也滿足了對中藥質量的可控、保證其療效的要求。因此，中藥指紋圖譜不僅是一種中藥質量控制模式和技術，更可以發展成為一種采用各種指紋圖語來進行中藥理論（復雜系統）和新藥開發的研究體系和研究模式。

本研究UPLC指紋圖譜方法的建立為進口血竭和國產血竭的質量控制奠定了堅實的基礎，為血竭質量評價和標準化提供有價值的參考。

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基金項目：本課題為四川省科技計劃項目應用基礎研究項目（2018JC0445），藥食同源植物資源開發四川省高校重點實驗室開放基金重點項目（10Y201810），樂山市科技局產學研合作項目（15CXY0012）和2018年樂山職業技術學院院級課題（KY2018005）階段性成果。

作者簡介：魏荷琳（1987.01-），女，漢族，講師，碩士研究生，現從事中藥相關專業教學、科研工作。