重組大腸桿菌產Indigoidine的發酵優化

孫菁蘭 王華敏 才恒 王麗娟 唐巧巧 劉之毅 高強

摘 要：Indigoidine是一種無毒的微生物天然藍色素。本研究利用重組大腸桿菌DH5α/pBT2-ET-idgS-sfp發酵生產Indigoidine，通過單因素實驗優化發酵培養基中的復合氮源比例及含量和兩階段控制溫度策略中的變溫點。結果表明：優化后的發酵培養基（g·L-1）：胰蛋白胨5，酵母浸粉10，氯化鈉10，3-（N-嗎啉）丙磺酸5。優化后的變溫點為37 ℃培養7 h時變溫至28 ℃，Indigoidine產量增加了3倍，從初始的0.35 g·L-1提高至1.4 g·L-1。

關鍵詞：Indigoidine;培養基優化;變溫發酵;大腸桿菌

Abstract：Indigoidine is a nontoxic microbial blue pigment. In this work， indigoidine was produced by fermentation of recombinant E. coli DH5α/pBT2-ET-idgS-sfp. Single factor experiment was employed to optimize the proportion and content of compound nitrogen source in fermentation medium and the variable temperature point of two-stage temperature control strategy. The optimized fermentation medium was as following （g·L-1）： tryptone 5， yeast extract 10， NaCl 10， MOPS 5. The optimal culture time at 37 ℃ was 7 h and then the temperature change to 28 ℃. Production of indigoidine from the initial 0.35 g·L-1 increased up to 3-fold at 1.4 g·L-1.

Key words：Indigoidine; Medium optimization; Variable-temperature fermentation; Escherichia coli

中圖分類號：TQ920.6

Indigoidine是一種來自微生物的天然藍色素，有近70多年的發現歷史，因其無毒、色澤明亮類似于靛藍，可作為新型天然藍色素及染料應用于食品、醫藥、染整等行業，已有將其用于蛋白質類纖維織物的染色報道[1]。在分子生物學研究中，Indigoidine合成酶基因可作為標記基因構建篩選體系[2-3]，近年來關于Indigoidine及其合成酶的應用研究也開始得到了重視[4]。

Indigoidine最早從植物病原菌歐文氏桿菌（Erwinia sp.）

中發現，近年來在鏈霉菌中發現其合成酶基因以沉默基因的形式存在[5]，經其他宿主如大腸桿菌可異源表達并發酵生產Indigoidine[6-7]。Indigoidine合成酶（Indigoidine synthetase）是非核糖體肽合成酶，經過4-磷酸泛酰巰基乙胺基轉移酶活化，將微生物體內的2分子谷氨酰胺合成為1分子Indigoidine[8]。該色素為非水溶性藍色素，具有抗菌性和氧化還原性，能溶解于少數的幾種有機溶劑，如DMF、DMSO、四氫呋喃、吡啶、N-甲基吡咯烷酮等[9]，結構見圖1（a），其

N，N-二甲基甲酰胺溶液在λ=590 nm處有最大吸收峰[2]，可被連二亞硫酸鈉還原為隱色體形式Lecoindigoidine[3，9]，結構見圖1（b）。

植物作為天然色素的生產者，雖然來源廣泛，但受自然環境影響大、含量低、生長周期緩慢、加工成本高，因此植物源天然藍色素價格偏高[10]。而利用微生物發酵生產天然藍色素可避免上述問題，易于工業化生產。目前如利用三孢布拉霉生產的β-胡蘿卜素和番茄紅素，紅曲霉固態發酵生產的紅曲色素[11]已作為食品級微生物色素應用于食品行業。利用微生物法發酵生產天然藍色素，在一定程度上可以緩解市場上天然藍色素稀缺的問題，本文在成功表達idgS和sfp基因構建產Indigoidine的重組大腸桿菌工程菌的基礎上，對其發酵生產Indigoidine的發酵培養基與變溫點進行了研究。

1 材料與方法

1.1 菌株

本實驗室構建并保藏的一株含有Indigoidine合成酶基因（idgS）與4-磷酸泛酰巰基乙胺基轉移酶基因（sfp）的重組大腸桿菌工程菌E.coli DH5α/pBT2-ET-idgS-sfp，其中攜帶idgS和sfp基因的pCIMt002質粒，由中國科學院微生物研究所陳義華研究員饋贈。

1.2 培養基

LB培養基（g·L-1）：胰蛋白胨10，酵母浸粉5，氯化鈉10，1×105 Pa滅菌20 min;固體培養基含2%瓊脂。

基礎發酵培養基（g·L-1）：胰蛋白胨10，酵母浸粉5，氯化鈉10，3-（N-嗎啉）丙磺酸5，pH 7.0，1×105 Pa滅菌20 min。

1.3 試劑與儀器

酵母浸粉、胰蛋白胨（生化級，英國OXOID品牌）;N，N-二甲基甲酰胺（DMF，分析純，天津市津東天正精細化學試劑廠）;TU-1810型紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）;SL 8型高速冷凍離心機[賽默飛世爾（中國）科技公司];ZWYR-D2403型恒溫培養振蕩器（上海智城分析儀器制造有限公司）。

