不同亞型胃食管反流病患者呼氣中揮發性標志物的篩選

阿麗葉古麗·艾皮熱阿卜杜喀迪爾 買買提·依斯熱依力 王儉 克力木·阿不都熱依木，

胃食管反流?。╣astroesophageal reflux disease，GERD）是胃內容物反流入食管引起不適癥狀和（或）并發癥的一種慢性消化系統疾病，燒心和反酸是其典型癥狀，也可以表現為非典型的食管外癥狀，如非心源性胸痛、慢性咳嗽、哮喘或咽喉炎等[1]。因此大部分患者早期選擇去心內科、呼吸科或耳鼻喉科等科室就診，無法早期明確診斷，延誤治療時機。目前，GERD的診斷是要結合臨床癥狀、抑酸反應、上消化道內鏡檢查、食管pH值監測及上消化道造影等客觀檢查結果來綜合診斷，此綜合診斷容易受到主觀因素的影響和具有侵入性，推廣具有一定的局限性，此外，醫療費用也較高[2]。因此，大部分患者的配合度不高。目前，在臨床迫切需要研究一種簡便、快捷、無創、無痛、經濟、省時的快速篩查方法。

人體呼氣分析是一種簡單、無創、無痛的新興技術，可用于疾病診斷，療效評估，并可提供潛在的疾病發病機制線索。人體呼出氣體中有3 000余種揮發性有機化合物（volatile organic compounds，VOCs），它們直接或間接地與機體病理生理過程有關，這提供了窺視人體新陳代謝的“窗口”。近年來，隨著氣相色譜-質譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）等代謝組學分析平臺的靈敏度、分離能力及穩定性提高，呼氣分析在臨床疾病診斷中得到廣泛應用[3-8]。因此，本研究利用固相微萃?。╯olid phase micro-extraction，SPME）聯用GC-MS技術分析GERD及健康對照人群的呼氣成分，篩查GERD中的差異性VOCs，并進一步評價其對GERD診斷的價值，為GERD的早期診斷提供新的方法。

對象與方法

一、一般資料

收集2019年11月至2020年10于新疆維吾爾自治區人民醫院住院治療的97例GERD患者及29例健康體檢的人群作為研究對象。完整地記錄每位研究對象的胃鏡結果，24 h pH監測結果，年齡、性別、身高、體質量、體質量指數（body mass index，BMI）等相關臨床檢查結果及資料。所有研究對象簽署知情同意書。本研究已通過我院倫理委員會批準（批號為2018D01C119）。

二、納入與排除標準

1.GERD納入標準：內鏡結果不正常；有酸反流。

2.非GERD納入標準：內鏡結果正常，食管24 h pH監測結果為生理性酸反流。

3.排除標準：賁門失弛緩癥；孕婦或哺乳期婦女；有嚴重的胃食管器質性病變；有嚴重的心肺疾??；糖尿??；腎衰竭尿毒癥期或患有可引起GERD相關癥狀的其他疾??；拒絕簽知情同意書者。

三、分組方法

29例健康體檢的人群分為對照組。97例GERD患者分為糜爛性食管炎伴病理性酸反流（erosive esophagitis+24 h pH+，EE+24 h pH+）、糜爛性食管炎伴生理性酸反流（erosive esophagitis+24 h pH-，EE+24 h pH-）、非糜爛性反流?。╪onerosive reflux disease，NERD）、Barrett食管（Barrett's esophagus，BE）

1.EE+24 h pH+組：內鏡結果屬于EE，包括LA-A～D級[9]，食管24 h pH監測結果為病理性酸反流。

2.EE+24 h pH-組：內鏡結果為EE，食管24 h pH監測結果為生理性酸反流。

3.NERD組：內鏡結果為非糜爛性反流?。╪on-erosive reflux disease，NERD），食管24 h pH監測結果為病理性酸反流。

4.對照組：內鏡結果正常，食管24h pH監測結果為生理性酸反流。BE組：內鏡結果屬于Barrett食管（Barrett's esophagus，BE），BE是內鏡下可見的食管柱狀上皮化生，病理結果為一種特殊的腸化生上皮[10]。賁門失弛緩癥、孕婦或哺乳期婦女、有嚴重的胃食管器質性病變、有嚴重的心肺疾病，糖尿病，腎衰竭尿毒癥期或患有可引起GERD相關癥狀的其他疾病、拒絕簽知情同意書者均排除。

