蒙藥制劑烏力吉-18微生物限度檢查方法適用性試驗

杜美娜 劉建明 劉楊

摘要：目的：建立蒙藥制劑烏力吉-18的微生物限度檢驗方法。方法：按《中國藥典》2015年版四部非無菌產品微生物限度檢查法：控制菌檢查法進行適用性試驗。結果：供試品5種試驗菌回收比在0.5～2之間，控制菌均能正常檢出。

關鍵詞：烏力吉-18;微生物限度;適用性試驗

本文參考相關文獻，根據蒙藥制劑中成分的抑菌作用強度不同，采用了平皿法建立烏力吉-18相應的微生物限度檢查方法，經方法適用性試驗證實該方法簡易有效。

一、實驗材料

1.樣品名稱

烏力吉-18，批號：20180502、20181018、20190410，具由新疆維吾爾自治區博爾塔拉蒙古自治州蒙醫醫院生產。

2.菌種

枯草芽孢桿菌[CMCC（B）63501]、金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26003]、銅綠假單胞菌[CMCC（B）10104]、白色念珠菌[CMCC（F）98001]、黑曲霉菌[CMCC（F）98003]、沙門氏菌[CMCC（B）50094]以上培養基和菌種均由中國食品藥品檢定研究院提供工作菌株為第3代。

二、菌液及供試液制備

1.菌液制備

取經35℃培養18-24小時的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌胰酪大豆胨液體培養物，用0.9%無菌氯化鈉溶液制成含菌數不大于10000cfu/ml的菌懸液;取經35℃培養18-24小時的大腸艾希氏菌、銅綠假單胞菌、沙門氏菌胰酪大豆胨液體培養物，用0.9%無菌氯化鈉溶液制成含菌數不大于100cfu/ml的菌懸液;取經25℃培養2-3天的白色念珠菌沙氏葡萄糖液體培養物，用0.9%無菌氯化鈉溶液制成含菌數不大于10000cfu/ml的菌懸液;取經25℃培養5-7天黑曲霉的新鮮培養物加入3～5ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫，用含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液制成含菌數不大于10000cfu/ml的孢子懸液。

2.供試液制備

取樣品10g，加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml，混勻，制成1：10的供試液;取1：10的供試液10ml，加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至50ml，制成1：50的供試液。

三、需氧菌總數和霉菌及酵母菌總數計數檢查方法適用性

供試液分別加入上述5種代表性實驗菌株，再加15-20ml規定的瓊脂培養基待凝固后，置規定溫度培養24-72小時，觀察結果，平板計數，測定回收比值。

試驗組：取上述1：10供試液10ml加入0.1ml試驗菌，混勻，取含菌供試液1ml分別注入無菌平皿中，立即相應的瓊脂培養基，每株試驗菌平行制備2個平皿，按平皿法測定其菌數。需氧菌總數計數的試驗菌株為金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌，相應的瓊脂培養基為胰酪大豆胨瓊脂培養基;霉菌和酵母菌總數計數的試驗菌株為沙氏葡萄糖瓊脂培養基。供試品對照組：取制備好的供試液，不加菌液，按試驗組計數方法，測定供試品本底菌數。菌液對照組：取pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液替代供試液，按試驗組操作加入試驗菌液并進行測定其菌數。結果如下：

四、控制菌檢查方法適用性

1.適用性試驗

大腸艾希氏菌，取1：10的供試液10ml，加入大腸埃希菌菌液1ml，加入100ml胰酪大豆胨液體培養基，混勻，置35℃培養18小時，取上述培養物1ml接種至100ml麥康凱液體培養基中，42℃培養24小時。取麥康凱液體培養物劃線接種于麥康凱瓊脂培養基平板上35℃培養18小時，麥康凱瓊脂培養基應能檢出大腸艾希氏菌反應特征。

耐膽鹽革蘭陰性菌，取樣品1：10供試液100ml，置25℃培養2小時，取上述培養物10ml，加大腸埃希菌菌液、銅綠假單胞菌菌液各1ml，搖勻，接種至100ml腸道菌增菌液體培養基中，35℃培養24小時后，分別劃線接種于紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂平板上，35℃培養18小時，紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂平板上應能檢出耐膽鹽革蘭陰性菌的反應特征。

沙門氏菌，取供試品10g，加入200ml胰酪大豆胨液體培養基，沙門氏菌菌液1ml混勻，35℃培養24小時。取的上述培養物1ml，接種至10mlRV沙門增菌液體培養基中。35℃培養18小時，取少量RV沙門氏菌增菌液體培養物劃線接種于木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養基平板上，35℃培養18小時，木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養基平板上應能檢出沙門氏菌的反應特征。

2.上述結果表明

本品的控制菌檢查方法為：大腸艾希氏菌，取樣品1：10供試液10ml接種至胰酪大豆胨液體培養基中，培養基用量100ml;耐膽鹽革蘭陰性菌，取25℃培養2小時樣品1：10供試液10ml，接種至腸道菌增菌液體培養基，培養基用量100ml。

五、結論

按《中國藥典》2015年版四部微生物限度檢查法、控制菌檢查法進行三次獨立適用性試驗，5種試驗菌回收比在0.5～2之間，控制菌均能正常檢出。

參考文獻：

[1]中國藥典通則四部[M].北京：醫藥衛生出版社.

[2]蒙藥烏力吉-18丸的藥理與臨床研究概況[J].內蒙古民族大學學報（自然科學版）.

課題名稱：論文來自課題《博州蒙藥制劑微生物限度檢驗方法的研究》