1.4 方法

1.4.1 種子培養

將菌株E.coli DH5α/pBT2-ET-idgS-sfp經三區劃線于含100 mg·L-1氨芐青霉素的LB固體培養基活化，37 ℃過夜培養長出白色單菌落，然后變溫至28 ℃培養6～8 h后，白色單菌落變為藍色，挑取藍色較深的單菌落于含100 mg·L-1氨芐青霉素的LB液體培養基中，37 ℃、180 r·min-1培養10～12 h，即為種子液。

1.4.2 發酵培養

以1%（V/V）接種量將種子液轉接到裝有50 mL發酵培養基的250 mL三角瓶中，發酵過程前期37 ℃培養4～10 h，后期28 ℃培養12 h，整個發酵過程搖床轉速為180 r·min-1。

1.4.3 發酵優化

培養基氮源優化：優化基礎培養基中胰蛋白胨與酵母浸粉的比例和含量;發酵變溫點優化：選取產量較高的不同氮源比例的培養基，發酵過程前期37 ℃培養，培養時間分別選擇4、6、7、8 h和10 h，后期

28 ℃培養12 h。

1.4.4 Indigoidine產量測定

（1）Indigoidine標準曲線繪制。發酵液經離心取沉淀，用蒸餾水、甲醇、乙酸乙酯、正己烷依次清洗2次，將沉淀中的色素超聲溶解于DMF中，通過旋轉蒸發、冷凍干燥的方法獲取Indigoidine粗品。將色素粗品溶解

于DMF，配成濃度為1 g·L-1的母液，梯度稀釋為0.025、0.050、0.100、0.200、0.300、0.400 g·L-1和0.500 g·L-1的色素溶液，在λ=590 nm處測量色素溶液吸光度值，重復3次（下同），制作Indigoidine標準曲線（見圖2）。

（2）Indigoidine產量計算。取發酵液50 mL于離心管中，12 000 r·min-1離心20 min，棄上清，用蒸餾水清洗沉淀2次。向沉淀中加入3 mL N，N-二甲基甲酰胺（DMF），超聲1 h，12 000 r·min-1離心20 min，取上清色素溶液。在λ=590 nm處測量色素溶液吸光度值，若OD590大于0.8，則稀釋至0.2～0.8 g·L-1范圍內測定，根據上述標準曲線換算得出Indigoidine產量。

2 結果與分析

2.1 培養基氮源含量優化

按照1.4.2的方法，發酵前期37 ℃培養4 h后變溫至28 ℃培養12 h，測定發酵液中Indigoidine的產量。由圖3可知，基礎發酵培養基的產量為0.35 g·L-1，當胰蛋白胨（g）：酵母浸粉（g）為5∶10、0∶15時產量最高分別為0.55 g·L-1、0.57g·L-1，其次是胰蛋白胨（g）：酵母浸粉（g）為5∶15的產量為0.44 g·L-1，上述3個比例的菌體濃度與色素產量都大于對照。

2.2 發酵變溫點優化

由于2.1中37 ℃培養4 h后變溫，未能真正反映菌體產色素能力的真實水平。因此下一步實驗選擇上述3個產量較高的復合氮源比例，比較其在多個變溫點下的Indigoidine產量。由圖4可知，發酵培養基中同一比例的蛋白胨與酵母浸粉在不同變溫點下產量差異顯著。變溫點為4 h時，蛋白胨（g）：酵母浸粉（g）為0∶15時產量最高為0.56 g·L-1，但在6～8 h時，蛋白胨（g）：酵母浸粉（g）為5∶10時，色素產量最大，其中變溫點為7 h時，產量最高為1.4 g·L-1。在各變溫點下，蛋白胨（g）：酵母浸粉（g）為5∶15的色素產量較5∶10低，可能是菌體濃度過高，發酵液相對黏稠，溶氧下降的原因。因此，確定發酵培養基中復合氮源的比例及含量為胰蛋白胨（g）：酵母浸粉（g）=5∶10，變溫點為37 ℃培養7 h后變溫至28 ℃。

3 結論

通過單因素實驗對初始發酵培養基的復合氮源比例及含量和變溫發酵的變溫點進行優化，得到最終發酵培養基組成（g·L-1）：胰蛋白胨5，酵母浸粉10，氯化鈉10，3-（N-嗎啉）丙磺酸5。最終發酵條件：初始pH 7.0、裝液量50 mL/250 mL、37 ℃培養7 h時變溫至28 ℃培養12 h，發酵全程搖床轉速為180 r·min-1。

采用兩階段控制溫度策略，前期利于菌體生長，后期滿足菌體產素需求，發酵周期較短。優化后的Indigoidine

產量增加了3倍，達到了1.4 g·L-1。

致謝：感謝中國科學院微生物研究所陳義華研究員饋贈含有idgS和sfp基因的pCIMt002質粒、感謝天津科技大學生物工程學院謝周杰副研究員在Indigoidine

相關研究經驗的指導，感謝本實驗室唐巧巧同學在重組大腸桿菌工程菌E. coli DH5α/pBT2-ET-idgS-sfp構建方面的工作。

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