四、研究方法

采用無菌鋁箔復合膜呼氣采集袋（東莞市康迪包裝公司）收集呼氣標本，受試者當天零點開始禁食水，晨起后到收集向集氣袋吹氣直至氣袋充滿為止（勿深呼氣，勿斷續吐氣）。SPME萃取頭（PDMS/DVB 65 μm PK3，北京康林科技有限責任公司）每次使用前加熱預處理，在250℃條件下加熱30 min以除去殘留物質；在室溫萃取20 min，萃取過程中標本放入60℃的水浴加熱；立即接到GCMS聯用儀器（美國Agilent 7890-5975C）進樣本；色譜條件為 Agilent HP-5MS（30 m×250 μm×0.25 μm，北京飛美斯分析科技有限公司），高純氦氣（純度：99.999%）載氣，柱流量1.0 ml/min。程序升溫條件初始柱溫40℃，保留2min，以3℃/min升溫至250℃，維持10 min。進樣口溫度為250℃，不分流。質譜條件為電離方式EI，碰撞能量為70 ev，離子源溫度230℃，全掃描（30～800 m/z）。將原始數據導入MPP軟件（Agilent G3835AA MassHunter Mass Profiler Professional）進行分析。定量分析方法使用目前應用較廣泛的內標比值法，統一將CO2的峰面積作為基數，把其他VOCs的峰面積定量化（I'm=Im/ICO2×109）。Im代表某VOCs的峰面積，I'm為歸一化后的相對定量數據[11]。

五、評價指標

1.主成份分析（principal component analysis，PCA）分析：用于不同亞型GERD與非GERD組別間的區分。

2.診斷效果評價采用受試者工作特征（ROC）曲線分析：測出指標曲線下面積，確定CUT-OFF值和約登指數，得出診斷指標的靈敏度和特異度。

六、統計學方法

應用SPSS 23.0軟件對相關數據進行統計描述和分析。計量資料采用均數±標準差（±s）表示，組間比較用Mann-Whitney U檢驗；計數資料用例數表示，組間比較用χ2檢驗或Mann-Whitney U檢驗；靈敏度和特異度用于檢驗診斷模型價值。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、納入本研究的一般臨床資料

本研究共納入126例研究對象，其中EE+24 h pH+組24例，EE+24 h pH-組28例，NERD組36例，對照組29例，BE組9例。GERD不同亞型組患者體重、BMI與對照比較差異無統計學意義（P＞0.05），（見表1）。

表1 各組基礎資料與對照組比較

二、GC-MS結果

1.PCA分析：從各組數據的PCA得分圖可以看出，EE+24 h pH+組、EE+24 h pH-組、NERD組、BE組與對照組之間分離較好，樣本全部處于95%置信區間內（見圖1）。

圖1 各組樣本PCA得分圖

2.GERD-組與對照組間的差異性代謝物：MPP軟件分析GERD組與對照組所有樣品，共檢測到184個化合物。其中，兩組間有差異的化合物有4個。將化合物帶回Masshunter軟件，篩選出峰形較好、差異顯著的化合物，利用NIST14（http://webbook.nist.gov/chemistry）質譜數據庫對可能的標記物做鑒定，匹配度大于90%的鑒定結果較為可信（見表2）。

表2 GERD差異代謝物鑒別結果

3.不同亞型GERD組與對照組間的差異性代謝物：MPP軟件分析EE+24 h pH+組與對照組所有樣品，共檢測到164個化合物。組間比較用Mann-Whitney U檢驗，找到差異有統計學意義的差異化合物4個（P＜0.05）。EE+24 h pH-組與對照組樣品共檢測出161個化合物，其中差異性化合物有3個。NERD組與對照組樣本共檢測到153個化合物，其中有差異化合物4個。BE組與對照組樣本共檢測到126個化合物，但無差異性化合物。將所有化合物帶回Masshunter軟件，篩選出峰形較好、差異顯著的化合物，利用NIST14質譜數據庫對可能的標記物做鑒定，匹配度大于90%的鑒定結果較為可信（見表3）。

表3 不同亞型GERD的差異代謝物鑒別結果

三、驗證差異性VOCs對GERD診斷的可行性

本研究在GERD中鑒定出了正十二烷、正十六烷、5-甲基-十一烷、5-乙基癸烷等4種差異性VOCs。通過受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic curve，ROC）曲線評價它們用于診斷GERD的價值。5-乙基癸烷診斷GERD的靈敏度可達80.9%，特異度可達47.61%，曲線下面積0.603，無統計學意義（P＞0.05）。5-甲基-十一烷診斷GERD的靈敏度可達88.40%，特異度可達48.4%；正十二烷和正十六烷診斷GERD的靈敏度可達91.20%，特異度可達53.86%（見表4和圖2）。因各GERD亞型組樣本量較少，無法進一步評估其VOCs在診斷GERD亞型中的作用，需要大樣本研究來進一步評估。

表4 正十二烷、正十六烷、5-甲基十一烷、5-乙基十一烷的診斷價值

圖2 正十二烷、正十六烷、5-甲基十一烷、5-乙基十一烷的ROC曲線

討 論

GERD是由功能性或器質性因素導致胃食管連接處抗反流屏障的減弱或破壞，導致的食管暴露于酸性反流物中，并對食管造成器質性損傷的疾病。這不但影響患者的日常生活質量，嚴重時還會引發包括BE，乃至食管腺癌、賁門癌等多種惡性消化系統疾病[1，12-14]。GERD根據內鏡和組織病理學表現可分為NERD、EE及BE三種不同表型，其中，NERD最常見，占約60～70%，其次為EE（30%）和BE（6%～12%）[2]。GERD診斷一般是結合臨床癥狀、抑酸反應、內鏡檢查、食管pH監測以及上消化道造影等客觀檢查結果來綜合診斷。其中，GERD調查問卷法是患者對典型癥狀“反酸、燒心”的自我描述，結果易受到主觀因素的影響。胃鏡作為進一步明確診斷GERD的傳統檢查手段，雖然特異度較高，但是敏感性較低，特別是對NERD患者診斷存在一定的局限性，同時胃鏡是侵入性檢查，易引起患者不適。食管24 h pH監測雖然能補充內鏡檢查的缺點等，但是仍屬于侵襲性檢查，需堅持24 h，患者的配合度不高，而且醫療費用較高[2]。因此，臨床迫切需要研究一種簡便、快捷、無創、無痛、經濟、省時的快速篩查方法。

本研究利用GC-MS技術檢測GERD及健康對照人群呼氣樣本，共鑒定出正十二烷、正十六烷、5-甲基-十一烷、5-乙基癸烷等4種差異性VOCs。在不同亞型GERD患者中，EE+24 h pH+中鑒定出正十四烷、正十六烷、5-甲基-十一烷及5-丙基壬烷等4種差異性代謝物，其中正十六烷和5-甲基-十一烷與GERD組結果重疊，而正十四烷和5-丙基壬烷在此組中特異的差異性VOCs，因此初步可以認為正十四烷和5-丙基壬烷為EE+24 h pH+的標志性代謝物。EE+24 h pH-鑒定出5-甲基-十一烷、5-丙基壬烷及5-乙基癸烷等3種差異性代謝物，其中5-甲基-十一烷和5-丙基壬烷與EE+24 h pH+患者呼氣結果一致，而5-乙基癸烷在EE+24 h pH-中獨有，因此初步可以認定5-乙基癸烷是EE+24 h pH-的標志性VOCs。說明5-甲基-十一烷和5-丙基壬烷無論有無pH+，在EE中均表現出差異性，故5-甲基-十一烷和5-丙基壬烷可能是EE的標志性VOCs。在NERD中共鑒定出了鄰三氟甲基苯甲酸、2-甲基-十一烷及正十二烷等3種差異性VOCs。其中正十二烷跟GERD組與對照組結果一致。因此，NERD可能的標志性VOCs可能是三氟甲基苯甲酸和2-甲基-十一烷。BE未篩選出差異性的VOCs，可能是與樣本量有關。

人體產生的內源性VOCs主要包括烷烴類、烯醇類、芳香族類等，這與體內腸道菌群改變有關[15]。在GERD中檢測的特異性VOCs的病理生理機制目前尚未明確?？赡芘cGERD患者體內微生物代謝的改變有關，因此它也可能是GERD中VOCs產生的機制之一。

本研究對篩選出來的4種VOCs作ROC曲線，評價這4種VOCs的診斷價值，結果顯示5-乙基癸烷診斷GERD的靈敏度和特異度無統計學意義，因此5-乙基癸烷在診斷GERD中無參考價值。5-甲基-十一烷、正十六烷這2種標志性VOCs診斷GERD的敏感性良好，但是它們特異度均較低，曲線下面積在0.6～0.7之間，診斷價值較低。只有正十二烷靈敏度較高，曲線下面積大于0.7，參考價值中等，因此5-甲基-十一烷，正十二烷和正十六烷可作為早期篩選GERD及健康人群的標志性VOCs，其中正十二烷可能作為早期診斷GERD的新參考指標。